Una guida per<em&gt; In vivo</em&gt; Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

Riepilogo

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Abstract

Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l'ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi ^1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata "PINP", o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un'alternativa economica e accessibile per l'imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l'ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.

Introduzione

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee.

1. Chirurgia acuta

1. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1).
   NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo livelli di espressione simili si ottengono.
2. Prima di iniziare l'intervento, in modo che le esibizioni di animali non risposta ad un pizzico punta dolce. Ri-somministrare anestetici durante l'esperimento come necessario per mantenere questa profondità dell'anestesia. Se si utilizza anestetici iniettabili, eventualmente impiantare un catetere ip per preparazioni iniettabili di manutenzione.
3. Mantenere l'animale idratato con soluzione salina o di Ringer lattato durante l'esperimento (circa 3 ml / kg / ora), per esempio usando un cocktail anestetico opportunamente diluito per preparazioni iniettabili manutenzione (Tabella 1).
4. Posto l'animale in un apparato porta-teste stereotassico o altro. Assicurarsi che il cranio è ben protetto,. Ciò è essenziale per mantenere registrazioni monocellulari stabili.
5. Applicare una pomata opthalamic agli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea a 36,5-37 ° C.
6. Eseguire uno scarico della cisterna per la stabilità ulteriore registrazione. Usando un bisturi, rimuovere il tessuto dalla faccia posteriore del cranio per esporre la cisterna magna. Fare un piccolo nick nella dura per drenare il liquido cerebrospinale. Utilizzare solo la punta della lama, ed evitare qualsiasi contatto il gambo cervelletto o del cervello.
7. Utilizzando il bisturi, eseguire una piccola craniotomia (~ 2 mm ²⁾ sopra la zona corticale di interesse (per l'acusticacorteccia, circa -2.3 mm posteriormente di bregma, 4,5 millimetri laterale della linea mediana).
8. Rimuovere la dura e coprire la corteccia esposta con uno strato di agarosio calda 0,5 - spessore di 1 mm (1,5% agarosio in soluzione salina, 0,9% di NaCl; applicare a ~ 37 ° C). Mantenere l'umido agarosio tutto l'esperimento applicando periodicamente alcune gocce di soluzione salina.

2. Registrazione Set-up

1. Preparare un elettrodo di tungsteno (7-14 MW, 127 micron di diametro, 12 ° punta affusolata, rivestimento epossidico). Superglue l'elettrodo di un tubo capillare di vetro e aggiungere termorestringente per una presa (figura 1).
2. Montare l'elettrodo su un micromanipolatore motorizzato (o idraulico), impostare viaggiare ortogonale alla superficie corticale. Far scorrere un filo di terra sotto la pelle, contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli sul lato della testa e la parte posteriore del collo, in quanto possono generare artefatti elettromiografici.
3. Amplificazione del segnale elettrico utilizzando un amplificatore extracellulareli fi catore adatto per la registrazione singola unità, preferibilmente dotata di una modalità di controllo dell'impedenza. Monitorare l'attività chiodare in corso (banda passante di 300 - 5.000 Hz) con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Qui, i dati registrati vengono digitalizzate continuo ad una frequenza di campionamento di 10 kHz; picchi vengono estratti in linea.
4. Avanzare l'elettrodo attraverso l'agarosio finché la punta raggiunge la superficie della corteccia. Osservare questo passaggio attraverso un microscopio. "Zero" questa posizione sul micromanipolatore.
5. Per meglio approssimare la profondità della registrazione, confermare visivamente che la punta dell'elettrodo esce dalla superficie corticale ad una profondità di zero quando ritirare l'elettrodo al termine di una penetrazione.
   NOTA: Una discrepanza tra la lettura manipolatore e la posizione dell'elettrodo osservato indica che è spostata rispetto al tessuto. Questo può essere causato da instabilità del cervello o animale, o manipolatore deriva.
   1. Come un ulteriore controllo per garantire chequesto set-punto zero corrisponde alla superficie della corteccia, monitorare potenziali di campo evocati stimolo mentre avanza attraverso le prime diverse centinaia di micrometri di tessuto. Durante il monitoraggio potenziali di campo, abbassare il più basso filtro passa-banda di taglio dell'amplificatore extracellulare a 10 Hz. Verificare che la polarità del potenziale campo locale inverte intorno una profondità di circa 100 micron, in prossimità dello strato di confine I / II ^13. Questo è un punto di riferimento affidabile per la corteccia uditiva, ma può essere diverso per le altre aree corticali.
6. Montare una fibra ottica accoppiata ad una sorgente di luce blu (figura 2) su un micromanipolatore manuale. Utilizzando il microscopio, posizionare la punta della fibra più vicino alla superficie del agarosio possibile. Centrare il fascio in cui l'elettrodo si entra il tessuto.
7. Regolare l'uscita della sorgente di luce con una unità di controllo in grado di erogare un TTL (transistor-transistor logic) treno di impulsi di larghezza e duratio specificaton- esempio, un Arduino (figura 3), una scheda PC I / O (come mostrato), o un generatore di impulsi disponibile in commercio.
   1. Monitorare il segnale su entrambi oscilloscopi.
8. Misurare potenza luminosa totale (mW) sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare irradianza (mW / mm ²⁾ dividendo per l'area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Iniziare con un valore di intensità nell'intervallo 10 - 15 mW / mm ² e regolare verso il basso se necessario, fino artefatti sono eliminati.
9. Verificare la presenza di manufatti leggeri con l'elettrodo nella agarosio, pronta a entrare nel tessuto. Avviare la ricerca treno di impulsi (ad esempio, 30 impulsi di luce msec, 500 msec intervallo interstimulus (ISI)).
   1. Eliminare manufatti leggeri transitori (Figura 4) per riposizionare la fibra ottica rispetto all'elettrodo per cambiare l'angolo della luce incidente. Se artefatti persistono, provare a diminuire la potenza luminosa. In the caso raro che gli artefatti non possono essere completamente eliminati (solo ridotto al minimo), estendere la durata dell'impulso di ricerca. Questo può aiutare a identificare i veri picchi neuronali.

3. Dritto PINP-in '

1. Avanzare l'elettrodo lentamente attraverso il cervello ad una velocità di circa 1 micron / sec. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'attività in corso. Dall'altro, scatenare gli impulsi laser.
2. Attendere il 'hash' deboli di picchi luce evocata sul monitor audio, che indica che l'elettrodo si avvicina una cella ChR2 + e spesso può essere percepito ben prima del segnale elettrico risulta sull'oscilloscopio. Rallentare la velocità di avanzamento.
   NOTA: Se la cella si trova direttamente nel percorso dell'elettrodo, l'attività di luce evocata crescerà più grande (e più forte). Come l'elettrodo si avvicina un singolo interneuroni, l'hash risolverà in piccoli ma ben definiti picchi di forma e dimensione uniformi.
3. Appena lipicchi GHT-evocato sono grandi abbastanza per innescare della singolarmente sull'oscilloscopio, cominciano a farlo. Regolare la scala sull'asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d'onda di picco.
4. Fermarsi e attendere per il tessuto di stabilirsi. Resistete alla tentazione di spostare l'elettrodo più vicino alla cella. Questo passaggio è fondamentale per una registrazione stabile. Se dopo alcuni minuti il ​​rapporto segnale-rumore non è migliorata - cioè, il tessuto è costante, ma non ha portato la cella più vicino alla punta dell'elettrodo - avanzamento 5 micron ulteriormente e attendere.
   1. Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore).
      NOTA: C'è poco rischio di falsi positivi o ambiguità quando PINPing interneuroni inibitori. La maggior parte delle cellule in grado di seguire facilmente un treno di impulsi di durata di 30 msec e inter-pulIntervallo SE 500 msec, o più veloce, con una certa latenza primo picco di 2-5 msec (Figura 5). La maggior parte delle cellule fotovoltaiche +, in particolare, può sostenere cottura per un totale di 1 sec (Figura 6). Perché questi sono neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante.
5. Durante la registrazione, monitorare l'attività in corso sul primo oscilloscopio. Tieni d'occhio le dimensioni e la forma del picchi utilizzando il secondo oscilloscopio. Si noti la qualità del loro suono sull'altoparlante.
   1. Ascoltate con attenzione per i cambiamenti improvvisi, che indicano che la cella è sia volge troppo vicino all'elettrodo (dove rischia di essere impalato o danneggiato), o è alla deriva. Se le punte si allargano e distorta, tornare indietro; se crescono più piccolo, far avanzare l'elettrodo. Si muovono lentamente in 2 micron passi.
   2. Verificare la qualità della registrazione post-hoc sovrapponendo tutte le forme d'onda di picco, allineati a picco o depressione. Variare le THRES tensionetenere. Attraverso una vasta gamma di valori di soglia, ci dovrebbe essere solo una forma coerente picco di altezza uniforme (figura 5a).
6. Se in qualsiasi momento il segnale venga contaminato con punte da un neurone vicino, andare avanti. Avanza lentamente, sulla remota possibilità che l'elettrodo passerà fuori dalla portata della cella vicina, ma rimanere nel raggio d'azione del neurone bersaglio. (Questo è di solito senza successo.)
7. Spostare l'elettrodo attraverso l'intera profondità della corteccia (900 + micron) in ogni penetrazione. Se non ci sono i neuroni di luce-sensibili si incontrano dopo molti penetrazioni o, al contrario, le registrazioni sono regolarmente contaminati con punte di cellule ChR2- vicini, provare un nuovo elettrodo.
   NOTA: Anche all'interno di una stessa partita, la geometria impedenza e punta di singoli elettrodi può variare considerevolmente. Entrambi i fattori contribuiscono alla effettiva "ascolto raggio" dell'elettrodo, che deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocati whricerca ile, ma limitato sufficiente per permettere la registrazione di un singolo interneuroni in isolamento.
8. Testare l'impedenza degli elettrodi lo desideri. Per evitare di danneggiare il tessuto, farlo con la punta dell'elettrodo nella parte superiore dello strato di agarosio, ben al di fuori del cervello. All'interno della gamma di 7-14 MW, l'impedenza esatta non è un sicuro indicatore delle prestazioni, o cedere, per questa applicazione. Detto questo, si tratta di un proxy ragionevole per l'ascolto radio: elettrodi più bassa impedenza raccogliere più unità; elevata impedenza, meno.
9. Alla fine dell'esperimento, eutanasia dell'animale mediante istituzionalmente approvati, quali overdose di anestetico, o dislocazione cervicale sotto un profondo piano di anestesia.

Risultati

Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina ^(1. " KMA "). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno s...

Discussione

Anche se PINP è concettualmente semplice, può essere difficile in pratica. Un fattore determinante del successo è la scelta dell'elettrodo. Il raggio di ascolto elettrica è il parametro critico. Deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocata quando la punta è ancora lontano da una cella ChR2 +, in modo che si può regolare la velocità di avanzamento di conseguenza. Allo stesso tempo, deve essere limitato sufficiente a consentire un buon isolamento singola unità. Cioè, l'elettro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
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