Gradiente di deformazione Chip per comportamenti stimolanti cellulari in cella-carichi idrogel

Riepilogo

Questo articolo introduce un approccio semplice per fornire ceppi statici gradiente discontinuo su un idrogel di cella-carichi concentrici per regolare l'allineamento di cella per l'ingegneria tissutale.

Abstract

Guida artificiale per allineamento cellulare è un tema caldo nel campo dell'ingegneria tissutale. La maggior parte della ricerca precedente ha studiato singolo allineamento cellulare indotta da sforzo su un idrogel carichi di cella utilizzando processi sperimentali complessi e controllo impianti di massa, che sono associate solitamente con problemi di contaminazione. Così, in questo articolo, vi proponiamo un approccio semplice per creare un gradiente ceppo statico utilizzando un chip fluidico con una copertura di plastica PDMS e un substrato di vetro trasparente UV per la stimolazione del comportamento cellulare in un idrogel 3D. Sovraccarico prepolimero cella foto-derivativazione nella camera di fluidica può generare una membrana PDMS curva convessa sulla copertina. Dopo reticolazione UV, attraverso un micropattern circolare concentrico sotto la membrana PDMS curvilinea e tampone di lavaggio, un microambiente per inquirente cella comportamenti sotto una varietà di ceppi di gradiente è self-consolidata in un singolo chip fluidico, senza strumenti esterni. Le cellule NIH3T3 sono state dimostrate dopo aver osservato il cambiamento di tendenza allineamento cellulare sotto la Guida di geometria, in collaborazione con stimolazione del ceppo, che varia da 15-65% su idrogel. Dopo 3 giorni di incubazione, la geometria di idrogel dominato l'allineamento della cella sotto sforzo di compressione basso, dove le cellule allineati lungo la direzione di allungamento di idrogel sotto alta deformazione compressiva. Tra questi, le cellule hanno mostrato allineamento casuale a causa della dissipazione del Consiglio radicale di idrogel allungamento e la Guida di geometria dell'idrogel di fantasia.

Introduzione

Che serve come un blocco di materiale che imita un microambiente nativo, un idrogel contenenti matrice extracellulare (ECM) può ri-costruire impalcature tessuto biomimetici per supportare la crescita delle cellule. Per possedere le funzioni di un tessuto, cellula organizzata allineamento è un requisito essenziale. Vari 2D (cioè, cellule coltivate su una superficie) e 3D (ad esempio, le celle incapsulate in un idrogel) gli allineamenti delle cellule sono stati raggiunti da coltura o incapsulamento di cellule in o su substrati flessibili con micro- o nano-pattern¹. Allineamento della cella 3D in microarchitettura è più attraente, come il microambiente è più vicino al tessuto nativo costrutto^2,3,4. Un approccio comune per l'allineamento di cella 3D è il cue geometrico di idrogel forma^2,3. A causa dello spazio limitato per proliferazione delle cellule nella direzione dell'asse corto, celle obiettivo allineare lungo la direzione di assi lunghi in un idrogel di micro-fantasia. Un altro approccio consiste nell'applicare a trazione Allungamento a idrogel per raggiungere celle allineamento parallelo alla direzione stretch^4,5.

Stimolazione biofisica su idrogeli di ECM, come deformazione compressiva o un campo elettrico, può regolare le funzioni delle cellule per integrazione tissutale adeguata, proliferazione e differenziazione^1,2,3. Gran parte della ricerca è stato fatto per studiare il comportamento cellulare mediante l'applicazione di una condizione di sforzo alla volta utilizzando più controllo meccanico unità^4,6,7,8,9. Ad esempio, l'uso di motori passo-passo meccanico spremuto o allungato su un idrogel di collagene 3D incapsulato delle cellule è stato un approccio comune^7,10. Tuttavia, tale apparecchiatura di controllo richiede spazio aggiuntivo e affronta il problema della contaminazione nell'incubatore^7,9,11,12. Inoltre, lo strumento di grandi dimensioni non può dare un ambiente di controllo preciso di fornire elevata riproducibilit๳.

Considerando che carichi di cella idrogeli sono in genere impiegati su micro-scala per applicazioni biomediche, è vantaggioso per combinare le tecniche MEMS per generare una gamma di stimolazione di ceppo/tratto contemporaneamente studiare i comportamenti delle cellule in 3D biomimetici costrutti in vitro^{2,14,15,16,17,18}. Ad esempio, utilizzando la pressione del gas per deformare la membrana PDMS in chip microfluidici possa dar luogo a vari ceppi, guidando la differenziazione delle cellule a diversi lignaggi^9,16. Tuttavia, ci sono molte sfide tecniche, quali i processi di fabbricazione di complicati chip in una camera pulita e il software di integrazione di controllo dei motori, pompe, valvole e gas compressi.

In questo lavoro, dimostriamo un approccio semplice per ottenere un chip di gradiente statico-ceppo microfluidici autosufficiente con l'ausilio di un modello di idrogel circolari concentrici e una membrana flessibile di PDMS. Diversamente dalla maggior parte degli approcci esistenti, la nostra piattaforma è un dispositivo portatile e USA e getta in miniatura che può essere fabbricato fuori una camera gialla e che possiede auto-generazione di gradienti ceppi su concentrici idrogeli incapsulato in cella, senza attrezzature meccaniche esterne durante l'incubazione. Comportamenti di cellulare dei fibroblasti 3T3 influenzata da una combinazione di forma idrogel e una varietà di segnali di orientamento elasticizzato trazione sono stati dimostrati durante l'osservazione di allineamento della cella all'interno di ambienti 3D ECM-mimetici nel chip gradiente di deformazione per 3 giorni.

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Protocollo

1. GelMA Synthesis

1. Weigh 10 g of gelatin powder and add it to a glass flask with 100 mL ofDulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). Put a magnetic stir bar into the flask and place the flask on a stirring hot plate.
2. Cover the flask with aluminum foil to avoid water evaporation. Set the hot plate temperature to 50-60 °C and the stirrer at 100 rpm for 1 h to dissolve the gelatin powder well.
3. After the gelatin has dissolved, add 8 mL of methacrylic anhydride very slowly (one drop per second) using a pipette. Let it react at 60 °C for 3 h.
4. Add pre-warmed DPBS (40 °C) to the flask to a final volume of 500 mL and allow this mix well for 15 min to stop the reaction.
5. Meanwhile, cut a dialysis membrane (14 kDa cut-off molecular weight) into several 25 cm-long tubes. Immerse them in deionized (DI) water for 15 min and make a knot to close one end of the dialysis tubes.
6. Load the appropriate amount (30 - 60 mL) of the polymer solution into the dialysis tubes and close the other end. Place them in a 5-L plastic beaker with DI water for a week. Renew the DI water twice a day and maintain the solution at 40 - 50 °C during the dialysis process.
7. Collect the solution from the tube in a 500-mL glass bottle. Pour ~450 - 500 mL of solution in a 500-mL filter cup (pore size of 0.22 µm) and apply a vacuum to the filter cup to force the solution to pass through the filter membrane for sterilization.
8. Transfer the sterilized polymer into several 50-mL sterilized tubes and store them in a -80 °C freezer for 3 - 5 days.
9. Freeze-dry the -80 °C polymer for 1 week using a freeze dryer to form GelMA. Store the GelMA in a -80 °C freezer.

2. 3-(Trimethoxysilyl)propyl Methacrylate (TMSPMA) Modification

1.  Cut commercial glass slides into two small pieces (25 mm x 37.5 mm) and immerse them in 0.5 M NaOH solution for 4 h. Wash the slides with a large amount of DI water.
2. Place the slide on a rack inside a glass container with 95% ethanol and clean using an ultrasonicator at 43 kHz for 15 min. Air dry the glass slide.
3. Immerse the glass slides in 5% TMSPMA in 99.5% ethanol for 1 h.
4. Wash the slides in 95% ethanol, air dry the slides, and anneal the TMSPMA coating in an oven at 80 °C for 2 h.

3. Chip Fabrication

1. Take one 2 mm- and one 0.3 mm-thick polymethylmethacrylate (PMMA) plate, apply double-sided tape to one side of the PMMA surface, and release the liner on one side. Leave two 2 mm-thick PMMA plates and one 1 mm-thick plate without double-sided tape.
2. Laser-cut a 2 mm-thick PMMA plate without double-sided tape to 42 mm x 30 mm to make the bottom plate. Cut a 2 mm-thick PMMA plate with double-sided tape to make the boundary frame, with outer dimensions of 42 mm x 30 mm and inner dimensions of 37.5 mm x 25 mm.
3. Laser-cut the 0.3 mm-thick PMMA plate with double-sided tape into a 12-mm center circle with two 2 mm-wide and 8 mm-long flow channels on opposite sides of the circle (Figure 1a).
4. To prepare the PMMA mold for casting the PDMS cover, assemble the three pieces of PMMA components from steps 3.2-3.3 (Figure 1b) using double-sided tape.
5. Laser-cut a 2 mm-thick PMMA plate with double-sided tape into a 5 cm x 5 cm piece with a 3 x 3 array of 8.5 mm x 8.5 mm hollow rectangles. Cut another 5 cm x 5 cm piece with a 3 x 3 array of 4-mm hollow circles. Laser-cut a 1 mm-thick PMMA plate without double-sided tape into a 5 cm x 5 cm PMMA bottom plate.
6. Prepare the PMMA mold for casting the PDMS plug by assembling the three pieces of PMMA components from step 3.5 (Figure 1c) using double-sided tape.
7. Prepare the PDMS cover and PDMS plug by properly mixing 30 g of PDMS elastomer and 3 g of PDMS curing agent; degas the mixture under a vacuum chamber for 1 h.
8. Cast 1.8-2.0 g of the mixture into the PMMA mold for the PDMS cover and use the appropriate amount to fill each cavity of the PMMA mold for the PDMS plug. Cast 10 g of uncured PDMS mixture in a blank 10-cm plastic plate. Put these molds in a vacuum chamber to degas for 30 min.
9. Cure the PDMS for 2 h at 80 °C. After cooling down the cured PDMS on the mold, detach the PDMS covers and the PDMS plugs from the PMMA molds.
10. Punch two holes with diameters of about 3 mm at the ends of flow channels of the PDMS covers.
11. Cut the PDMS sheet molded from the 10-cm plastic plate into many 1 cm x 1 cm cubes and punch a 3-mm hole in each PDMS cube. Glue two uncured 1 cm x 1 cm PDMS cubes onto the openings of the PDMS cover (to serve as medium reservoirs and to aid in the curing process of the gradient circular hydrogel patterns) and cure for 1 h at 80 °C.
12. Bond the PDMS covers with the two PDMS reservoirs onto a TMSPMA-coated slide by pre-treating the bonding side of the PDMS cover and the TMSPMA-coated slide under an oxygen plasma machine (30 W RF power (high mode) and 600 mTorr compressed air) or a high-frequency electronic corona generator (115 V, 50/60 Hz, 0.35 A) for 90 s of O₂ plasma treatment.
13. Contact the plasma-treated surface of the PDMS covers and the TMSPMA slide and press them closely for permanent bonding through the formation of an Si-O-Si bond.
    NOTE: Placing the chip in an oven at 80 °C for 1 h can further enhance the bonding strength.
14. After cooling, immerse the chips in 95% ethanol for 15 min and air dry. Then, sterilize the chips under UV irradiation for 1 h and store them in a box wrapped in aluminum foil in the laminar hood.

4. Static Gradient Strain on the Cell-laden Hydrogel

1. Print and cut a piece of photomask, 25 mm x 37.5 mm in size, by printing the layout in Figure 2b on a transparent film. Adjust the printed size of Figure 2b to match the dimension in Figure 2a.
2. Prepare 100 mL of DMEM medium with 10% FBS, 1% Pen-Strep, and 250 mL of DPBS in a 37 °C water bath to use as the cell culture medium.
3. Weigh 25 mg of freeze-dried GelMA into 0.3 mL of prewarmed (37 °C) cell culture medium in a 1.5-mL black microcentrifuge tube. Put the microcentrifuge tube on a laboratory stirrer/hot plate until the GelMA dissolves in the medium.
4. Weigh 50 mg of photoinitiator into 1 ml of DPBS in a microcentrifuge tube and place it in an 80 °C oven for 15 min or until the photoinitiator has dissolved.
5. Take 25 µL of the 10% photoinitiator from step 4.4 and add it to the microcentrifuge tube from step 4.3. Pipette several times to mix well.
6. Count 3 x 10⁶ NIH 3T3 cells using an automated cell counter. Centrifuge the suspension at 200 x g for 5 min, discard the supernatant, and re-suspend the cells in 175 µL of cell culture medium.
7. Add the cell solution from step 4.6 to the microcentrifuge tube from step 4.5 to get a prepolymer cell solution of 5% GelMA, 0.5% photoinitiator, and ~6 x 10⁶ 3T3 cells/mL. After mixing, load 100 µL of cell prepolymer in a 100-µL micro syringe.
8. Manually align (see Figure 3a) a piece of the photomask onto the bottom slide of the sterilized gradient strain chip and simply fix the position using a small drop of DI water in between. Connect the 100-µL micro-syringe loaded with prepolymer cell solution to the inlet of the chip.
9. Place (see Figure 3b) 50 µL of prepolymer cell solution in the flow channel using the micro-syringe and then plug the outlet using a PDMS plug. Inject an extra 40 µL of solution to create a convex bulge in the circular PDMS membrane.
10. Move the chip with the photomask (bottom), micro-syringe (inlet), and PDMS plug (outlet) from step 4.9 under a UV lamp (365 nm, 9 mW/cm²) and expose it for 30 - 45 s to crosslink the concentric circular hydrogel in the fluidic chamber.
11. Remove the PDMS plug and the micro-syringe to release the liquid pressure (see Figure 3c). Use a 1-mL syringe loaded with prewarmed DPBS to wash out uncrosslinked resins 3 times by flushing from the inlet to the outlet.
12. Fill the flow channel with about 100 µL of cell culture medium.
13. Place the chip in a sterilized culture dish and culture in a 5% CO₂ atmosphere at 37 °C for a week. Refresh the medium every day.
14. Take images of three chips on day 0 after 4 h of incubation, as a control group, and three chips on day 3, as the experimental set, using a microscope with a 20X objective. Measure the line width of each hydrogel from line 1 to line 12 using software (e.g., ImageJ) to calculate the compress strains ( Figure 4).
    NOTE: The elongation percentage is calculated by dividing the value of the line width difference between 40 µL and 0 µL by the line width at 40 µL.

5. Cell Staining for Alignment Analysis

1. Use a syringe to inject 4% paraformaldehyde (PFA) in DPBS at RT into the flow chip for 15 min for the fixation of the cell-laden hydrogel.
   NOTE: Caution. PFA is toxic and should be handled with care.
2. Replace the solution with 0.5% cell membrane permeating solution in DPBS for 10 min to permeabilize the cell membrane at RT.
3. PBS wash the samples 3 times with 5- to 10-min interval between washes (using a loaded syringe, as in step 5.1).
4. Load 1% BSA solution into the fluidic channel for 45-60 min at RT (using a loaded syringe through the inlet port).
5. Add 1.5 mL of methanol into the vial with Alexa Fluor 488 phalloidin to yield a final concentration of 6.6 µM stock solution.
6. Take 5 µL of Alexa Fluor 488 phalloidin from step 5.5 and dilute it in 200 µL of DPBS with 0.1% BSA to form a final concentration of 0.165 µM Alexa Fluor 488 phalloidin.
7. Add 200 µL of the mixture solution to the fluidic channel using a micropipette and incubate the chip at 37 °C for 45 - 60 min for actin staining. PBS wash (as above) the samples 3 times.
8. Prepare 1 µg/mL DAPI in PBS, flow it through the chip, and stain cell nuclei at 37 °C for 5 min.
9. Pipette DPBS into the fluidic channel to wash out the staining solution and refill the fluidic chamber with PBS solution to take images with a fluorescence microscope.
10. Capture the fluorescent images of the 3T3 cells in the hydrogels using an inverted fluorescence microscope under 40X magnification with a CCD detector and filter sets of ex/em at 488/520 nm and 358/461 nm for Alexa Fluor 488 phalloidin (actin) and DAPI (nucleus), respectively.

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Risultati

Per confrontare le variazioni meccaniche tra ogni idrogel circolare nel chip stimolazione ceppo gradiente completato, abbiamo misurato la larghezza di riga di ogni idrogel circolare in due i chip stesso, con volumi di iniezione di 0 µ l (Figura 4a) e 40 µ l (Figura 4b), rispettivamente. Il percentuali allungamenti al ogni cerchio sono stati calcolati dividendo gli allungamenti nel chip 40 µ l-iniettato per la larghezza di riga...

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Discussione

In questa carta, segnaliamo su un approccio semplice per confrontare il comportamento di allineamento delle cellule dopo idrogel forma di orientamento e di allungamento a trazione. Una membrana flessibile di PDMS crea una curvatura a forma di cupola per la generazione di diverse altezze di idrogeli circolari concentrici. Dopo aver rilasciato la pressione, la membrana PDMS applica automaticamente la forza per il micro-fantasia idrogeli per formare gradiente ceppo/allungamento, con un massimo al centro e un minimo al confi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL black microcentrifuge tube	Argos Technologies	03-391-161	This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil
10x DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Calcein	Molecular Probe	C1430	For labeling viable cells
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Cell membrane permeating solution	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Cell nucleus staining
Dialysis membrane	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
Double-side tape	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, type A, from porcine skin
High frequency electronic corona generator	Electro-technic products	MODEL BD-20
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685
Micro syringe	Hamilton	80501	50 μL
Microscope	Olympus	IX71	Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock
Oxygen plasma machine	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cell
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillin/streptomycin
Photoinitiator	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For labeling dead cells
Sterile Filtration cup	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	For hydrogel immobilization
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
UV light	DAIHAN	WUV-L10
Freeze Dryer	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Automated Cell Counter	ORFLO	MXZ001