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  • Riepilogo
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Riepilogo

Un protocollo per il processo di fabbricazione di strutture in composito polimerico pellicola sottile che possiede di diversi giovani moduli o spessori è presentato. Film sono prodotti per studi su colture cellulari avanzati o come adesivi di pelle.

Abstract

In questo protocollo, presentiamo metodi per fabbricare film composito sottile in elastomero per applicazioni della coltura avanzata delle cellule e per lo sviluppo di adesivi di pelle. Due diversi poli-(dimethyl siloxanes) (PDMS e morbida pelle adesivo (SSA)), sono stati utilizzati per indagini approfondite di effetti biologici e caratteristiche adesive. Il film compositi sono costituiti da uno strato di supporto flessibile e un rivestimento superiore adesivo. Entrambi gli strati sono stati fabbricati dalla tecnica di applicazione lama medico. Nella ricerca attuale, il comportamento adesivo dei film composito è stato studiato come una funzione di spessore dello strato o una variazione del modulo di Young del livello superiore. Il modulo di Young di PDMS è stato modificato variando la base per il rapporto di miscelazione di reticolante. Inoltre, lo spessore del film di SSA è stato variato da circa 16 µm a circa 320 µm. scansione microscopia elettronica (SEM) e microscopia ottica sono stati utilizzati per misure di spessore. Le proprietà adesive del film elastomero dipendono fortemente lo spessore del film, il modulo di Young dei polimeri e le caratteristiche superficiali. Di conseguenza, è stato studiato normale adesione di questi film su substrati di vetro che esibiscono le superfici lisce e ruvide. Il rapporto di miscelazione di elastomeri di silicone dipendono strappo stress e lavoro di separazione.

Inoltre, lo spessore dell'adesivo pelle morbida posizionato sopra uno strato di appoggio solidale è stato variato per produrre le patch per le applicazioni della pelle. Citotossicità, proliferazione e adesione cellulare dei fibroblasti murini L929 su pellicole di PDMS (rapporto di miscelazione 10:1) e SSA (miscelazione rapporto 50: 50) sono stati condotti. Ci hanno mostrato qui, per la prima volta, il confronto fianco a fianco di sottili pellicole compositi prodotte di entrambi polimeri e presentare lo studio delle loro proprietà biologiche - e adesivo.

Introduzione

In questo protocollo, sono presentati metodi dettagliati per la produzione di film sottile elastomero. La tecnica di lama medico ampiamente disponibile è stata utilizzata per la produzione di film sottili di composito. La tecnica di fabbricazione è stata effettuata su fogli di polietilentereftalato (PET), che consente la produzione successiva di questi film in larga scala. L'enfasi di questo protocollo è la valutazione della riproducibilità, precisa produzione di diversi strati di film compositi e determinazione delle proprietà biologiche e adesione della patch composito finale. Il poly-(dimethylsiloxane) di elastomero di silicone (PDMS) è ampiamente utilizzato nella tecnologia biomedica, compresa la produzione di pelle adesivi, applicazioni di microfluidica e ulteriori ricerche campi1,2,3 ,4. Recentemente, un'altra sottoclasse di PDMS, i cosiddetti Soft pelle adesivi (SSAs) sono stati introdotti, in particolare per la pelle delicata di legame e de-bonding.

SSAs in silicone sono elastomeri vinile funzionalizzato, differiscono dai polimeri analoghe dall'assenza di silice5di rinforzo. Simile a altri PDMS, SSA modulo di Young può essere adattato in una vasta gamma di concentrazione cross-linker modulante o polimerizzazione tempo6,7,8. Questo cambiamento di modulo di Young di elastomeri di silicone influisce in modo significativo le proprietà adesive del materiale e ha anche profonde conseguenze sulle cellule procariote ed eucariote coltivate sulla superficie9,10 , 11. il livello biologico cellulare, è stato dimostrato, che le cellule eucariotiche rispondono sul livello di trasduzione del segnale per una modulazione dell'elasticità matrice o spessore della superficie9,10,12 ,13,14. Di conseguenza, esiste un vasto interesse nelle applicazioni della coltura delle cellule di polimeri con proprietà meccaniche sintonizzabile. D'importanza, l'intrinsecamente bassa energia superficiale degli elastomeri a base di silicone non fornisce le condizioni ottimali per la coltura cellulare delle cellule eucariotiche. Trattamento al plasma di ossigeno è una tecnica ampiamente utilizzata per aumentare PDMS bassa energia superficiale temporaneamente, che porta ad un potenziamento della sua forza di strappo, diminuita superficie adsorbimento di molecole, mentre in parallelo promuovere attaccamento, diffusione e proliferazione di cellule eucariotiche15,16,17,18.

Oltre alle proprietà dei materiali, la topografia di superficie influenza in modo significativo di adesione cellulare e l'interazione adesivo tra due materiali19,20,21,22. Rugosità superficiale ha parecchi effetti sulla formazione contatto tra due superfici: riduzione della zona di contatto, alta memorizzati energia elastica che circonda asperità così come influenza sulla propagazione di crepa può alterare la resistenza adesiva23, 24. Adesione di pellicole autoadesive per la pelle umana è un settore emergente di applicazione, ad esempio, medicazioni, fissazione di elettrodi ECG o altri dispositivi elettronici indossabili25,26,27, 28. Per misurare la prestazione adesiva di autoadesivi in relazione alla topografia superficiale, substrati di vetro con diversi gradi di rugosità possono essere utilizzati nella normale adesione misure8,21. Qui, i due substrati di vetro sono stati selezionati per indagare le proprietà adesive delle pellicole polimeriche. Composito, primo film con un strato di rinforzo PDMS in un rapporto di 10 a 1 peso parti coperte da PDMS con diverso rapporto di miscelazione miscelazione sono state caratterizzate. In una seconda fase uno strato adesivo di SSA è stato preparato con una quantità di peso uguale di entrambi i componenti e con vario spessore di pellicola sopra un supporto film PDMS.

Protocollo

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono irritanti, acutamente tossici e/o cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si gestiscono questi prodotti chimici. Ciò include l'uso di ingegneria (armadio) e personal dispositivi di protezione (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse). Porzioni delle seguenti procedure coinvolgono la cultura di una linea di cellule animali. Pertanto, si prega di seguire le norme di biosicurezza specifici. Rifiuti chimici e biologici deve essere smaltito secondo le norme specifiche nazionali e istituzionali e le raccomandazioni.

1. preparazione delle strutture Composite elastomerico a Film sottile di silicio

  1. Preparazione di polimeri
    1. Per preparare 1,1 g di PDMS in rapporto 10:1, mescolare 1,0 g del compound A con 0,1 g di composto B.
    2. Mix e degase i pre-polimeri in un mixer di velocità a 2350 giri sotto vuoto per 3 min.
    3. Modificare i rapporti di massa tra composti A e B composto di 45: 1 e 70:1. Prepararli simile al metodo descritto al punto 1.1.2.
    4. Preparare 1 g dell'adesivo pelle morbida (SSA) nel rapporto di 50: 50. Quindi mescolare 0,5 g del compound A e 0,5 g di composto B come descritto al punto 1.1.2.
  2. Preparazione del poli-(vinyl alcohol) (PVA) foglio di PET rivestito
    1. Preparare una soluzione PVA 18% (w/w) in acqua con l'aggiunta di PVA per acqua deionizzata e mescolare durante la notte con un agitatore magnetico. Conservare questa soluzione a 4 ° C.
    2. Preparare film sottili che esibiscono un'efficace dello spessore di 15 µm con la macchina di applicazione lama medico, utilizzando 100 µm gap della lama e una velocità di circa 2.0 mm/s.
    3. Mettere il film in un forno a 95 ° C per 15 min.
  3. Preparazione del supporto-livello di rapporto di miscelazione 10:1 PDMS dalla tecnica di lama medico
    1. Utilizzare una macchina di applicazione lama medico automaticamente controllata per la preparazione di film sottili.
    2. Pulire il foglio di PET con 100% isopropanolo e posizionarlo sulla superficie della zona di applicazione della lama medico.
    3. Posizionare la racla in cima la lamina e regolare lo spessore con il micro viti di posizionamento. Per la produzione degli strati bagnati, applicare spessori di 60 µm, 100 µm, 200 µm e 500 µm.
    4. Riempire il polimero di 10:1 di PDMS preparato al punto 1.1 nel serbatoio della lama medico con una siringa monouso. Avviare il movimento della lama con una velocità di circa 2.0 mm/s.
    5. Rimuovere la pellicola dell'animale domestico con il rivestimento di 10:1 applicata dalla macchina e metterlo in forno per 1 h a 95 ° C, si trova in una stanza che esibiscono umidità tra 40% e il 65%.
    6. Pulire la lama medico con isopropanolo e carta asciugamani.
    7. Ripetere questa procedura per tutti gli spessori richiesti.
  4. Preparazione dello strato superiore di PDMS in diversi rapporti di miscelazione mediante tecnica lama medico
    1. Rimuovere le strisce sottili dei lati di lunghezza della pellicola sottostante con un bisturi o lametta per consentire il posizionamento e scorrimento della lama medico sulla lamina di PET.
    2. Procedura di protocollo 1.3.3 a 1.3.6. Spessore bagnato applicato per il film è 160 µm.
    3. Ripetere questa procedura per la produzione di due film indipendenti con un altro rapporto di miscelazione dei componenti PDMS (45: 1 e 70:1). Memorizzare i film a temperatura ambiente (circa 22 ° C con un'umidità tra 40 e 65%) in quadrati di Petri per impedire loro di contaminazione e polvere.
  5. Preparazione di film sottili di composito che esibiscono diversi spessori dello strato di 50: 50 di SSA
    1. Preparare film di 10:1 di PDMS come strato di supporto, come descritto in precedenza al punto 1.3.
    2. Seguire i passaggi di protocollo 1.4.1 e 1.4.2 per produrre questi film. Utilizzare SSA nel rapporto di miscelazione di 50: 50 e produrre un film con uno spessore umido di 40 µm.
    3. Ripetere la procedura per le ulteriori spessori bagnati di: 120 µm, 300 µm, 500 µm.

2. normale adesione misurazioni utilizzando substrati con diversa rugosità superficiale

  1. Preparazione e caratterizzazione di substrati di vetro con diverse rugosità superficiale
    1. Utilizzare un cilindro di vetro con diametro 2 mm come substrato liscio.
    2. Per la fabbricazione di un pezzo l'accisa 'substrato grezzo' con il tagliavetro con la dimensione di circa 4 x 4 mm da una lastra di vetro smerigliato. Utilizzare un tampone di mano di abrasivi diamantati per ottenere un'area circolare di circa 3 mm di diametro.
    3. Fissare il vetro di un cono in alluminio con colla UV e illuminarlo nella camera di illuminazione UV per 3 min.
    4. Determinare il raggio della superficie del substrato con un microscopio ottico. Calcolare l'area secondo la formula A = πr2.
    5. Determinare la rugosità parametro Ra e Rz (secondo: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) con un profilometro a stilo.
    6. Appone il substrato sul palco campione del Profilometro e portare la punta (diamante, standard: 2 µm/60 °) a contatto con il campione.
    7. Registrare il profilo di rugosità con una velocità di 0,3 mm/s e una lunghezza di 1 mm.
    8. Per analizzare la topografia di superficie, misurare un'area di esattamente 1 mm2 con un profilometro a stilo, operato dal software associato.
      Nota: Il Profilometro è gestito da un computer esterno. Il titolare viene spostato di 0,001 mm nella direzione y, dopo uno spostamento di 1 mm viene raggiunto in x direzione. Registrato. RS3 file viene importato in Surfcom mappa esperto Software per creare immagini 3D.
  2. Misura normale adesione di sottili pellicole prodotte di PDMS o SSA
    1. Usare una lama di rasoio per tagliare le pellicole sulla lamina di PET in piccoli pezzi con una superficie di circa 4,0 cm2 e posto che loro su un vetro slide con colla UV. Illuminare con luce UV per 3 min.
    2. Inserire il campione polimerico su supporto del campione.
    3. Pulisca il substrato superficie delicatamente con etanolo e asciutto con gas azoto.
    4. Allegare il substrato di vetro, montato al cono in alluminio, alla cella di carico.
    5. Utilizzare la tabella inclinabile (goniometro) per allineare le superfici precisamente regolando l'angolo di inclinazione del substrato si avvicina il film polimerico. A tale scopo, portare il substrato manualmente a contatto con la pellicola. Modificare l'angolo di inclinazione fino ad ottenuta un allineamento completamente parallelo di entrambe le superfici a vicenda, visualizzata tramite le immagini di telecamere.
      Nota: La cella di carico è connessa alla tabella del ribaltabile. Un prisma di vetro si trova sotto il campione, come illustrato nella Figura 4, che permette la visualizzazione della zona di contatto con due telecamere e consentendo l'allineamento del substrato sulla pellicola di polimero.
    6. Spostare il substrato per la superficie di film polimerici fino a quando uno stress precarico di 13 ± 5 kPa è raggiunto (Figura 4).
    7. Avviare il pacchetto di software programmato personalizzato scritto in LabView per controllare che i parametri di misura richiesti come tenere velocità tempo e approccio/ritrazione. La tenuta tempo ttenere è 1 secondo, l'approccio e velocità di distacco è 30 µm/s e 10 µm/s rispettivamente.
    8. Eseguire misure di adesione su tre campioni fabbricati indipendenti e a sei posizioni diverse su ogni superficie della pellicola.
  3. Analisi dei dati e calcolo dei fattori meccanici chiave: strappo stress e lavoro di separazione.
    1. Calcolare la sollecitazione figure-protocol-8354 dividendo il registrato per forzare l'area di substrato AS.
      figure-protocol-8494
    2. Determinare le sollecitazioni pull-off, che sono descritto come il valore massimo dello sforzo normale.
      figure-protocol-8679
    3. Ottenere la Δs di spostamento per sottrazione della posizione iniziale del regime a traziones0 da campione posizione sfine dove de-incollaggio è stato completato. Definire l'inizio del regime di trazione come s0 = 0.
      figure-protocol-9021
    4. Correggere i valori misurati della posizione del campione la conformità del sistema C secondo la seguente equazione:
      figure-protocol-9219
    5. Integrare la curva di stress-spostamento tra s0 e sfine al fine di calcolare il lavoro di separazione.
      figure-protocol-9425
  4. Calcolo dei fattori meccanici chiave utilizzando software per calcoli matematici origine.
    1. Importare il file dat registrata da una misurazione singola adesione in una tabella di origine. I parametri che vengono registrati sono ora, la posizione del campione e la forza. Inserire questi parametri nelle colonne A (tempo), B (posizione del campione) e C (forza).
    2. Per determinare il valore vuoto, media circa 20 valori di misurazione della forza prima di contattare il film polimerico. Nome questo valore medio Foffset e incollarlo nella colonna D.
    3. Calcolare lo sfondo corretto della forza F * secondo la seguente equazione
      figure-protocol-10199
      e inserire questa equazione, come illustrato di seguito, nella colonna E.
      figure-protocol-10345
    4. Definire l'inizio del regime di trazione come zero cilindrata, vale a dire, s0 = 0. Di conseguenza, determinare s0 e sottrarre lo spostamento nella colonna B e salvarlo nella colonna f:
      figure-protocol-10643
    5. Inoltre, è possibile correggere la posizione di campione per la conformità della macchina. Questa correzione viene eseguita nella colonna G. Inserisci l'equazione seguente nella colonna G
      figure-protocol-10912
    6. Calcolare la sollecitazione nella colonna successiva H. Di conseguenza, dividere la forza dalla zona del substrato. Inserire la seguente equazione
      figure-protocol-11142
      dove A è l'area della superficie dei substrati di vetro in mm2 (determinato al punto 2.1).
    7. Calcolare il lavoro di separazione dai valori di sollecitazione e lo spostamento. Quindi, tracciare lo spostamento lungo l'asse x e lo stress lungo l'asse y. Integrare questo grafico s0 sfine dove sfine è definita come lo spostamento in cui la sollecitazione di trazione ritorna a zero, cioè ha avvenuto distacco completo. Per integrare il grafico, scegliere la funzione di integrazione. Aggiungere i valori calcolati nelle colonne I e J.

3. caratterizzazione dei film di microscopia elettronica (SEM) e microscopia ottica

  1. Microscopia ottica
    1. Con una lama di rasoio tagliare la pellicola polimerica in piccoli pezzi (circa 0,25 cm2) e collegarli a bordo di una diapositiva di vetro. Posto sul vetrino verticalmente orientato sotto un microscopio dritto e misura lo spessore della sezione trasversale del film.
      Nota: Utilizzare un obiettivo X 20 (NA = 0,45, risoluzione teorica a 800 nm di 1,1 µm) per misurare i valori di spessore di pellicola di circa ≤ 20 µm. Per un film di spessore nel range di 20 µm fino a 50 µm utilizzare un obiettivo 10x (NA = 0.30, risoluzione teorica a 800 nm di 1,6 µm) e per un film di spessore ≥ 50 µm utilizzare un obiettivo X 5 (NA = 0,15, risoluzione teorica a 800 nm di 3,3 µm).
  2. Indagine di SEM
    1. Tagliare il foglio di PET e allegare un campione di circa 2 cm2 di un vetrino e posizionarlo verticalmente per il meccanismo di bloccaggio all'interno il campione titolare ≤ 2 mm sotto la superficie superiore del titolare.
    2. Selezionare una tensione di accelerazione di 10 kV, il rivelatore di elettroni di backscattered (BSD) e condizioni di vuoto basse (60 Pa).
    3. Regolare la messa a fuoco, ingrandimento, luminosità e contrasto delle immagini.
    4. Scegliere un tempo di acquisizione immagine di 28 s con una risoluzione di 1024 x 2048 pixel.
    5. Rimuovere il supporto del campione da SEM.

4. biologico inchiesta

  1. Cultura di L929 sistematiche delle cellule
    1. Utilizzare la linea cellulare dei fibroblasti murini L929 per indagine. Coltura le cellule in sostanza basale di Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, completato con 10% siero bovino fetale e streptomicina und penicillina a 37 ° C, 5% CO2 in T75 celle matracci di cultura. Passaggio le cellule in una confluenza di circa 70%-80%.
    2. Per il passaggio delle cellule, rimuovere il supporto dall'aspirazione e lavare con magnesio e calcio - tampone fosfato libero (DPBS- / -) per 30 s sotto un flusso laminare. In seguito Incubare le cellule con 2 mL di Accutase, una soluzione enzima proteolitico e attività collagenolytic per fino a 5 min a 37 ° C, 5% CO2.
    3. Verificare il distacco delle cellule dalla superficie del pallone di cultura delle cellule con un microscopio a contrasto di fase.
    4. Aggiungere 8 mL di siero contenente medio nella boccetta e trasferimento la sospensione cellulare in una provetta di reazione di 15 mL.
    5. Prendete un 10 µ l di campione da una sospensione cellulare e mescolare con 10 µ l di Trypan Blue.
    6. Determinare il numero di cellulare con una camera di Neubauer e calcolare il numero totale delle cellule.
      Attenzione: Trypan Blue è tossico, quindi consulenza MSDS, seguendo le procedure obbligatorie descritte nelle schede tecniche, è necessario indossare dispositivi di sicurezza personale appropriato e gestione sotto un armadietto chimico. Raccogliere i rifiuti per deposizione chimica dei rifiuti.
      Nota: Le cellule positive di Trypan Blue sono di colore blue, che indica le membrane cellulari non intatto.
    7. Per il passaggio successivo, cultura 5x105 celle in un matraccio di cultura cellulare sterile nuovo con 10 mL di terreno nuovo. Per condizioni sperimentali, cellule di cultura 3 x 105 nelle piastre di bene 6 e 6 x 104 cellule in ciascun pozzetto della piastra ben 24, contenente campioni polimerici (passo 4.2 del protocollo).
  2. Preparazione di film compositi per esperimenti della coltura cellulare.
    1. Pezzi unici di accise delle pellicole di dimensioni volute fabbricate nel passaggio di protocollo 1.4 e 1.5 dal livello PET solidale con un bisturi e un luogo con una pinzetta sulla superficie del vetro vetrini coprioggetto che esibisce un diametro di 12 mm. Posizionare i campioni nei pozzetti di una 2 4 piastra bene.
    2. Per la determinazione di citotossicità e conta cellulare, non rimuovere le pellicole da PET estruso. Tagliare aree circolari di circa 9,4 cm2, raccordo ordinatamente nei singoli pozzetti di una piastra ben 6, dalle pellicole prodotte in 1.4 e 1.5 e metterli nei pozzetti di una piastra di coltura delle cellule.
    3. Immergere i campioni di polimero in deionizzata di H2O per ≥ 30 min.
      Nota: I campioni polimerici possono essere sterilizzati in autoclave. Quindi, rimuovere tutti i polimeri contenenti campioni dalle piastre di coltura delle cellule e inserirli all'interno di un bicchiere di Petri. La sterilizzazione avviene in autoclave a 2,05 bar per 20 minuti ad una temperatura di 121 ° C.
  3. Trattamento al plasma di polimeri
    1. Posizionare le pellicole che sono fissate su PET estruso o sul coprioggetto rotondo in vetro (prodotta in 4.2.1) all'interno della camera di reazione del dispositivo del plasma.
    2. Chiudere il coperchio ed evacuare fino a raggiunta una pressione di 1,6 x 10-2 mbar.
    3. Eseguire il trattamento al plasma per 3 min.
    4. Ventilare la camera di reazione e posizionare il campione in ben 24 o 6 piatti ben per ulteriori indagini di cultura cellulare.
    5. Utilizzare un campione per la determinazione di angolo di contatto dell'acqua con un goniometro. Quindi, spostare la siringa vicino alla superficie polimerica, utilizzando il pacchetto software e mettere una goccia di acqua di 3 µ l in cima alla superficie. Calcolare l'angolo di contatto statico dell'acqua con il software del goniometro.
  4. Microscopia e colorazione
    1. Preparare le celle come descritto nel passaggio 4.1.7 e cultura per 3 d a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Catturare immagini di contrasto di fase delle cellule coltivate per tre giorni sulle incontaminate- e trattate al plasma film poco prima della fissazione.
    3. Preparare PBS supplementato con 0,2% Triton X-100. Pipettare lentamente 200 µ l di soluzione madre in 100 mL di PBS (PBS-T).
    4. Preparare una soluzione di paraformaldeide/PBS di 4% (PFA/PBS-T).
      Attenzione: Paraformaldeide è tossico, quindi consulenza MSDS, seguendo le procedure obbligatorie descritte nelle schede tecniche e indossare dispositivi di sicurezza personale appropriato e gestione sotto un armadietto chimico è necessaria.
    5. Preparare una soluzione di 5% BSA/PBS-T.
    6. Rimuovere il supporto dall'aspirazione sotto il flusso della lamina mobile. Aggiungere PBS nei pozzetti per rimuovere residui di media.
    7. Trasferire la piastra ad un gabinetto chimico e sostituire PBS con 400 µ l della soluzione PFA/PBS per 25 minuti a temperatura ambiente.
    8. Rimuovere la soluzione PFA/PBS dai pozzetti singoli, lavare accuratamente con PBS quattro volte. Aspettare 3 minuti tra ogni fase di lavaggio e raccogliere le soluzioni per lo smaltimento dei rifiuti chimico. Utilizzare la piastra direttamente, o conservare a 4 ° C.
    9. Aggiungere 5% albumina di siero bovino (BSA) / PBS-T ai pozzetti ed incubare per 60 min a RT per bloccare i siti di legame aspecifici.
    10. Aspirare la soluzione e sostituirlo con un falloidina coniugata di Alexa-488 (diluizione 1: 160) / soluzione PBS-T supplementato con 0,2% Triton X-100.
      Attenzione: Falloidina-488 è tossico, quindi consulenza MSDS, seguendo le procedure obbligatorie descritte nelle schede tecniche e indossare dispositivi di sicurezza personale appropriato e gestione sotto un armadietto chimico è necessaria.
    11. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e viene quindi incubato per 3 h a RT o durante la notte a 4 ° C.
    12. Aspirare la soluzione e lavare tre volte con PBS. Aspettare 3 minuti tra ogni fase di lavaggio. Raccogliere le soluzioni per lo smaltimento dei rifiuti chimico.
    13. Preparare una soluzione di 1 µ l di colorante Hoechst 33342 (soluzione 1 mg/mL). Per una diluizione di 1: 1000 µ l pipette 1 di Hoechst tingere 3334 a 1 mL di PBS-T e mescolare bene. Aggiungere 300 µ l della soluzione 33342 colorante Hoechst pozzetti e incubare per 10 min a RT nel buio.
      Attenzione: Colorante Hoechst 33342 è un reagente intercalante del DNA e quindi potenzialmente mutagene, pertanto consulenza MSDS, seguendo le procedure obbligatorie descritto nel MSDS e indossare dispositivi di sicurezza personale appropriato e gestione sotto un gabinetto chimico è necessaria.
    14. Aspirare la soluzione e lavare i campioni quattro volte con PBS. Aspettare 3 minuti tra ogni fase di lavaggio. Raccogliere la soluzione per lo smaltimento dei rifiuti chimico.
    15. Per l'incorporamento, rimuovere le pellicole dalla superficie cultura delicatamente e metterli su un vetrino per microscopio. Aggiungere 20 a 40 µ l di mezzo di inclusione solubile acqua al film e allegare un nuovo slittamento del coperchio circolare in vetro sulla parte superiore applicando una leggera pressione.
    16. Eseguire imaging con un microscopio a fluorescenza. Filtri necessari per l'illuminazione: Alexa-488 ha un massimo di eccitazione a 496 nm e la massima emissione avviene a 519 nm. Di conseguenza, il colore di emissione è verde. Hoechst 33342 tintura trihydrochlorid triidrato complessato con DNA ha un'eccitazione massima a 355 nm e massima emissione complessi del DNA avviene a 465 nm.
  5. Determinazione di citotossicità e la determinazione del numero delle cellule
    1. Eseguire l'esperimento con cellule coltivate nei 6 piatti ben preparate al punto 4.3 e preparate nel passaggio 4.1.7 nelle cellule. Le cellule della coltura per 3 giorni a 37 ° C e 5% CO2. Per il controllo positivo, uso di cellule che sono state coltivate su una coltura cellulare trattato superficie polistirene, non contenente nessun film polimerici. Per la determinazione di sfondo (condizione negativa), è possibile ottenere medio da un pozzo senza cellule.
      Nota: Medium può anche essere preso dalle contenente cellule coltivate sulla superficie di polistirolo di cultura trattato delle cellule.
    2. Secondo il numero di campioni sperimentali Etichettare provette da 15 mL.
    3. Aggiungere 40 µ l di una soluzione di PBS contenente 0,9% Triton X-100 per il controllo positivo e mescolare energicamente con una punta di 1000 µ l. Attendere circa 3 min.
    4. Senza rimuovere le cellule attaccate alla superficie, aspirare il mezzo da tutti i campioni, compresi i campioni preparati in 4.5.3 e trasferire il mezzo nelle provette da 15 mL. Aggiungere 3 mL di DPBS- / - singolo dei pozzetti e memorizzare le piastre sotto l'unità a flusso laminare per la determinazione del numero di cellulare come descritto in 4.5.9.
    5. Centrifugare a 200 x g per 3 minuti e rimuovere 1 mL del surnatante per la determinazione dell'attività LDH. Conservare i capillari 15 mL contenenti cellule e rimanente mezzo sotto il flusso laminare.
    6. Per il dosaggio vengono utilizzati un nero a 96 pozzetti con fondo piatto. Aggiungere 50 µ l di reagente CytoTox-ONE 50 µ l di campione medio e mescolare bene per 30 s.
    7. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e conservare per 10 minuti a TA.
    8. Aggiungere 25 µ l della stop solution ad ogni pozzetto e registrare l'intensità della fluorescenza con un lettore di fluorescenza. Agitare la piastra per 10 s e rilevare il segnale di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 520 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 560 nm. Evitare le bolle d'aria.
    9. Per la determinazione dell'aspirato numero cellulare il DPBS- / - dai pozzetti della piastra cultura dal protocollo passo 4.5.4 e aggiungere le soluzioni per le provette di reazione di 15 mL contenente i surnatanti raccolti in numero di protocollo punto 4.5.5.
    10. Centrifugare la provetta di reazione di 15 mL a 200 x g per 3 min e aspirare il surnatante. Aggiungere 0,5 mL di tripsina/EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C.
    11. Aggiungere 2 mL di tripsina/EDTA a pozzetti della piastra ed incubare per circa 10 min a 37 ° C per staccare le cellule dal film polimerici.
    12. La sospensione cellulare viene trasferita nella provetta di reazione di 15 mL dal passo numero 4.6.10. Inoltre, lavare le piastre vigorosamente con siero contenente medio.
    13. Centrifugare i campioni a 200 x g per 3 min, aspirare il supernatante e aggiungere siero contenente mezzo al tubo.
    14. Determinare il numero di cellulare come descritto nei passaggi 4.1.5 e 4.1.6.

Risultati

Nei primi esperimenti, film PDMS con spessore e costante rapporto di 10:1 di miscelazione variabili sono stati fabbricati su pellicole di poliestere (Figura 1). Perché lo spessore dello strato sottostante può influenzare significativamente la rigidezza e la gestione delle proprietà dei film composito intero, negli esperimenti iniziali erano singoli film tra 13 ± 2 µm e 296 ± 13 µm fabbricati (Figura 1). È ben noto, che durante il ritiro di polimerizzazione processo delle pellicole polimeriche si verifica. Per i film più sottili, abbiamo osservato una differenza del 78% ± 3,1% tra condizioni di bagnato e curate. Per le pellicole più spesse, restringimento di 40,9% ± 2,6% è stato rilevato (Figura 1).

Per le applicazioni presentate in questo protocollo, è necessario essere rimosso manualmente dal foglio PET film. Abbiamo riconosciuto che il film particolarmente sottili sono difficili da gestire con il forcipe e sono spesso distrutte durante questo processo. Di conseguenza, abbiamo studiato l'influenza di un sottile poli (alcole vinilico) rivestimento come strato di supporto. PVA possiede un'elevata rigidezza e può essere facilmente rimosso a causa della sua solubilità in acqua nelle applicazioni a valle. Il rivestimento applicato di PVA ha uno spessore di circa 17 µm e pertanto pellicole PDMS rivestite sulla cima di questo strato sono leggermente più sottile rispetto al film senza il rivestimento di PVA (dati non mostrati). Concentrandosi soprattutto sulle proprietà di gestione, concludiamo, che solo il più sottile film richiede un film PVA solidale per la rimozione dal foglio PET.

Uno spessore di pellicola efficace di circa 40 µm è stato selezionato per tutte le ulteriori esperimenti. Per la produzione di film compositi, il rapporto di miscelazione di PDMS è stato variato da 10:1 di 45: 1 e di 70:1 e applicato sopra la pellicola PDMS precedentemente polimerizzata con la tecnica di lama medico (Figura 2A). Fatta eccezione per il rapporto di 10:1, potevano distinguere chiaramente i diversi film mediante microscopia ottica con adeguata precisione. Per l'analisi al microscopio i film erano tagliati con un bisturi e ancorati al bordo di una lastra di vetro. I rapporti di miscelazione superiori dello strato superiore è apparso visivamente più luminosi sulle immagini microscopiche rispetto al rapporto 10:1 del livello di supporto (Figura 2B). Inoltre, microscopia elettronica a scansione è stata utilizzata per l'immagine di campioni ad un ingrandimento di circa 860 X (Figura 2). Una chiaramente osservabile differenza di luminosità tra i due film PDMS, fabbricati in più alti rapporti di miscelazione è stata riconosciuta, in contrasto con il rapporto 10:1. La procedura di taglio lascia segni, visibili nelle immagini SEM (Figura 2B). Basato su questi risultati, lo spessore complessivo medio dei film composito era 112 µm ± 5.0 µm (Figura 2D).

In ulteriori esperimenti le proprietà di adesione di questi film sono state determinate con misure di adesione di forza normale utilizzando due substrati di vetro differenti (Figura 3). Il substrato' liscio' possiede una struttura superficiale con una rugosità media aritmetica Runa di 0.013 ± 0.0002 µm e un medio picco-valle Rz di 0,12 ± 0.004 µm (Figura 3A). Substrato 2 (GS2, designato come grezzo) ha esibito i valori di rugosità di 0,338 ± 0,021 (Run) µm e 2.055 ± 0,017 µm (R-z) (Figura 3B). Con il valore medio è stato calcolato raggio ottenuta in 2.1.4 che l'area della superficie del substrato 'liscio' era di 3,2 mm2 mentre per il substrato 'ruvido' una superficie di 6,07 mm2 .

Con questi due substrati, è stato determinato il comportamento adesivo dei film diversi. Due parametri sono stati scelti per descrivere le proprietà adesive delle pellicole: strappo lo sforzo σmax e il lavoro di separazione Wset. Durante l'intero processo di incollaggio e de-incollaggio la posizione del campione vengono registrate s e la forza normale F. I risultati sono rappresentati in una curva di stress-spostamento (Figura 4).

Per la corretta interpretazione dei risultati sperimentali, è di importanza per allineare con precisione il substrato per la superficie di film polimerici. Inoltre, la conformità della macchina il dispositivo di misura deve essere considerato al fine di correggere lo spostamento. Durante la misurazione della forza applicata agisce non solo sul campione, ma anche su altre parti del dispositivo di prova. Di conseguenza, ciascuno dei due substrati è premuta contro una lastra di vetro con una sollecitazione di compressione di 13 ± 5 kPa. Per misurare la conformità, la curva di carico è tenuta conto, cioè, la parte della curva forza-spostamento dove le due superfici entrano in contatto fino alla posizione di campione dove la forza di precarico esatta è raggiunto. Il reciproca pendenza della curva è uguale alla conformità della macchina C. Il valore calcolato per C è 0,12 µm/mN.

Nel primo esperimento sono stati analizzati film con diversi rapporti di miscelazione di PDMS (Figura 5). Per i film compositi, lo spessore e il rapporto di miscelazione dello strato sottostante, fabbricato di PDMS 10:1 è stata mantenuta costante. Lo spessore dello strato superiore è stata inoltre mantenuto costante con un valore di 65 µm. La sollecitazione massima per il pull-off di 109 ± 27,6 kPa è stata determinata con il substrato di vetro liscio sulla pellicola di 10:1 di PDMS (Figura 5A). Un aumento del rapporto di miscelazione conduce ad una diminuzione dello stress strappo a 76,7 ± 17 kPa per 45: 1 rapporto di miscelazione e 41,4 ± 17 kPa per il rapporto di 70:1. Con lo stress di substrato un pull-off di vetro grezzo di 22 ± 2,2 kPa è stata determinata sulla pellicola di 10:1 di PDMS. In generale, il lavoro di separazione era comparabile fra entrambi substrati di vetro, ad es., 1,4 ± 0.6 J/m2 su film sottili ottenuti con il substrato liscio e 1,84 ± 0,7 J/m2 sul film più sottile ottenuta con il substrato grezzo ( Figura 5B).

Successivamente, la produzione di film sottili per applicazioni di pelle e per la coltura cellulare, le applicazioni sono state esplorate (Figura 6). SSA 50: 50 è stato utilizzato per la produzione di strato superiore dei film composito. PDMS in un 01:10 rapporto di miscelazione con uno spessore di circa 40 µm è stato utilizzato come strato di supporto. In contrasto con i precedenti esperimenti descritto nella Figura 5, lo spessore dello strato superiore era varia, mentre il rapporto di miscelazione è stato mantenuto costante (Figura 6A). SSA è stato selezionato a causa delle sue proprietà adesive nelle applicazioni che coinvolgono allegato alle superfici con elevata rugosità superficiale, specialmente la pelle umana, usando la raccomandazione di produttore di miscelazione rapporto 50: 505,8. Epidermide umana possiede un'elevata rugosità superficiale. A seconda dell'età e anatomico regione che una profondità di rugosità (RZ) tra 48 µm e 71 µm è stato segnalato29. Adesione sicura e delicata della pelle è importante, particolarità per la pelle sensibile dei neonati o difficilmente rigenerante della pelle degli anziani. Sono stati applicati diversi spessori bagnati che vanno da 40 µm, 120 µm, 300 µm a 500 µm (Figura 6A). A seconda dello spessore bagnato, lo spessore totale dei film composito varia tra i 51 µm e 344 µm (Figura 6B). Dopo l'indurimento, il composito sono state allegate alla parte posteriore della mano di un volontario (Figura 6). Gli spessori di film diversi mostrano chiaramente le differenze nelle loro proprietà di adattamento per la rugosità della pelle (Figura 6). Film sottile (50 µm e dello spessore totale di 100 µm) visualizzare un alto tasso di adattamento per le rughe della pelle rispetto alle pellicole più spesse (220 µm e dello spessore totale di 340 µm). Questi risultati indicano che il film compositi con una vasta gamma di spessori può essere prodotto proprio con la tecnica di lama medico applicata.

Esperimenti di adesione sono stati effettuati con questi film compositi (Figura 7). A seconda dello spessore del film superiore SSA, abbiamo osservato una diminuzione dello stress strappo con aumento dello spessore del film. La maggiore forza di strappo di 133 ± 36,6 kPa è stata misurata sul substrato liscio (figura 7A). Il più basso pull-off-stress di 18 ± 4 kPa è stato ottenuto con il substrato grezzo sul film più spesso. È interessante notare che un confronto tra entrambi i substrati rivela una differenza di 2,7 piega sui film più sottile (figura 7A). Con aumento dello spessore del film, soprattutto sui film più grossa nessuna differenza notevole era osservabile (figura 7A). Con il substrato liscio un lavoro di separazione di 1,8 ± 0,8 J/m2 è stato rilevato sul film che esibiscono uno spessore totale di circa 100 µm, seguito da una diminuzione dipendente di spessore di pellicola (220 µm spessore: 1,6 ± 0.6 J/m2 e 330 µm: 1,3 ± 0.4 J/m2 (Figura 7B)). Il lavoro di separazione misurato con le superfici ruvide in generale era leggermente più basso rispetto al substrato liscio (100 µm spessore: 1.63 ± 0.6 J/m2; 220 µm spessore: 1,1 ± 0.6 J/m2 e 330 µm: 1,0 ± 0,2 J/m2 (figura 7B )).

Inoltre, il meccanismo di distacco è stato registrato durante le misurazioni (Figura 7). Piccola cavitazione è stata osservata sul film più sottile, mentre l'aspetto del dito come crepe era osservabile sulle pellicole più spesse (Figura 7).

Misure sono state realizzate entro un mese dopo la produzione delle pellicole. Tuttavia, la stabilità e la conservazione delle proprietà meccaniche dei film elastico potrebbero essere interessati da fattori ambientali, tra cui temperatura e umidità. Come descritto nel protocollo punto 1.4.3, le pellicole sono state archiviate a temperatura e un'umidità del 40-65%. Per evitare loro da contaminazione e polvere, le pellicole sono state archiviate in plastica capsule di Petri nel buio. Per studiare la stabilità a lungo termine, la misure di adesione e la determinazione di spessore di SSA 50: 50 pellicole sono state eseguite circa quattro mesi dopo la fabbricazione. Nessun grande influenza sulla spessore del film, pull-off lo stress e l'opera di separazione è stato rilevato dopo deposito. Per esempio, tirare fuori lo stress dei film composito SSA fabbricato con uno spessore umido di 120 µm SSA e uno spessore umido di 100 µm PDMS era 46,6 ± 6 kPa e il lavoro di separazione 1627 ± 592 mJ/m2 dopo la fabbricazione. Circa quattro mesi dopo la fabbricazione, è stati determinati un pull-off stress di 48,8 ± 5.4 kPa e un lavoro di separazione di 1666 ± 723 mJ/m2 . Inoltre, poco dopo la produzione, lo spessore totale di queste pellicole era 103,3 ± 13.9 µm e dopo deposito 98,1 ± 9,1 µm.

In ulteriori esperimenti PDMS 10:1 e film compositi di SSA 50: 50 con uno spessore totale di circa 105 µm sono stati utilizzati come delle cellule di substrati di coltura (Figura 8). Film composito prodotto nel protocollo passaggio numero 1 può essere facilmente rimosso dal foglio PET e tagliati nelle dimensioni richieste e forme geometriche. Inoltre, quando aderendo il film a una rigida superficiale, per esempio vetro, più film visualizzazione moduli di Young diverse può essere attaccato fianco a fianco e potrebbe essere inserito all'interno di un singolo pozzetto di una piastra di coltura delle cellule. Film potrebbe essere fissati alla superficie di polistirolo direttamente, senza un coprioggetto ulteriore. Inoltre, film potrebbe essere adattato alle diverse superfici e struttura geometrica, come tubi o anelli, consentendo ulteriori studi non realizzabili con materiali di cultura cellulare convenzionale. Negli esperimenti eseguiti raffigurati nella Figura 8 film compositi su fogli di PET sono stati inseriti direttamente in piastre per colture cellulari o pellicole sono state rimosse dal foglio PET e immessi sul vetro vetrini coprioggetto. Per le condizioni sperimentali, alcuni polimeri sono stati trattati con plasma ad aria per aumentare la loro energia libera superficiale. In generale, PDMS possiede un angolo di contatto di acqua di circa 115° prima del trattamento al plasma e diventa altamente idrofilo di post-trattamento (acqua angolo di contatto < 30°)8. Trattamento al plasma rende la superficie biocompatibile e facilita il collegamento delle cellule eucariotiche. A seconda della intensità e durata del trattamento la superficie di polimero è alterata, visualizzazione di un maggior grado di rugosità e crepa potrebbe apparire anche. Immediatamente dopo il trattamento, si osserva un processo di recupero idrofobo. Come descritto nella sezione passaggio protocollo 4.3.5 un goniometro è stato utilizzato per determinare gli angoli di contatto acqua statica. Di conseguenza, polimeri che sono stati collocati in ddH2O per 1 h dopo il trattamento al plasma dell'aria sono stati successivamente analizzati. Trattamento al plasma ha ridotto l'angolo di contatto acqua significativamente (PDMS incontaminate: 117,0 ± 2,2 °; SSA incontaminata: 127,9 ± 5,6 °; Al plasma PDMS: 18.0 ± 7,2 °; Al plasma SSA: 29,3 ± 11,5 °).

Per esempio l'incorporamento di un montaggio acquoso medio è stato applicato. Se in qualsiasi momento i campioni devono essere rimossi nuovamente, i campioni possono essere posizionati in un'acqua contenente di Petri durante la notte. Alla fine, i vetrini possono essere rimossi per ulteriori analisi.

Il comportamento di attaccamento e morfologia delle cellule L929 seminato per 3 giorni su PDMS e SSA 50: 50 film compositi è stata determinata da microscopia di contrasto di fase e dopo colorazione con falloidina conjugati alla fluorescenza-488 e colorante Hoechst 33342 (Figura 8). Acquisizione di immagini con microscopia di contrasto di fase è altamente consigliato, soprattutto per i polimeri non trattati con il plasma. A causa della debole adesione cellulare a queste superfici polimeriche singole cellule o aggregati si staccano facilmente, che complica l'interpretazione corretta dei metodi di analisi successiva.

Cellule seminate su polimeri incontaminati visualizzato povero allegato e cellulare diffusione comportamento (Figura 8A1 e C1) mentre un monostrato confluente è stata osservata per le cellule coltivate sulle superfici trattata al plasma (Figura 8B1 e D1) . La formazione di aggregati cellulari e di distacco dalla superficie era più pronunciata su superfici incontaminate. Visualizzazione dei filamenti dell'actina dopo fissazione con paraformaldeide al 4% ha rivelato alcune cellule migrano in periferia di aggregati cellulari ed emanazione di lamellipodi sporgenze su incontaminate PDMS e SSA 50: 50 film compositi (Figura 8A2 e C2, frecce). Nessun differenze qualitative principali potrebbero essere osservate mentre confrontando entrambi i materiali polimerici. Come nota laterale, sembra che un meno quantità di aggregati cellulari erano presenti su SSA 50: 50 rispetto al PDMS. Inoltre gli aggregati attaccati alle superfici il 50: 50 SSA è apparso che più appiattito (Figura 8 1). Come previsto, il trattamento con plasma ad aria migliorato attaccamento cellulare e diffusione su entrambe le superfici in modo significativo, che porta alla formazione di lamellipodi notevole sporgenze e un monostrato confluente (Figura 8B2 e 2 di 8).

Rilascio di LDH dopo 3 giorni di cultura è stato utilizzato come indicatore per determinare effetti citotossici (Figura 9A). In generale, livelli di LDH erano comparabili per le cellule coltivate su entrambi i materiali polimerici, con meno di 5% citotossicità (PDMS incontaminate: 2,8 ± 2.0%; 50: 50 di SSA incontaminate: 4,5 ± 3,6%; al plasma trattati PDMS: 3,4 ± 1.5%; 50: 50 SSA al plasma trattato: 3,4 ± 1,6%). Questi risultati sono paragonabili ai dati presentati nel nostro studio precedentemente pubblicato, concentrandosi sullo studio di entrambi gli elastomeri. 8 per convalidare ulteriormente i risultati del dosaggio LDH, è stato effettuato un test di esclusione del blu di trypan. Inoltre, la popolazione intera cella è stata determinata per visualizzare le differenze nell'attività di proliferazione (figura 9B). In generale meno di 5% sono state contate le cellule positive di Trypan Blue (PDMS incontaminate: 2,4 ± 0,3%; 50: 50 di SSA incontaminate: 3,8 ± 2,5%; al plasma trattati PDMS: 0.74 ± 1,3% plasma trattati SSA 50: 50: 0.95 ± 1,6%).

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Figura 1: preparazione di PDMS film su poli-(vinyl alcohol) (PVA) foglio di PET rivestito: Il processo per la produzione di pellicole PDMS con spessore variabile su un foglio di PET è stato applicato per determinare la riproducibilità e la gestione delle prestazioni (A). Gli spessori delle pellicole PDMS sono stati analizzati con la microscopia ottica dopo l'indurimento a 95 ° C (B). N = 3 indipendentemente prodotto pellicole sono stati analizzati. Da ogni film, sono stati scelti tre luoghi diversi, taglio e 3 posizioni su ogni campione sono stati analizzati (k = 27). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: preparazione di film compositi di PDMS preparati in diversi rapporti di miscelazione: Film compositi presenti diversi rapporti di miscelazione della base (componente A) al induritore (componente B) di PDMS erano manufactured da tecnica lama medico. Lo strato superiore costituito da PDMS nei rapporti di 10:1 (A:B componente), 45: 1 e 70:1 sono stati applicati sulla cima di una pellicola di 10:1 di PDMS precedentemente curata (A). Dopo l'indurimento successive a 95 ° C spessore dei film composito è stato analizzato da microscopia ottica (B) e microscopia elettronica a scansione (C). N = 3 esperimenti indipendenti sono stati svolti ed analizzati con la microscopia ottica (D). Formare ogni film fabbricati indipendenti, sono stati scelti tre luoghi diversi, taglio e 3 posizioni su ogni campioni sono stati analizzati (k = 27). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: determinazione della rugosità di superficie topografica dei due substrati utilizzati per le misurazioni di adesione: Due substrati di vetro che possiede diverse rugosità superficiale sono stati caratterizzati. Tre dimensionale profilometric analisi della superficie è stata effettuata sul substrato 'liscio' GS (A1) e il substrato 'ruvido' GR (B1). Curve di singola riga corrispondenti sono raffigurate in A2 e B2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: principio delle misurazioni adesione normale: Una configurazione di generazione personalizzata era utilizzata per caratterizzare le proprietà di adesione dei campioni di polimero. La configurazione di misura è raffigurata in (A) e (B) sono illustrati dettagli. Per l'analisi di misura, lo stress è stato determinato da una curva del tempo di sforzo (C). Lavoro di separazione è stato determinato tramite un'integrazione della curva sforzo-spostamento tra sfine e s0 (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: determinazione delle proprietà di adesione di composito film con diversi rapporti di miscelazione di PDMS: Pull-off stress (A) e l'opera di separazione (B) dei film composito prodotto di PDMS nella miscelazione rapporto 10:1, 45: 1 e 70:1 sono stati misurati. Per l'analisi, un 'liscio' vetro substrato (GS) che esibiscono un Ra = 0.013 µm e un substrato di vetro 'ruvido' (GR) con Run = 0.338 µm sono stati usati. N = 3 indipendentemente prodotto pellicole sono stati analizzati. Da ogni film, sono stati scelti due pezzi e tre diverse posizioni su ogni campione sono stati analizzati (k = 18). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: preparazione di film compositi di SSA con spessore variabile: SSA 50: 50 è stato applicato sopra una pellicola di 10:1 di PDMS precedentemente curata (A). Sono stati applicati diversi spessori bagnati di questo strato che vanno da 40 a 500 µm e lo spessore dopo l'indurimento studiati con microscopia ottica (B). Allegato dei film sul retro di una mano visualizzate che pellicole con uno spessore totale di circa 100 µm (pellicola #2) conformato bene alla rugosità della pelle (C) di volontari. Spessore dei singoli strati e lo spessore totale dei film composito sono mostrati in Figura 6B. Per l'analisi n = 3 campioni indipendentemente fabbricati sono stati misurati con la microscopia ottica. Da ogni film, sono stati scelti tre luoghi diversi, taglio e 3 posizioni su ogni campione sono stati analizzati (k = 27). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Barra della scala in 6c raffigura circa 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: determinazione delle proprietà di adesione di composito film dell'adesivo pelle morbida: Film sottili compositi di SSA come strato superiore e PDMS 10:1 come strato di supporto erano manufactured. Lo spessore dello strato superiore era varia tra 50 e 330 µm. Pull-off stress (A) e lavoro di separazione (B) dei film composito misurata con due substrati di vetro differenti sono stati analizzati (un substrato di vetro 'liscio' (GS) che esibisce una Run = 0.013 µm e un substrato di vetro 'ruvido' (GR) con Run = 0.338 µm). Immagini esemplare dei meccanismi di distacco sono visualizzati in C. Per dati analisi n = 3 esperimenti indipendentemente fabbricati sono stati analizzati. Da ogni film, sono stati scelti due pezzi e tre diverse posizioni su ogni campione sono stati analizzati (k = 18). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Barre della scala in 7C raffigurano 0,5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: morfologia cellulare dei fibroblasti L929 coltivate su film sottili: Fibroblasti murini L929 sono state coltivate per 3 giorni su film sottili prodotte da PDMS (A1, A2, B1, B2) o SSA (C1, C2, D1, D2). Per aumentare l'idrofilia delle superfici aria trattamento al plasma è stato eseguita (B1, B2, D1, D2). Barre della scala in D1 e D2 raffigurano 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: determinazione della proliferazione di citotossicità e cellulare: Per la determinazione degli effetti citotossici e proliferazione cellulare, L929 cellule sono state seminate per tre giorni il PDMS 10:1 e SSA 50: 50 film composito. Rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) è stato determinato mediante un test di attività LDH e rivelato meno del 5% citotossicità (A). Numero totale delle cellule dopo il periodo di coltivazione è stata valutata dopo manuale contando le singole celle con una camera di Neubauer (B). N = 3 eseguite in modo indipendente gli esperimenti sono stati analizzati. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La progettazione di strutture in composito consente la semplice regolazione delle proprietà dei materiali, come il modulo di Young o lo spessore dei campioni. Il modulo di Young di PDMS può essere cambiato in modo efficace in una vasta gamma alterando il rapporto di miscelazione tra i due componenti o fabbricazione di miscele utilizzando un diverso in silicone elastomero30,31. I metodi descritti non sono limitati al PDMS utilizzato nella presente inchiesta, ma soprattutto la prestazione adesiva dipende fortemente il tipo specifico utilizzato. Un passaggio fondamentale nell'ambito di questo protocollo è il processo di produzione dei film composito (Figura 1). È stato dimostrato che lo spessore dei film incide considerevolmente il comportamento di adesione dei film su diversi substrati, tra cui la pelle (Figura 5 e Figura 6). Oltre lo spessore del film, ora e temperatura durante il processo di polimerizzazione riguarda la proprietà del materiale32. Pertanto, parametri come lo spessore degli strati polimerici devono essere attentamente adattato e verificato.

Analisi delle proprietà adesive delle pellicole sottili è stata eseguita con misure di adesione di forza normale utilizzando due substrati di vetro con diverse rugosità fino a Ra = 0.338 µm (Figura 3). In generale, la rugosità influisce significativamente l'adesione delle superfici, soprattutto di materiali elastici33,34. La rugosità di vetro può essere facilmente variata di levigatura con carta vetrata di dimensioni diverse asperità, consentendo quindi la realizzazione di substrati esibendo i più alti valori di rugosità21. In aggiunta, altri materiali, ad esempio resina epossidica può essere utilizzata per la produzione di substrati15,35. Questo potrebbe essere una strategia importante modifica del protocollo presentato. Ad esempio, se substrati che esibiscono diverse superficie libera energie sono necessari o specifiche Topografie sono necessarie. Qui, pull-off stress e lavoro di separazione delle pellicole sottili prodotte di PDMS e SSA sono stati analizzati con un programma di installazione su misura (dispositivo di misurazione macroscopica adesione (MAD, Figura 4)). 36 l'allineamento ottico del substrato e penetratore è un passo fondamentale per l'analisi dei risultati delle misurazioni. Di conseguenza, regolazione dell'angolo di inclinazione deve essere eseguita con il goniometro, più preciso possibile. Ciò può essere ottenuto con sufficiente precisione manualmente portando il substrato a contatto con la superficie della pellicola fino a quando si ottiene un contatto orizzontale.

Nel protocollo attuale il tempo di attesa è stato mantenuto costante a un secondo (Figura 5 e Figura 7). Soprattutto per la ricerca delle prestazioni adesiva di un film elastico per una superficie di substrato grezzo, un'estensione del tempo di attesa fornisce informazioni aggiuntive. Ad esempio, un aumento nello sforzo di strappo con l'aumento del tempo di attesa è stato segnalato8. Oltre le misure eseguite nel protocollo attuale, altri metodi, ad esempio peel test potrebbe essere effettuato, permettendo una più vasta inchiesta di adesione prestazioni37.

Le proprietà adesive del film compositi che esibiscono differenti della pellicola sono stati determinati spessori dell'adesivo pelle morbida (Figura 7). I nostri risultati sono in linea con i dati pubblicati, che con un decremento di piombo di spessore di pellicola ad un aumento dello stress pull-off come il confinamento, cioè, il rapporto tra diametro e pellicola spessore del substrato, aumenti38,39 . Basato su questi risultati e i dati rappresentati in Figura 7, concludiamo che film compositi con uno spessore totale di circa 100 µm (spessore dello strato SSA di circa 60 µm applicato ad una pellicola PDMS con uno spessore di circa 40 µm) esibiscono favorevole adesione p roprietà su superfici ruvide.

Successivamente, sul film compositi incontaminate sono stati eseguiti esperimenti relazionati alla caratterizzazione biologica e trattate al plasma film compositi (Figura 8). Trattamento al plasma di elastomeri di silicone è una tecnica versatile, spesso applicata per aumentare le proprietà idrofile di superfici e promuovere attaccamento cellulare e cellulare diffusione40,41. Siliconi sono ben noti per la loro bassa tossicità e biostabilità alta ma possono contenere di monomeri residui o catalizzatori in grado di influenzare processi fisiologici, che conduce anche a citotossicità42,43. Nell'esperimenti condotti abbiamo osservato a meno di 5% citotossicità con rilascio di LDH come un indicatore e un test di esclusione del Trypan Blue. Nel protocollo presentato, l'intera popolazione cellulare, tra cui aggregati cellulari indipendente forma che la superficie è stata analizzata per analisi di proliferazione (figura 9B). Una modifica del protocollo potrebbe produrre risultati più differenziati. Per ciascun campione, il supernatante contenente aggregati cellulari indipendenti potrebbe essere trasferito in una provetta di reazione separata e non combinato con le cellule enzimaticamente rimosse dalla superficie del polimero. Ciò consente l'esatta determinazione delle cellule attaccate alla superficie e alla fine rivelano una più dettagliata valutazione dell'influenza dei polimeri sul processo di adesione cellulare. Oltre ai metodi di immunocytochemical ha presentati qui, le cellule potrebbero essere raccolte per indagine con metodi di immunoblot, permettendo una valutazione quantitativa dettagliata dell'espressione della proteina.

In sintesi, abbiamo stabilito le condizioni di produzione per la produzione di film sottili di compositi elastomerici per applicazioni in ricerca della coltura avanzata delle cellule. Inoltre, questi film sottili possiedono alta adattabilità alla pelle rugosità, consentendo il sofisticato design degli adesivi di pelle.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Martin Danner è riconosciuto per la sua assistenza nella preparazione di campioni e istituzione di procedure di coltura delle cellule. Gli autori vorrei ringraziare Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Amburgo, Germania), soprattutto Robert Radsziwill per il continuo supporto e discussioni. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP/2007-2013) convenzione di sovvenzione CER n. dell'Unione europea 340929.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Propanol, 97%Stockmeier Chemie1000452610000Isopropanol
Abrasive diamnod hand padBohleMO 5007522Grit: 220
AccutaseCapricorn ScientificACC-1B
Albumin Fraktion VRoth0163.2BSA
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFischer ScientificA12379highly toxic
AquamountPolysciences18606-20water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity AssayPromegaG7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ThermoFischer Scientific14190094
Fetal bovine serum goldGE Health Care Life ScienceA15-151FBS
Goniometer OCA35Dataphysicsfor the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342Sigma-AldrichB1155-100MGbisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25ZeissMicroscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100NDNikonMicroscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16%Electron Microscopy SciencesRT 15710electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solutionSigma-AldrichP4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM)Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000Sigma-Aldrich81381-1KGMowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184Dow Corning(400)000108351397PDMS
RPMI 1640 basal mediumThermoFischer Scientific21875034
soft skin adhesive (SSA)Dow Corning(400)000108251792MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-PHauschild
stylus profilomterZeissModel: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 proTecanfluorescence plate reader
Triton X 100Calbiochem648466
Trypan Blue solutionSigma-AldrichT8154-100MLhighly toxic
Trypsin/EDTA solutionPAN-BiotechP10-0235000.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glueBohleBO MV76002medium viscosity

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