Micropuntura dello spazio di Bowman in topi nei paraggi 2 Photon microscopia

Riepilogo

Vi presentiamo uso di microscopia di 2 fotoni per posizionare una micropipetta all'interno dello spazio urinario di Bowman in topi, che unisce 2 tecniche fondamentali della fisiologia renale. Uso di microscopia di 2 fotoni supera i limiti critici di microscopia convenzionale per micropuntura studi di fisiologia renale.

Abstract

Micropuntura renale e la formazione immagine renale 2 fotoni sono tecniche seminale in fisiologia renale. Tuttavia, micropuntura è limitata dalla dipendenza da microscopia convenzionale alle caratteristiche superficiali del nefrone e studi 2-fotone sono limitati in quanto gli interventi possono essere valutati soltanto presso l'organo, piuttosto che il livello del nefrone. In particolare, Micropuntura studi dei glomeruli dei topi sono stati contestati dalla scarsità di superficie dei glomeruli in topi. Per risolvere questa limitazione al fine di perseguire gli studi dell'aspirato dallo spazio di Bowman in modelli murini di fisiologica, abbiamo sviluppato 2-fotone micropuntura glomerulare. Vi presentiamo una romanzo preparazione chirurgica che consente l'accesso laterale al rene, preservando la colonna verticale richiesta di imaging per microscopia 2-fotone. Amministrazione di alto peso molecolare isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano è usato per rendere il sistema vascolare renale e quindi dei glomeruli visibili immagini 2-fotone. Una pipetta di quantum dot-rivestito è quindi introdotto sotto guida stereotassica per un glomerulo selezionato da molti a molti che possono essere visualizzati all'interno della finestra di imaging. In questo protocollo, forniamo dettagli della preparazione, materiali e metodi necessari per eseguire la procedura. Questa tecnica facilita in precedenza impossibili studio fisiologico del rene, compreso il recupero del filtrato dallo spazio di Bowman e tutti i segmenti del nefrone entro il limite di profondità imaging, circa 100 µm sotto la capsula renale. Pressione, di carica e di flusso possono tutti essere misurati utilizzando la pipetta introdotta. Qui, forniamo dati rappresentativi da liquida cromatografia/spettrometria di massa eseguita su aspirato dallo spazio di Bowman. Ci aspettiamo che questa tecnica per avere ampia applicabilità nell'inchiesta fisiologica renale.

Introduzione

Lo scopo di questa procedura è quello di fornire routine micropuntura accesso allo spazio di Bowman e altre strutture glomerulari in topi. Micropuntura studi per fisiologia renale sono stati limitati a 1-fotone microscopia, che può solo l'immagine all'interno di pochi micron della superficie del rene, e che offre precisione limitata nella dimensione z. Perché i topi hanno pochi glomeruli di superficie, non è sempre possibile trovare un glomerulo superficie da microscopia 1-fotone, quindi maggior parte Micropuntura studi effettuati nei ratti di Munich-Wistar, che sono più numerosi dei glomeruli superficiali. Di conseguenza, i vantaggi di lavorare in modelli murini sono stati limitati in Micropuntura studi^1,2,3. Gli avanzamenti recenti nella formazione immagine di tecnologie, tra cui micro-CT^4,5, nanoparticelle imaging⁶e imaging spettrometria totale⁷ notevolmente hanno aumentato la gamma di modalità applicabili alla fisiologia glomerulare, ma C'è ancora nessun sostituto per l'unica possibilità di intervenire e assaggiare quel micropuntura offre. Quindi estendere l'uso di micropuntura utilizzando le tecniche qui presentate dovrebbe facilitare studi di fisiologia renale romanzo, in particolare, valutazione del contenuto del filtrato renale (cioè, metabolomica) e fisiologia di base di topi transgenici, quali misure di pressione filtrato e carica, precedentemente svolti solo nei ratti.

In questa tecnica, uso di 2 fotoni microscopia consente la visualizzazione e accesso micropipetta a strutture renali fino a circa 100 µm sotto la capsula renale. Multiple (5 – 10) glomeruli sono pertanto accessibili a micropuntura in ogni rene del topo finora imaged. Sebbene questa tecnica condivide alcune caratteristiche con micropuntura renale convenzionale, è stato progettato de novo e profonde modifiche da tecnica convenzionale sono necessari. In questo protocollo dimostriamo aspirazione di liquido dallo spazio di Bowman e Visualizza esempio risultati di successiva analisi con spettrometria di massa (nanoproteomics)^8,9,10,11. Uso a valle della spettrometria di massa richiede un flusso di lavoro di preparazione di campione specializzati, che si è dimostrato anche qui.

Protocollo

Tutte le procedure descritte nel presente documento sono state approvate dall'istituzionale Animal Care e Comitato Use of Oregon Health & Science University.

1. programma di installazione utilizzato per la dimostrazione

1. Utilizzare un microscopio dritto 2-fotone, un controller di fase 3 assi, un titolare di headstage/pipetta e un controller 3 assi per il titolare di headstage/pipetta; tutti e quattro questi elementi è obbligatori.
   Nota: Molte configurazioni simili sono disponibili e saranno sufficiente, purché indipendente controllo quantitativo di 3 assi della pipetta e microscopio tappa sono disponibili, e il microscopio è impostato per in vivo imaging in posizione verticale.

2. materiali necessari prima di iniziare i protocolli sperimentali

1. Utilizzare FITC-Destrano, Da 2.000.000, soluzione al 5% in soluzione salina o soluzione tampone fosfato iniettabile retroorbital contrassegnare il sistema vascolare renale. Questo peso molecolare (MW) è selezionato perché rimane nel sistema vascolare e non filtra.
2. Macchina-tirato in vetro borosilicato Micropipette: tirare micropipette a 6 – 10 µm punta utilizzando impostazioni di punta lunga-cono, chiuso (ad es., calore = 610, velocità = 150, tempo = 250 ms, loop) su un estrattore micropipetta. Smusso a 45° e fiamma-polacco leggermente.
3. Rivestimento di punto quantico di micropipette: cappotto suggerimenti micropipetta con punti quantici secondo il protocollo di riferimento. ¹²
4. Polisilossano rene supporto/distanziatore. Utilizzare stucco polisilossano alle imbarcazioni un rene supporto/distanziatore. Moda un 1x1 cm² da 5 mm spessore ad angolo retto romboide (cioè, un cubo troncato) da polisilossano putty. Rimuovere il 70% medio di polisilossano da un bordo e un cerchio composto da circa il 70% del centro il romboide. Consentire il polisilossano ad asciugare per 24 h. Vedere la Figura 1.
5. Preparazione microinjector: Prefill una lunghezza di tubi di polietilene (PE)-50 e il titolare della micropipetta micropipetta-caricato con olio. Se è prevista la spettrometria di massa, perfluorodecalina è necessario, in caso contrario può essere utilizzato olio minerale. Impostare il microinjector con una siringa Hamilton-tipo a tenuta di gas e il riempimento con perfluorodecalina. Questo sarà collegato alla tubazione PE-50 e dispensare titolare.
6. Inserire la pipetta nel porta-pipetta e avanti riempire i tubi di PE-50 e pipetta, quindi collegare l'estremità prossimale del PE-50 tubi alla siringa Hamilton riempito di olio, la creazione di un sistema idraulico dalla pipetta alla siringa.

3. laterale pipetta accesso al rene sotto un fluido colonna tramite una procedura chirurgica novella di Imaging

Nota: Il montaggio del sistema di imaging supporto e preparazione chirurgica è illustrato nella Figura 1. La procedura descritta viene eseguita su topi C57BL/6, 20-25 g di peso.

1. Pesare il mouse.
2. Inducono anestesia utilizzando 4% isoflurane e mantenere con isoflurano 1,5 – 2,5% nella miscela di aria/ossigeno. Confermare che il mouse è anestetizzato da assenza di risposta a stimolo doloroso e ridotta frequenza respiratoria.
3. Lubrificare gli occhi e posizionare l'animale laterale su una piastra di base. Immobilizzare 4 estremità con del nastro.
4. Iniettare la soluzione salina normale, 200 µ l, per via sottocutanea e posizionare una sonda di temperatura rettale. Controllo temperatura utilizzando una lampada di riscaldamento durante la chirurgia e un rilievo di riscaldamento durante l'imaging.
5. Rimuovere tutti i capelli sul lato sinistro del mouse usando una crema depilatoria.
6. Individuare la milza, che è visibile sotto la pelle, e individuare il rene di sinistra sul lato dorsale e caudale della milza.
7. Fare un'incisione di 0,5 cm sulla pelle e più piccola incisione sul peritoneum, appena sufficiente per il rene per far passare facilmente.
8. Estrudere il rene con una leggera pressione. Posto Rene stabilizzatore figura fatta con polisilossano intorno al rene e correzione con adesivo cianoacrilato. Linea del rene con il distanziatore tale che la superficie laterale-la maggior parte del rene si estende oltre lo stabilizzatore di circa 1 mm.
9. Fissare una piastra di testa al modulo stabilizzatore con colla e montare la piastra di testa per barre di montaggio sulla piastra di base.
10. Riempire il pozzetto del supporto di polisilossano che circonda il rene con la soluzione di agarosio 1% e adagiarvi il coprioggetto di 10 mm e tenere finché dell'agarosi sono ferma. Guarnizione vetrino coprioggetti alla piastra di testa con colla e creare un anello attorno il coprioggetto con cemento dentale.
11. Iniettare retrò-orbitally FITC-Destrano (Da 2.000.000, soluzione al 5%, 100 – 150 µ l) e muovere la piastra mouse e fissazione alla fase 2-fotone microscopio rapidamente, mantenere l'anestesia e assicurando un'adeguata rifiuti sulla fase di microscopio di evacuazione dei gas.

4. selezione di un glomerulo adatto e pipetta accesso allo spazio di Bowman

1. Definizioni:
   1. Definire X come sinistra-destra sullo schermo e sinistra-destra di fronte al microscopio
   2. Leggere SX (fase X) dal controller di fase
   3. Definire PX come pipetta X, la pipetta del dial controller
   4. Definire Y come up-down sullo schermo e in avanti verso il microscopio e indietro verso il programma di installazione di 2-fotone
   5. Definire la Z come in su verso il soffitto, giù verso il pavimento e misurato sul palco con la posizione di obiettivo Z.
   6. Definire S (O) Z come l'altezza di fase (davvero l'obiettivo).
2. Trovare la superficie del rene, identificabile utilizzando le impostazioni del filtro di proteina fluorescente verde (GFP) in quella dell'oculare. A causa dell'iniezione di FITC-Destrano, sistema vascolare sarà verde brillante.
   1. Identificare un glomerulo adatto. Dopo aver individuato la superficie del rene usando l'oculare, passare a 2 fotoni (modalità non-scansione) ed esplorare la finestra di imaging. Caratteristiche favorevoli per micropuntura sono i seguenti: distanza verticale sotto il vetrino coprioggetto > 30 µm (per evitare la collisione tra la pipetta e il vetrino coprioggetti durante l'accesso) e distanza dalla capsula renale laterale per il glomerulo laterale < 400 µm (oltre questa distanza la deviazione della pipetta può aumentare la probabilità di una miss).
3. Punto di registrazione laterale e verticale distanza per la puntura, un punto sulla capsula renale direttamente al lato di pipetta del glomerulo.
4. Sollevare il punto focale obiettivo nella colonna d'acqua, mantenendo la x e y coordinate invariato, solo circa un centimetro di distanza.
5. La punta della pipetta nella colonna d'acqua e girare su 4', 6-diamidino-2-fenilindol di eccitazione (DAPI). Spostare la pipetta in x e y dimensioni fino al punto di massima fluorescenza della punta, questo sarà il centro dell'obiettivo. Trovare la pipetta in oculare è difficile senza questo preciso preposizionamento. Perché punti quantici reagiscono alla lunghezza d'onda stessa (in questo caso, rosso) indipendentemente dalla lunghezza d'onda di eccitazione, l'eccitazione di DAPI produce fluorescenza rossa che è focalizzato sulla punta, illustrato nella Figura 2.
6. Modificare l'impostazione di eccitazione di proteina fluorescente rossa (RFP) e visualizzare la pipetta in oculare, quindi esso centrare con precisione nella vista oculare.
7. Passare a 2 fotoni e trovare la pipetta sotto 2-fotone, collocandolo proprio nel centro dell'immagine. Questa è la posizione di registrazione.
8. Salvare un'immagine della pipetta.
9. Registrare il palco e le coordinate di controller micropipetta.
   Nota: Utilizzare il file. html supplementare, che eseguirà calcoli utilizzando codice JavaScript, (vantaggioso su sistemi che non dispongono di software del foglio elettronico installato) o un foglio di calcolo per calcolare l'offset tra palco e pipetta coordinate e a calcolare le coordinate di destinazione per il controller di pipetta.
10. Togliere la pipetta dalla colonna d'acqua nell'asse x, mantenendo z e y la stessa.
11. Spostare la pipetta Z il glomerulo di destinazione Z (i.e., spostare la pipetta verso il basso nella direzione Z sotto il vetrino coprioggetti)
12. Spostare la pipetta Y la coordinata del glomerulo Y di destinazione.
13. Spostare il 2-fotone live view per il glomerulo di destinazione Z e poi per il bordo del rene e notare la SX.
14. Calcolare il bordo di rene PX utilizzando l'offset dalla registrazione SX.
15. Spostare la tappa verso la pipetta (aumento la SX) tale che il bordo del rene è più a sinistra dello schermo, ma ancora visibile.
16. Far avanzare rapidamente la pipetta a circa 100 µm a meno che il bordo di rene PX calcolato in precedenza.
17. Individuare la punta della pipetta, avanzando lentamente la pipetta. Aumentare il guadagno di rosso e osserva l'istogramma pixel rosso (turni distribuzione di pixel prima la pipetta è ripreso nella finestra, a causa della estrema luminosità di punti quantici e fluorescenza fuori bersaglio).
18. Avanzare fino al bordo del rene sotto di immagini dal vivo 2-fotone.
    Nota: Prima di entrare la capsula renale, è possibile reindirizzare la pipetta nella dimensione Y e Z. Tuttavia, questo può rompere la punta della pipetta. Una misura più conservatore, se la pipetta è fuori target, è di ritirarsi nella dimensione X, fino a 2 cm, redirect e poi tornare nella dimensione X al bordo del rene. Una volta che la pipetta è all'interno del tessuto, movimento in qualsiasi asse diverso da X conduce alla flessione di pipetta che richiede una grande esperienza per fare uso di e spesso conduce alla rottura.
19. Guidare la pipetta nell'asse X lentamente alla destinazione glom PX, tenendo d'occhio la SX. (È utile di tanto in tanto tornare al glomerulo per vedere se è spostato a tutti al momento dell'inserimento della micropipetta).
20. Quando si è nella posizione corretta, posizione del documento con un z-stack.
    Nota: Con la micropipetta in luogo, farmaci, proteine o traccianti fluorescenti possono essere iniettati, il liquido può essere aspirato per un'analisi successiva o pressione o carica rispetto a un altro elettrodo può essere misurata.

5. aspirazione di liquido dallo spazio di Bowman

1. Impostare la micropompa per iniettare 100 nL di perfluorodecalina in 2 minuti per garantire la pervietà della pipetta e ridurre la confusione da pipetta collegare durante l'immissione. Creare una nuova immagine per assicurare una posizione pipetta.
2. Attendere 4-6 min per ulteriore filtraggio.
3. Impostare la micropompa per aspirare fino a 300 nL a una velocità di fino a 50 nL/min.
   Nota: Cambiamenti nella morfologia glomerulare non sono osservati con questo ritmo, suggerendo che non altera il tasso di consegna di liquido nello spazio durante l'aspirazione. Come non c'è nessun blocco di olio come micropuntura convenzionale, recupero di questo volume, necessario per la spettrometria di massa, potrebbe includere alcuni dei perflourodecalin iniettato e possibilmente tubolare fluido. Per i dosaggi quali spettroscopia di fluorescenza di misurazioni dell'elettrodo ione-sensibili, reazione a catena della polimerasi e altri endpoint sensibili, possono essere utilizzati i volumi inferiori. Se non la spettrometria di massa è l'endpoint, olio minerale e tecniche di micropuntura standard utilizzabile per misurare il volume aspirato prima dello stoccaggio.
4. Ancora una volta l'immagine.
5. Ritirare la pipetta e conservare il campione, l'aggiunta di tampone TRIS e conservare a-80 ° prima dell'analisi.
6. Eutanasia il mouse usando un sovradosaggio di isoflurano o altro metodo approvato.
   Nota: Filtrato entra nello spazio mediante filtrazione dai capillari glomerulari. Il tasso di filtrazione glomerulare singolo-nefrone (SNGFR) in topi è segnalato tra 8 – 14 nL/min³ forze di Starling regolano SNGFR, tuttavia, e pressione idrostatica negativa nello spazio di Bowman, pertanto, può aumentare SNGFR. Metodi standard micropuntura utilizzano blocco tubolare con olio e pressione neutra per tubolare campionamento fluido, ma questi composti interferiscono con spettrometria di massa (Vedi sotto); Pertanto, in questa tecnica il tubulo prossimale precoce rimane brevetto. Inoltre, al momento dell'aspirazione, spazio di Bowman contiene uno sconosciuto, ma positivo volume del filtrato. Pertanto, il tasso di aspirazione fluida può superare SNGFR.
   Nota: Negli esperimenti descritti qui, l'obiettivo era di ottenere una più grande rispetto al solito campione del filtrato glomerulare per analisi di spettrometria di massa mediante tecniche nanoproteomic. Poiché l'uso della spettrometria di massa preclude l'uso di blocchi di olio con olio minerale o cera (miscele complesse di molecole organiche che riducono il segnale: rumore in spettrometria di massa) perfluorodecalina viene utilizzato per riempire la micropipetta e siringa. Perflourodecalin non è nota per bloccare il flusso tubulare, ma è biologicamente inerte e non interferisce con la spettrometria di massa.

Risultati

Questa procedura richiede una preparazione unica chirurgica del rene per immagini 2-fotone e l'accesso, che è illustrata nella Figura 1. Questa preparazione mostrata qui permette una colonna verticale di imaging con l'obiettivo sopra il rene con pochi cambiamenti di densità per l'ottica migliore per microscopia 2-fotone contemporaneamente con accesso laterale per la pipetta, guidata esclusivamente in orizzontale (x ) dimensione. Estrusione parziale del rene impedisce una tensione eccessiva sul pedicle renale e conserva il flusso vascolare, e la costruzione di un supporto personalizzato renale consente i due obiettivi di formazione immagine e l'accesso. La seconda sfida in questa procedura è un posizionamento preciso della pipetta all'interno del rene in 3 dimensioni, che richiede la registrazione dei sistemi di coordinate pipetta e fase. Il passaggio fondamentale per questo processo è illustrato nella Figura 2, che mostra la pipetta essere notata nella colonna d'acqua del microscopio 2-fotone sotto DAPI-eccitazione. Entrando nella colonna d'acqua e registrare le coordinate della pipetta a quelli della fase prima di entrare il rene è fondamentale per consentire un posizionamento preciso stereotactic della pipetta all'interno dello spazio di Bowman di destinazione. La pipetta entra nella colonna d'acqua imaging dalla destra. Con l'eccitazione di DAPI acceso, la pipetta rivestite con puntino rosso quantistica brilla fluorescente in rosso-arancio, e può essere accuratamente posizionato sotto la metà dell'obiettivo. Come il fascio di eccitazione passa attraverso il centro dell'obiettivo, la pipetta può essere spostata liberamente fino al punto di massima fluorescenza, assicurando che sarà visibile nell'oculare.

Pipetta corretta tirando e glomerulo selezione sono fondamentali per il successo di questo protocollo, come illustrato nella Figura 3, Figura 4, Figura 5. In Figura 3A, una micropipetta di vetro rivestite con puntino di quantum correttamente tirato, rosso-fluorescente imaged nella colonna fluida durante la parte di registrazione pipetta della procedura può essere visto. La punta è 6 micron di larghezza. Nella Figura 3B, viene mostrata una pipetta male tirato con 12 µm punta. Questa pipetta non può penetrare la capsula renale senza causare trauma vascolare a causa delle 12 µm di diametro e superficie irregolare punta (nota la fresa nella parte superiore della smussatura). In Figura 3 e 3D, è mostrato l'importanza di ottimale posizionamento piuttosto che di imaging del glomerulo destinazione. Il glomerulo bello, vicino alla superficie, illustrato nella Figura 3 dimostra favorevole imaging (grazie alla sua posizione superficiale a 20 µm sotto la capsula renale), ma non sarebbe adatto per l'accesso da questa procedura perché è troppo vicino alla superficie, e la pipetta avrebbe colpito il vetrino coprioggetti. In Figura 3D, posizionati in modo ottimale glomeruli sono mostrati. Notare la diversa scala usata per illustrare entrambe glomeruli (barre della scala sono tutti 50 µm). Questi glomeruli appaiono meno forte a causa della rifrazione causata dalla profondità; Questa immagine è stata scattata a 70 µm sotto la capsula renale. Il bordo laterale del rene è 250 µm a destra, entrambi di questi glomeruli rendendo accessibile. Durante la procedura di accesso, imaging è focalizzato sul glomerulo di destinazione come illustrato nella Figura 4e acquisizione di immagini ogni secondo viene utilizzato, che permette al ricercatore di osservare con precisione di posizionamento della pipetta nello spazio di Bowman.

La figura 4 illustra una tipica voce renale e il risultato, un puntale all'interno dello spazio di Bowman. In Figura 4A, una proiezione di intensità media da un z-stack con viste ortogonali dimostra la punta della pipetta nello spazio di Bowman. Si noti che c'e ' rosso pipetta punta spettrale artefatto (palla rotonda di fluorescenza) a causa della fluorescenza estremamente luminosa dei punti quantici organizzato sulla sezione conica della punta. In Figura 4B, una proiezione di volume di dati dello stack z dimostra un'altra pipetta nello spazio di Bowman. Si noti che la pipetta trascinato capsula di Bowman in senso di marcia sulla voce, creazione di apparente tenting dietro la punta come descritto nel protocollo.

In Figura 5, i risultati di una procedura non riuscita sono mostrati in cui una pipetta con un'apertura troppo grande si è rotto la capsula renale, che causa lo spurgo. La pipetta è stato troppo brusco; il tentativo di passare la capsula renale, la capsula è stato spinto davanti la punta della pipetta fino a rottura si è presentato. In questa immagine, la capsula renale è visibile, impreziosita da subcaspular sanguinamento, in verde fluorescente FITC. FITC segnale è visibile all'interno della pipetta stessa, che indica che il sangue sotto pressione immesso il lume di pipetta. La freccia indica molti globuli rossi visibili all'interno del lumen di pipetta come riempimento di difetti in FITC-Destrano.

Figura 6 raffigura uno spettro di massa rappresentativo ottenuto da aspirato di spazio di Bowman, proteina urinaria del mouse 17 (MUP17). Infine, nella tabella 1 viene illustrato risultati di esempio delle procedure di aspirazione successo, inserzione proteine identificate mediante spettrometria di massa su scala nanometrica su aspirato raccolto oltre 6 minuti da ciascuno dei 3 topi. In ogni caso, la pipetta era imaged come esso è stato ritirato dallo spazio di Bowman, e nessuna fluorescenza FITC è stata osservata entro lo spazio di Bowman o il lume di pipetta, che indica mancanza di contaminazione aspirato con il plasma. 17 proteine, principalmente di basso peso molecolare, sono state identificate da un minimo di 2 peptidi unici per proteina. Conta spettrale sono basso, in linea con le stime precedenti di proteine nel filtrato glomerulare, e noto proteine filtrate, come proteina di legame della vitamina D (VTDB), albumina (ALBU) e proteina urinaria maggiore 17 (MUP17) sono presenti.

Figura 1: estrusione parziale del rene con supporto personalizzato e immobilizzazione per accesso laterale. Sulla sinistra, sono visualizzate le parti del supporto dell'imaging colonna e rene, con l'assemblaggio completo nel centro. Sulla destra, la preparazione del rene viene mostrata prima (sopra) e dopo (sotto) applicazione del supporto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: completata la preparazione del rene in fase di registrazione di pipetta del protocollo. Qui, l'eccitazione DAPI sta usanda per posizionare la micropipetta all'interno della colonna di acqua del microscopio del fotone 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging di pipette e il rene dopo l'iniezione di FITC-Destrano, dimostrando glomeruli adatti e non adatti per micropuntura. R. una pipetta ben tirata con 6 µm punta. B. una punta taglio grezzo, smussata. C. questo glomerulo è ben definito, ma troppo vicino per il coprioggetto per micropuntura. D. Opportunamente posizionato dei glomeruli. Barre della scala sono tutti 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: pipetta riuscito passaggio conduce al collocamento in spazio-vista di Bowman da 2 diverse procedure. R. Z-stack con proiezioni ortogonali dimostra puntale nello spazio di Bowman che intestano il ciuffo glomerulare. Barra della scala è 50 µm. B. Rendering di volume da z-stack viene illustrato allo stesso modo una pipetta nello spazio di Bowman che intestano il ciuffo glomerulare. Barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: una procedura non riuscita a causa di una pipetta smussata, strappando la capsula renale e causa di emorragia nel lumen pipetta. Fluorescenza di FITC da extravasated plasma e globuli rossi (freccia) sono visibili all'interno della pipetta. Freccia rivolta ai globuli rossi visibili all'interno del lumen di pipetta. Barra della scala è 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: lo spettro di massa principale proteina urinaria 17 (MUP17), ottenuto dalle analisi di spettrometria di massa/cromatografia liquida su scala nanometrica di aspirato spazio di Bowman. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Proteina	MW (kD)	Significa spettrali totali
ACTA_MOUSE	42	2
ACTB_MOUSE	42	1
CLPX_MOUSE	69	2.5
DHSA_MOUSE	73	1
FOLR2_MOUSE	29	1
GBLP_MOUSE	35	1
ALBU_MOUSE	66	6.7
HBA_MOUSE	15	2
HBB1_MOUSE	16	1
MIB1_MOUSE	110	1
MUP17_MOUSE	21	1
PERI_MOUSE	54	1
RNAS4_MOUSE	17	2
SPTB1_MOUSE	2	1
VIME_MOUSE	54	1
VTDB_MOUSE	53	1

Tabella 1: Elenco delle proteine identificate in aspirato spazio di Bowman da 3 topi.

Supplementare Video 1: un rendering di volume da uno z-stack acquisito dopo una pipetta di posizionamento nello spazio di Bowman dimostra la punta della pipetta all'interno dello spazio, che intestano il ciuffo capillare. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Presentiamo un metodo per accedere allo spazio di Bowman dei glomeruli non superficiali nei topi, facilitati dalla microscopia 2-fotone. Abbiamo sviluppato questa procedura per risolvere una limitazione chiave di micropuntura glomerulare, la rarità dei glomeruli superficie indirizzabili tramite microscopia 1-fotone in topi, al fine di agevolare un obiettivo sperimentale, aspirazione di liquido dallo spazio di Bowman per analisi successiva. Sviluppo e pratica di questa tecnica si basa su sei fasi critiche. In primo luogo, il romanzo preparazione chirurgica deve essere accuratamente effettuata affinché la colonna d'acqua imaging non colano il vetrino coprioggetto e il vetrino coprioggetti si estende sopra la zona del rene che è l'obiettivo della pipetta. In secondo luogo, la pipetta di vetro utilizzata per micropuntura deve essere reso visibile per microscopia 2-fotone, che avviene utilizzando punti quantici. Terzo, stereotactic tecnica è necessaria per posizionare con precisione una pipetta nello spazio di Bowman in tre dimensioni, fino a 100 µm sotto la superficie del rene. Pertanto, i sistemi di coordinate della pipetta e la fase di registrazione con precisione sono passaggi critici. In quarto luogo, un'attenta selezione del glomerulo destinazione è necessario garantire che è accessibile per la pipetta senza urto dalla struttura di supporto del rene e imaging colonna. Infine, un'attenta considerazione deve essere data alla procedura analitica di seguire la procedura di acquisizione, e volume e tempi di acquisizione di campioni di fluido deve essere adeguate all'analisi e alla fisiologia glomerulare.

Abbiamo progettato una procedura di acquisizione che può essere estesa a molte analisi, inclusi gli endpoint micropuntura tradizionali, come la fotometria di fiamma, degli elettrodi sensibili agli ioni misure o misure di pressione, di volume o di carica. Inoltre, riteniamo che questa tecnica sarà suscettibile di nuovi endpoint analitico tra cui reazione a catena della polimerasi (forse dopo trascrizione inversa per miRNA) e metabolomica a valle della spettrometria di massa. Le modifiche speciali impiegate per facilitare la spettrometria di massa meritano discussione supplementare, e imporre alcune limitazioni. In primo luogo, sebbene spettrometria di massa è altamente sensibile, il basso contenuto di proteine e il volume dei campioni di micropuntura esegue il rendering di analisi della proteina sotto la gamma dinamica di esplorazione di proteomica convenzionale, e quindi erano nanoproteomics semplificato necessarie. ^{8 , 13} in secondo luogo, per ottimizzare la resa di proteina per primi saggi, abbiamo determinato che 200-300 nL dell'aspirato era necessaria, ma de novo filtrato acquisizione di questo volume richiederebbe forse fino a 20 minuti di aspirazione se il mouse GFR è solo 8-14 nL / min³. Come Tojo ed Endou ha dimostrato che la prolungata aspirazione altera il contenuto di albumina di fluido iniziali del tubulo prossimale¹⁴, abbiamo eletto per aspirare oltre 6 minuti; Tuttavia, questo significa che il nostro tasso di aspirazione supera il tasso di afflusso di filtrato. Gli utenti di questa procedura sono incoraggiati a prendere in considerazione la fisiologia di filtrazione glomerulare nel loro sistema sperimentale in progettazione loro flusso di lavoro. Spettrometria di massa, una tecnica sensibile, sarebbe essere sopraffatto dal segnale proveniente da un distillato di petrolio introdotto come l'olio minerale, che è comunemente usato in micropuntura costituiscono il sistema idraulico per l'aspirazione e isolare i segmenti del nefrone. Pertanto, non abbiamo potuto utilizzare olio minerale per questo scopo, o altri suo comune utilizzare, quantificazione del volume di campioni range nanolitro. Invece abbiamo riempire l'impianto con perfluorodecalina che è biologicamente inerte, non interferisce con la spettrometria di massa e ha favorevoli caratteristiche ottiche. Crediamo che le limitazioni imposte dal perfluorodecalina sono surmountable e stanno lavorando su ulteriori innovazioni tecniche che ci aspettiamo che vi permetterà di misurazione del volume di campione e blocco del segmento tubolare.

La maggior parte Micropuntura studi sono stati condotti in ratti Wistar Munich, che dimostrano i numeri aumentati dei glomeruli superficiali, ma questo studio fisiologico notevolmente limitato di trasporto tubulare e altri fisiologia renale a causa della perdita della fondamentale strumento di biologia molecolare, topi transgenici^2,3. Perché facilita l'accesso allo spazio di Bowman in topi micropipetta, la tecnica novella pertanto attenua questi limiti critici. Abbiamo adottato questa tecnica per poter accedere a renale filtrato per studi di proteomica mediante spettrometria di massa ad alta sensibilità, nota come nanoproteomics⁹. Tuttavia, ci sono probabili ulteriori domande. Ad esempio, studio renale fisiologica della proteina filtrata è stata notevolmente facilitata da uso di traccianti fluorescenti con microscopia 2-fotone^15,16,17. Aggiunta di micropuntura alla microscopia a 2 fotoni offre la possibilità di eseguire uno studio fisiologico del singolo-nefrone con molecole fluorescenti, permettendo di nefroni vicini, non-iniettato servire da comandi. Si spera che questa spiegazione chiara delle misure necessarie permetterà ampia adozione in laboratori già attrezzati per 2-fotone microscopia e/o micropuntura. Anche se è complesso, ora abbiamo effettuato questa procedura tutte le volte e le raffinatezze presentate qui rappresentano una piattaforma stabile per scoperta fisiologica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Upright 2 photon microscope	Zeiss	LSM 7MP
3 axis microscope stage controller	Sutter	MP-285
3 axis headstage controller	Sutter	MP-225
Pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U
Headstage	Molecular Devices	CV203BU
FITC-dextran 2000 kDa MW	Sigma-Aldrich	52471-1G
borosilicate glass capillary tubes	Sutter	B150-110-7.5
Micropipette puller	Sutter	P-97
Quantum dots, 605 nm	Thermofisher	Q21701MP
Polysiloxane	Sugru	No cat number	www.sugru.com, "original formula". Any color.
PE-50 tubing	Instech Labs	BTPE-50
Microinjector	WPI	UMP-3
Microinjector controller	WPI	Micro4
Perfluorodecalin	Sigma-Aldrich	306-94-5
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
Coverslip, 10 mm	Harvard Apparatus	64-0718
Headplate	Custom	No part number	Common in neuroscience labs, many suppliers
Head fixation device	Custom	No part number	Common in neuroscience labs, many suppliers
30 G needle	Becton-Dickinson	125393	For retroorbital injection
Tuberculin syringe	Becton-Dickinson	309626	For retroorbital injection