Isolamento e purificazione dei Periciti Cardiaci Murine

Riepilogo

Abbiamo ottimizzato un protocollo per isolare e purificare i periciti cardiaci murini per la ricerca di base e lo studio del loro potenziale di biologia e terapia.

Abstract

Periciti, cellule perivascolari di microvessels e capillari, sono noti per svolgere un ruolo nell'angiogenesi, stabilizzazione del vaso, e l'integrità della barriera endoteliale. Tuttavia, le loro funzioni specifiche del tessuto nel cuore non sono ben comprese. Inoltre, attualmente non esiste un protocollo che utilizzi materiali facilmente accessibili per isolare e purificare i periciti di origine cardiaca. Il nostro protocollo si concentra sull'utilizzo del modello di mammifero ampiamente utilizzato, il mouse, come fonte di cellule. Utilizzando la digestione enzimatica e la dissociazione meccanica del tessuto cardiaco, abbiamo ottenuto una miscela di cellule grezze che è stata ulteriormente purificata dalla fluorescenza attivando lo smistamento cellulare (FACS) da una pletora di marcatori. Poiché non esiste un singolo marcatore inequivocabile per i periciti, abbiamo annullato le celle che erano CD31^-CD34^-CD45 - CD45^-CD140b^,NG2^eCD146. Dopo la purificazione, queste cellule primarie sono state coltivate e passaggiate più volte senza alcuna modifica nella morfologia e nell'espressione dei marcatori. Con la capacità di ottenere regolarmente periciti cardiaci murini primari utilizzando il nostro protocollo, speriamo di comprendere ulteriormente il ruolo dei periciti nella fisiologia cardiovascolare e il loro potenziale terapeutico.

Introduzione

Le cellule perivascolari note come periciti circondanoi microvasi e i capillari dell'albero vascolare 1,². Fisiologicamente, sono noti per promuovere e svolgere un ruolo nell'angiogenesi, aumentare l'integrità della barriera a causa della loro stretta relazione con le cellule endoteliali, nonché stabilizzare e maturi vasi^1,2. Inoltre, la disfunzione e/o la perdita di queste cellule sono state implicate in malattie come il morbo di Alzheimer^2,3 e varie malattie cardiovascolari⁴. Queste cellule si trovano in tutto il corpo, ma i numeri delle cellule sono dipendenti dal tessuto. I periciti sono stati studiati in particolare nel cervello a causa dell'elevata vascolarizzazione della barriera emato-encefalica^1,2. Tuttavia, nel cuore, la biologia dei periciti è poco studiata.

Recentemente, ci sono maggiori interessi nel campo per i periciti cardiaci, ma attualmente non esiste un protocollo semplificato disponibile per il loro isolamento da uno degli strumenti più utilizzati in biologia: il topo. Ci sono protocolli nella letteratura sull'isolamento dei periciti dal cervello⁵, retina⁶, placenta⁷e muscolo scheletrico^8,9; tuttavia, pochi protocolli sono sull'isolamento dei periciti dal cuore. Ci sono diversi gruppi che hanno isolato i periciti cardiaci. Nees e altri sono stati in grado di isolare un'abbondante quantità di periciti cardiaci da più specie tra cui il topo; tuttavia, i loro metodi utilizzavano specifiche attrezzature costruite internamente che riducono la riproducibilità¹⁰. Avolio et al.¹¹, Chen et al.¹²e Baily et al.¹³ hanno anche isolato con successo i periciti cardiaci isolati dal tessuto cardiaco umano, ma i tessuti umani non sono sempre disponibili e difficili da ottenere per alcuni ricercatori. Qui, abbiamo sviluppato un metodo di isolamento per ottenere periciti cardiaci dai modelli murini per i ricercatori per studiare ulteriormente la loro biologia con materiali prontamente disponibili.

Utilizzando la digestione enzimatica e la fluorescenza activated cell sorting (FACS) con noti marcatori chiave periciti¹⁴, il nostro protocollo ci permette di isolare e purificare una popolazione di periciti che sono caratterizzati da CD31^-CD34^-CD45^- CD140b^:NG2^,CD146^,. Il nostro pannello di marcatori contiene sia marcatori di inclusione che di esclusione. CD45 è usato come marcatore per escludere le cellule ematopoietiche. CD31 viene utilizzato come marcatore per escludere le cellule endoteliali. CD34 è usato come marcatore per escludere cellule progenitrici ed ematopoietiche ed endoteliali. CD146 è un marcatore per le cellule perivascolari. Infine, NG2 e CD140b (noto anche come platelet derived growth factor recettor beta - PDGFR) sono entrambi marcatori accettati per i periciti¹⁴. La cultura primaria ottenuta può essere coltivata e scolata più volte senza cambiamenti nella morfologia o nell'espressione dei marcatori. Inoltre, queste cellule possono essere co-coltivate con cellule endoteliali per studiare le loro interazioni e incrociare tra loro. Questo metodo di isolamento cellulare permetterà agli sperimentatori di studiare la biologia e la fisiofisiologia dei periciti cardiaci da modelli di topo selvatici, malattie e geneticamente varianti.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati ospitati e utilizzati in una struttura accreditata dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della scuola di laboratorio per la cura degli animali (AAALAC) e tutto il lavoro degli animali è stato condotto sotto un'adeguata supervisione veterinaria e sotto l'ambito dell'Organizzazione Care and Use Committee (IACUC) ha approvato il protocollo di Amgen Inc.

1. Preparazione di strumenti e mezzi di coltura

1. Autoclave chirurgica 9 cm dritto punta forbici fine punta e 10 cm pinze seghettate angolate.
2. Aggiungere 25 mL di 5% di siero bovino fetale (FBS) e 5 mL di 1% streptomicina di penicillina (P/S) in una bottiglia da 500 mL di calcio senza glutei Dulbecco's fosfata-buffered salina (CMF-DPBS). Mettere la soluzione in un bagno di ghiaccio per assicurarsi che sarà freddo al momento dell'uso. Aliquota 50 mL in un tubo conico da 50 mL per l'isolamento del cuore. Aggiungere nella soluzione di sodio di eparina 250 unità/mL dell'aliquota di eparina. Questo sarà indicato come eparinizzato CMF-DPBS.
3. Aggiungere il 20% di FBS (100 mL) e 1% P/S (5 mL) in una bottiglia da 500 mL di medio dell'aquila modificata (DMEM) di 500 mL. Questo sarà indicato come i mezzi di coltura senza enzimi. Aliquota di 20 mL di DMEM - 20% FBS - 1% P/S e aggiungere 500 g/mL di collagene B. Questo sarà indicato come la soluzione enzimatica. Mantenere caldi sia i mezzi di coltura senza enzimi che la soluzione enzimatica a 37 gradi centigradi in un'incubatrice o in un bagno d'acqua.

2. Preparazione dell'animale e approvvigionamento di tessuti cardiaci

1. Intraperitonealmente iniettare un topo con 250 unità di soluzione di sodio di eparina con una siringa ad ago 31 G. Poi aspetta per un tempo, mentre il topo rimane attivo nella sua gabbia di casa.
   NOT: I dati rappresentativi di questo studio sono stati ottenuti da un topo C57BL/6 di 4 mesi. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato su qualsiasi mouse indipendentemente da deformazione, età, sesso, peso, ecc.
2. Anestesizzare il topo con 5% isoflurane. Controllare la profondità di anestesia del mouse pizzicando il riflesso.
3. Posizionare il topo anetizzato in posizione supina e nastro adesivo verso il basso gli arti anteriori. Aprire con attenzione la cavità toracica e cannulare l'aorta discendente utilizzando un ago a farfalla da 25 G.
4. Fare un nick nell'atrio destro e perfondere il cuore con almeno 20 mL di 250 unità/mL eparinizzato CMF-DPBS a 2 mL/min con una pompa peristaltica a flusso variabile. Quando il PBS esce dall'atria destra pulito, la perfusione è completa.
5. Tagliare il cuore all'aorta e metterlo nel gelido CMF-DPBS.

3. Dissociazione del tessuto cardiaco

1. Trasferire il cuore in un piatto Petri 15 cm x 15 cm. Tagliare il cuore a pezzettini minuscoli (1 mm/pezzo) utilizzando forbici a molla e pinze a punto fine con soluzione enzimatica sufficiente a coprire i pezzi (10-15 mL).
2. Trasferire i pezzi e la soluzione in un tubo conico da 50 mL, sigillare con pellicola di plastica di paraffina e incubare a 37 gradi centigradi su uno shaker orbitale a 120 giri/mper per 75 min.
3. Dopo la digestione del collagenasi con la soluzione enzimatica, decantare il liquido attraverso un colino cellulare di 100 m in un nuovo tubo da 50 mL, ma lasciare abbastanza soluzione per assicurarsi che i pezzi non si asciughino.
4. Utilizzando pinze punto fine, estrarre il tessuto dal tubo e posizionare alcuni pezzi su un vetrino del microscopio. Quindi macinare il tessuto tra due vetrini al microscopio per rompere il tessuto. Sciacquare le diapositive con un enzima senza enzimi in un nuovo tubo conico da 50 mL.
5. Ripetere il passaggio 3.4 fino a dissociare tutti i pezzi di tessuto.
6. Combinare le soluzioni dei passaggi 3.3.3.5 in un unico tubo. Filtrare la sospensione risultante attraverso un colino cellulare di 100 m in un nuovo tubo conico da 50 mL.
7. Centrifuga a 220 x g, 4 gradi centigradi, per 5 min. Aspirate fuori soluzione precedente e remettere delicatamente pellet cellulare in supporti di coltura fresco esente da enzimi.
8. Contare le celle e verificare la fattibilità utilizzando un contatore di celle. Diluire le celle a 1 x 10⁶/mL con buffer di colorazione FACS freddo contenente 500 mL di DPBS e 10-25 mL di 2-5% di albumina di siero bovino (BSA). Le cellule sono pronte per essere macchiate e ordinate.

4. Purificazione dei Periciti dalla miscela cellulare grezza utilizzando FACS

1. Preparare ed etichettare tubi FACS da 5 mL per tutti i controlli e i campioni di cellule. Celle fuori aliquota (1 mL di cellule per tubo) per un campione non colorato, controlli di fluorescenza meno uno (FMO) e controlli con corrispondenza isotipo. Utilizzare le celle rimanenti per l'ordinamento. Tutti i controlli e i campioni possono essere preparati e macchiati allo stesso tempo.
   nota:Un totale di 13 mL a 0,5 x 10⁶cellule/mL sono state utilizzate per il tipo rappresentativo da un cuore. Tuttavia, il volume dipende da quante cellule l'investigatore ottiene dal loro isolamento, quanti cuori usano e quanto bene il tessuto cardiaco viene digerito; la dimensione di ogni cuore è anche una variabile che può alterare il volume.
   1. Utilizzare perline di compensazione (Tabella dei materiali) per ottimizzare i controlli di compensazione della fluorescenza. Preparare un controllo di compensazione per ogni fluorocro nell'esperimento in un tubo FACS da 5 mL etichettato. Per questo esperimento, prepara un totale di 9 controlli di compensazione: 2 tipi di perline instainate più 7 diversi fluorocro dal pannello dei marcatori, tra cui NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 e viabilità cellulare-APC-Cy7 ( Tabella dei materiali).
      1. Aggiungete una goccia di perline di compensazione dalla fiala di compressione ad ogni tubo. Quindi aggiungere 1 - L di anticorpo alle perline. Ripetere l'operazione per ogni anticorpo dal pannello marcatore. Mescolare vigorosamente con pulsazione. Incubare per 30 minuti a 4 gradi centigradi protetto dalla luce ad eccezione delle perline di sopravvivenza cellulare che possono essere lasciate a temperatura ambiente protetta dalla luce.
      2. Aggiungete quindi 3 mL di tampone di colorazione FACS ad ogni tubo e centrifugate a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare la soluzione e risospendere ogni pellet di perline in 400 l di tampone di colorazione FACS. I controlli di compensazione sono pronti per essere utilizzati. Tieniti sul ghiaccio.
   2. Utilizzare i controlli FMO per ottimizzare la colorazione dello sfondo a causa della sovrapposizione spettrale.
      1. Preparare i controlli FMO utilizzando 1 mL di cellule che è stato composto dalla sezione 4.1 in un tubo FACS da 5 mL e aggiungendo tutti gli anticorpi dal pannello marcatore descritto nel passaggio 4.1.1 con una diluizione 1:100 ma escludendo un anticorpo. Ad esempio, preparare un FMO NG2-AF488 includendo anticorpi per CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, colorante per la vitalità cellulare ma non l'anticorpo NG2-AF488. Mescolare delicatamente con pulsazioni. Ripetere l'operazione per ogni anticorpo per un totale di 7 controlli. Incubare per 30 min a 4 gradi centigradi protetto dalla luce.
      2. Aggiungete quindi 3 mL di tampone di colorazione FACS ad ogni tubo e centrifugate a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare la soluzione e risospendere ogni pellet cellulare in 400 l di tampone di colorazione FACS. I controlli FMO sono pronti per essere utilizzati. Tieniti sul ghiaccio.
   3. Utilizzare anticorpi di controllo associati all'isotipo (Tabella dei materiali) per la colorazione non specifica.
      1. Preparare i controlli isotipi aggiungendo l'anticorpo di controllo corrispondente all'isotipo (Table of Materials) a 1 mL di campione di cellule preparato dalla sezione 4.1 a una diluizione 1:100 ciascuno in un tubo FACS da 5 mL. Mescolare delicatamente con pulsazioni. Incubare per 30 min a 4 gradi centigradi protetto dalla luce.
      2. Aggiungete quindi 3 mL di tampone di colorazione FACS ad ogni tubo e centrifugate a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare la soluzione e risospendere ogni pellet cellulare in 400 l di tampone di colorazione FACS. I controlli isotipi sono pronti per essere utilizzati. Tieniti sul ghiaccio.
   4. Preparare le cellule da ordinare aggiungendo un cocktail anticorpale a cellule appena isolate.
      1. Preparare il campione cellulare dalla sezione 4.1 aggiungendo un cocktail anticorpale contenente anti-mouse NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 a 1:100 diluizione ciascuno e colorante vibilità cellulare a 1:1,0000 diluizione. Vortice delicatamente per mescolare. Incubare campioni a 4 gradi centigradi per 30 min protetti dalla luce.
      2. Dopo la colorazione, lavare le cellule con tampone di colorazione FACS con centrifugazione a 300 x g per 5 min 4 gradi centigradi. Aspirare fuori soluzione e risospendere il pellet cellulare nel buffer di colorazione FACS a 0,5 x 10⁶ celle / mL.
      3. Utilizzando nuovi tubi FACS che hanno 35 piani di filtro, pipette macchiati campioni di cellule sui coperchi e filtrazione di gravità per ottenere sospensioni a cella singola. Tieniti sul ghiaccio.
2. Utilizzare una selezionatrice di celle per purificare le cellule.
   1. Eseguire le celle incontaminate sulla selezionatrice di celle per impostare le tensioni e correggere il segnale di fondo (ad esempio, impostare le tensioni per la dispersione in avanti a 490-560 e per la dispersione laterale a 180-250).
   2. Eseguire ogni campione di perline di compensazione a colore singolo uno alla volta per regolare le tensioni per ogni canale e regolare i cancelli per il segnale positivo. Raccogliere dati. Utilizzare il software per calcolare la sovrapposizione spettrale calcolando la matrice di compensazione. Tutte le tensioni sono pronte e impostate.
   3. Eseguire ogni controllo isotipo uno alla volta e questi dati possono essere utilizzati per regolare i gate per l'associazione non specifica, se presenti.
   4. Eseguire ogni campione FMO uno alla volta e regolare le tensioni per ogni canale per correggere la smorvere spettrale a causa di un pannello multicolore.
   5. Eseguire i campioni di cellule colorate nella selezionatrice di cellule e raccogliere le cellule in supporti di coltura senza enzimi da 10 mL (DMEM - 20% FBS - 1% P/S) in un tubo di raccolta conica da 15 mL. Utilizzare la seguente strategia di gating: cancello per le singole celle, cancello per le celle vive, cancello per le celle negative CD45, cancello per le celle negative CD34 e CD31, cancello per le cellule positive NG2, e infine cancello per le cellule positive CD146 e CD140b.

5. Coltura di Periciti

1. Coprire una piastra di 24 pozzetti con 0,2% di gelatina per 5 min e aspirare la soluzione di gelatina. Seme appena ottenuto cellule dal passo 4.2.5 in DMEM - 20% FBS - 1% P / S fino a 2 x 10⁴ cellule / cm². Cellule di coltura in un'incubatrice cellulare fissate a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ e 95% O₂.
2. Passaggio di periciti
3. Una volta che le cellule sono confluenti al 95%, lavare le cellule con 1x di DPBS caldi e sollevare le cellule con 200 -L di 0,1% di metapsina in ogni pozzo a temperatura ambiente per 3-5 min.
4. Toccare delicatamente la piastra per allentare le cellule.
5. Neutralizzare la metapina con un numero di supporti di coltura pari a 3,5 volte la quantità di supporti di coltura (700 DMEM , 20% FBS , 1% P/S) e il passaggio del seme a due celle (P2) su una piastra di 6 pozzetti non rivestita a 2 x 10⁴ celle/cm².
6. Ogni pozzo, quando confluente, può essere spostato in una singola fiaschetta T-75 come cellule P3 che poi possono essere divise con un rapporto 1:6.

6. Caratterizzazione dei Periciti

1. Analisi della citometria di flusso
   1. Utilizzare lo stesso protocollo di colorazione FACS e la stessa strategia di gating come descritto in precedenza nella sezione 4.
   2. Eseguire controlli e campioni macchiati sul citometro di flusso. Raccogliere dati e analizzare i dati utilizzando il software di analisi (Tabella dei materiali).
2. Per raccogliere immagini luminose, far crescere le cellule in un pallone in un'incubatrice cellulare impostata a 37 , 5% CO₂ e 95% O₂. Acquisire immagini su un microscopio dopo l'associazione delle cellule alla superficie.
3. Immunocitochimica
   1. Coltivare le cellule in una piastra di 96 pozze fino al 90% confluente. Lavare le cellule con 1x DI DPBS caldi e fissare con 4% paraformaldeide per 30 min a temperatura ambiente.
   2. Lavare le cellule 3x con 1x DPBS e permeabilizzare con detergente dello 0,1% per 10 min a temperatura ambiente.
   3. Incubare celle con buffer di blocco per 1 h a temperatura ambiente. Dopo il blocco, aggiungere gli anticorpi primari (un anticorpo per pozzo) diluiti 1:100 nel buffer di blocco e incubare a 4 gradi durante la notte. Gli anticorpi primari sono: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentina, anti-desmin, e anti-alfa liscia actina muscolare.
   4. Il giorno dopo, lavare le cellule 3x con tampone di lavaggio (Tabella dei materiali). Aggiungere l'anticorpo secondario diluito 1:1,000 nel buffer di blocco e incubare per 2 h a temperatura ambiente al buio. Anticorpo secondario è un anti-coniglio coniugato al FITC.
   5. Lavare le cellule 3x con tampone di lavaggio. Aggiungere 300 macchie nucleari diluite a 1:1.000 per 5 min a temperatura ambiente.
   6. Lavare le celle 3x con 1x DPBS e montare con supporti di montaggio.
   7. Cellule di immagine con un microscopio confocale.

Risultati

Dopo la digestione enzimatica e la dissociazione di tutto il cuore e prima della purificazione FACS delle cellule, le cellule sono una miscela grezza che contiene molti tipi di cellule diverse dal cuore (Figura 1A). Dopo la purificazione e la coltura FACS, le cellule sono omogenee. Sono singoli nucleati, abbastanza piatti, e hanno la tipica morfologia romboide pericite (Figura 1B).

Utilizzando FACS, le cellule vengono purificate all'omogeneità. Il campione di celle di controllo non instanelle viene utilizzato per mostrare la strategia di gating (Figura 2). In primo luogo, i detriti e le doppiettosono sono stati recintati in base alle distribuzioni a dispersione in avanti e laterali. Poi le cellule morte sono state recintate a causa della loro reazione di ammine con il tallone che produce un segnale maggiore e più intenso delle cellule vive. Delle cellule vive, le cellule ematopoietiche sono state sbarrate dall'essere CD45^. Per rimuovere ulteriormente le cellule ematopoietiche ed endoteliali, le^{cellule CD34} e CD31 sono state sbarrate. Infine, sono state selezionate^{cellule NG2} e CD140b /CD146 per essere cellule perivascolari con espressione dei tipici marcatori periciti (Figura 3). Il pannello marcatore è stato testato anche sulle cellule endoteliali coronariche del topo come controllo (Figura supplementare 1). Solo circa l'1% della miscela di cellule grezze consisteva di periciti dopo lo smistamento.

Per verificare che le cellule fossero effettivamente periciti, abbiamo passaggiato le cellule per un'ulteriore caratterizzazione. Le cellule sono cresciute rapidamente una volta raggiunto il P3 nelle flaconi T-75 senza cambiamenti di vitalità man mano che diventavano più grandi (Figura supplementare2). Rispetto ai periciti cerebrali umani, le cellule avevano una morfologia simile (Figura 4A). Rispetto alle cellule muscolari lisce e del topo e umano, le cellule avevano una morfologia diversa (Figura 4A). Non sono stati osservati cambiamenti nella morfologia o nell'espressione dei marcatori al P7 quando sono immunostained o per analisi della citometria di flusso dopo il passaggio (Figura 4B,C).

Figura 1 : Cellule grezze contro cellule purificate. (A) L'immagine del campo luminoso della miscela cellulare grezza post digestione e dissociazione enzimatica del cuore intero che è stata coltivata in un flacone T25 per 14 giorni. (B) L'immagine dal campo luminoso di una popolazione omogenea di periciti cardiaci dopo lo smistamento e la coltura dopo 14 giorni. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Immagini rappresentative dell'analisi FACS delle cellule non colorate. Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata per purificare la miscela cellulare grezza. Cancello per le celle single, live, CD45^-, CD31^-, CD34^-, NG2^,CD146 , e CD140b^. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Immagini rappresentative dell'analisi FACS delle cellule grezze. Rappresentazione schematica dello smistamento utilizzato per ottenere una popolazione omogenea di periciti cardiaci. Circa l'1% delle cellule grezze è CD31^-CD34^-CD45^-CD140b^-NG2^,CD146^. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : caratterizzazione dei periciti cardiaci isolati primari (A) Le immagini di cellule coltivate provenienti da corpi umani (hPC) e cuori murini (mPC) mostrano una morfologia delle cellule pericite simile ma una morfologia diversa dalle cellule muscolari lisce umane hSMC) e cellule muscolari lisce del topo (mSMC). Barra di scala - 100 m. (B) Caratterizzazione fenotipica delle cellule a P7 per immunocitochimica per i marcatori di pericite. Barra di scala (C) Analisi per citometria di flusso dei periciti a P7 dove sono stati recintati per marcatori negativi CD31, CD34, CD45 e marcatori positivi NG2, CD140b e CD146. La popolazione rimane omogenea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Immagini rappresentative dell'analisi della citometria di flusso delle cellule endoteliali utilizzando il pannello marcatore. Una linea cellulare coronarica del topo è stata utilizzata come controllo per la specificità di legame per i marcatori. Utilizzando la stessa strategia di gating che è stata utilizzata nel tipo ad eccezione di un cancello positivo per CD31 invece di un cancello negativo, le cellule endoteliali erano negative per CD45, CD34, NG2, CD140b e CD146 ma positive per CD31 come previsto. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura 2 supplementare: Immagini rappresentative dell'analisi della citometria di flusso di diversi passaggi di mPC. I periciti cardiaci isolati primari sono stati coltivati e sono stati passaggi fino al passaggio 12. Le cellule sono state macchiate con iodio propidio e analizzate su un citometro di flusso. La popolazione di controllo è una miscela di cellule morte e cellule vive. Non c'erano differenze significative nel numero di cellule vitali tra i passaggi. Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

Poiché gli studi sui periciti cardiaci sono relativamente nuovi, il ruolo dei periciti nella fisiologia cardiovascolare e nella fisiopatologia deve ancora essere definito. In altri organi, hanno dimostrato di svolgere ruoli chiave nell'omeostasi del vaso e nella perfusione^1,2. Rispetto alla letteratura dei periciti di altri organi come il cervello, ci sono significativamente meno pubblicazioni sui periciti cardiaci. L'isolamento dei periciti cardiaci è fondamentale per la comprensione delle loro caratteristiche funzionali e dei meccanismi di segnalazione. Pertanto, questo protocollo fornirà agli sperimentatori un modo più semplice per accedere ai periciti cardiaci da una fonte tissutale più prontamente disponibile e promuovere gli studi sulla loro biologia. Aiuterà a rispondere a domande su come i periciti cardiaci contribuiscono all'omeostasi cardiaca e alla fisiofisiologia, nonché a studiare il loro potenziale terapeutico.

La popolazione pericita isolata dal cuore murino e caratterizzata da CD31^-CD34^-CD45^-CD140b^-NG2^-CD146^- è stata passata più volte (fino a P12 e stava ancora andando forte), il che non diminuzione della redditività e propaga rapidamente (Figurasupplementare 2). Le cellule sono state anche criocongelate e recuperate con almeno il 95% di redditività. Tuttavia, preferiamo usare le cellule P7 o più giovani per i nostri esperimenti. Confrontando le immagini luminose dei nostri periciti con i periciti del cervello umano, le due linee cellulari hanno morfologia cellulare comparabile (Figura 4A) mentre differiscono nella morfologia dalle cellule muscolari lisce (Figura 4A). Le nostre cellule P7 sono state caratterizzate da immunocitochimica per i marcatori di pericito, alcune del nostro pannello FACS (NG2 e CD140b), e alcune non nel pannello (vimentin, desmin, sMA) e abbiamo scoperto che le cellule espresse marcatori periciti omogeneamente (Figura 4B). Inoltre, le nostre cellule P7 sono state analizzate dalla citometria di flusso di nuovo con lo stesso pannello marcatore per valutare le modifiche nell'espressione del marcatore a causa del passaging e abbiamo scoperto che non ci sono state modifiche (Figura 4C). Pertanto, sia fenotipicamente che morfologicamente, le nostre cellule sono periciti.

Gli studi di Nees et al.¹⁰, Avolio et al.¹¹, Chen et al.¹²e Baily et al.¹³ hanno mostrato immiciti cardiaci periciti di successo. Tuttavia, l'uso di un'apparecchiatura costruita su misura interna per staccare i periciti dalle microvessels di Nees et al.¹⁰ prevedeva due camere con pompe che perfusavano soluzione proteasi avanti e indietro attraverso una pila di reti a rete, che era difficile da replicare in quanto non ha fornito uno schema e/o un'immagine dell'apparecchio e di come è stato costruito. Anche se Nees et al.¹⁰ hanno isolato con successo periciti cardiaci di molte specie, non siamo mai stati in grado di riprodurre il loro metodo. La nostra fase di distacco pericito nel nostro protocollo utilizza semplicemente uno shaker orbitale (per dissociare tutte le cellule) che è disponibile nella maggior parte, se non in tutti i laboratori, con la soluzione tissutale ed enzimatica in un tubo conico seguito da una fase di dissociazione meccanica. Non è richiesto alcun apparato personalizzato. In secondo luogo, i restanti protocolli prevedono l'uso di tessuti umani e quindi l'approvvigionamento di tessuto umano limita agli investigatori. Il nostro protocollo è unamodifica e ottimizzazione degli attuali protocolli 9,¹² utilizzando modelli murini (tipo selvaggio, geneticamente modificato, malato) e materiali che sono prontamente disponibili a tutti gli investigatori.

Poiché le cellule perivascolari in generale sono sensibili, la vitalità delle cellule è fondamentale per ottenere una buona resa. Durante l'approvvigionamento del tessuto cardiaco e la colorazione delle cellule, il tessuto/cellule deve essere mantenuto freddo ghiaccio. In secondo luogo, la digestione enzimatica del tessuto può richiedere l'ottimizzazione su base individuale. A seconda delle unità di attività sulle proprie fiale di enzimi, concentrazione e tempo di digestione potrebbe essere necessario ottimizzare. Assicurarsi che la soluzione ezimatica viene preparata fresco ogni volta altrimenti la resa diminuirà. In terzo luogo, la miscela grezza contiene un sacco di cellule, alcune morti e / o morenti, è meglio abbassare la concentrazione di FBS nel buffer di colorazione dal 5% al 2%. Se hai problemi con le cellule che intasano l'ugello durante l'ordinamento, arricchisci prima le cellule utilizzando un kit di rimozione delle cellule morte. È inoltre possibile aggiungere il buffer EDTA/HEPES o il trattamento DNase al pre-sort e-nicore cellulare per evitare l'agglomerazione delle cellule. Infine, poiché il nostro gruppo di anticorpi è piuttosto grande e utilizza molti fluorofori, assicurati che i controlli FMO e i controlli di compensazione siano eseguiti correttamente.

Una limitazione a questo metodo è la quantità di periciti cardiaci che possono essere ottenuti per cuore. Nel nostro caso, solo l'1,1% della nostra miscela grezza da un cuore di topo erano periciti che è paragonabile alla percentuale negli isolamenti del cuore umano, ma il numero di cellule è significativamente inferiore a causa della quantità di tessuto cardiaco che un topo fornisce. Poiché il numero iniziale di cellule è così basso dopo FACS, sarebbe meglio isolare da più cuori contemporaneamente. Tuttavia, il problema con questo è il gran numero di celle che è necessario ordinare in un giorno. Se hai più di 30 milioni di cellule, sarà difficile superare il tipo senza influire sulla vitalità delle cellule. Se l'investigatore avesse più selezionatrici cellulari, isolarsi da più cuori in un giorno sarebbe fattibile. Un'altra limitazione è che perché non sappiamo se ci sono sottopopolazioni di periciti nel cuore come se ci fosse muscolo scheletrico^15,16, non sappiamo se stiamo eliminando un sottotipo nella nostra strategia di gating. Siamo in procinto di caratterizzare i nostri periciti cardiaci e finora nei nostri dati inediti, sono funzionalmente come altri periciti in letteratura.

Il nostro protocollo consentirà agli sperimentatori di rispondere a domande sulle proprietà cardiache dei periciti, le caratteristiche, la funzionalità e altri aspetti che aiuteranno a definire il loro contributo all'omeostasi cardiaca e all'emodinamica. Queste cellule potrebbero avere un potenziale terapeutico per le malattie cardiovascolari una volta che la loro biologia è meglio compresa.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-053-Cl	dilute with 1x DPBS to get 0.1%
100 μM Cell strainer	FisherSci	22363549
15 mL Falcon conical tubes	BD	352096
24-well plate	Corning	CLS3527
25 G butterfly needle	FisherSci	22-253-146
31 G needle syringe	FisherSci	B328446
50 mL Falcon conical tubes	BD	352098
6-well plate	Corning	CLS3516
anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb	abcam	ab32575	Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-CD140b rabbit mAb	Cell Signaling	28E1	Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-CD31 rabbit pAb	abcam	ab28364	Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-desmin rabbit pAb	abcam	ab8592	Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-NG2 conjugated to AF488	Millipore	MAB5384A4	Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-vimentin rabbit mAb	abcam	ab92547	Antibody used in ICC 1:100 dilution
ArC Amine Reactive Compensation bead kit	Invitrogen	A10346	compensation beads for Live/Dead Near IR dye
Brightfield Microscope			camera attached
CD140b-PE (clone APB5)	eBioscience	12-1402-81	Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD146-BV605 (clone ME-9F1)	BD	740434	Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD31-APC (clone MEC 13.3)	BD	551262	Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD34-BV421 (clone RAM 34)	BD	56268	Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11)	BD	552848	Antibody used in FACS 1:100 dilution
Centrifuge	eppendorf
Collagenase B	Roche	11088815001	0.226 U/mg lyo.
Confocal Microscope
DAPI	ThermoFisher	D1306	nuclear stain
DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV	500 mL
Dowell scissors	FST	15040-11
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21-030-CV	500 mL
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS)	Corning	21-031-CV	500 mL
Dumont #5 Fine Forceps	FST	11254-20
FACSAria cell sorter	BD		Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW
FACSAria software	BD
Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL	BD	38057
Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL	BD	08-771-23
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015-CV	500 mL
Fine scissors	FST	14060-09
FlowJo software	FlowJo LLC
Fortessa LSR flow cytometer	BD		Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW
Gelatin-based coating	Cell Biologics	6950
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	Antibody used in ICC 1:1000 dilution
Graefe Forceps	FST	11049-10
Heparin sodium solution	Hospira	NDC 0409-2720-02	10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines
Incubator			set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2
Live/Dead-Near IR	Life Technologies	L10119
Microscope slides	FisherSci	12-550-343
NG2-FITC	Millipore	AB5320A4	Antibody used in FACS 1:100 dilution
Oribital shaker	VWR		Inside 37 °C incubator or room
Paraformaldehyde	FisherSci	50-980-487	dilute with 1x DPBS to get 4%
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
Petri dish	FisherSci	FB0875714
Pipette and tips
ProLong Diamond	ThermoFisher	P36965	mounting media
Propidum Iodide	ThermoFisher		cell viability dye for supplemental figure 2
Rabbit IgG FITC	eBiosciences	11-4614-80	Isotype control antibody - FITC
Rat IgG2a APC	Biolegend	400512	Isotype control antibody - APC
Rat IgG2a BV421	Biolegend	400536	Isotype control antibody - BV421
Rat IgG2a BV605	BD	563144	Isotype control antibody - BV605
Rat IgG2a PE	Biolegend	400308	Isotype control antibody - PE
Rat IgG2b PE-Cy7	Biolegend	400617	Isotype control antibody - PE-Cy7
SuperBlock	ThermoFisher	37515	blocking buffer
T75	ThermoFisher	156499
Triton X-100	Sigma	X100	detergent, dilute with x DPBS to get 0.1%
UltraComp beads	Invitrogen	01-2222-42	compensation beads
Variable-Flow Peristaltic Pump	FisherSci	13-876-1
ViCell Cell counter	Beckman
Wash buffer			1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS