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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Composti eterosuli sono molecole importanti utilizzate in sintesi organica, chimica medicinale e biologica. Un'eteroarylazione assistita a microonde con catalisi di palladio fornisce un metodo rapido ed efficiente per attaccare le moietà eteroaryl direttamente ai substrati chetoni.

Abstract

L'eteroarylation introduce frammenti eteroanei a molecole organiche. Nonostante le numerose reazioni disponibili riportate per l'arylazione attraverso la catalisi metallica di transizione, la letteratura sull'eteroarylazione diretta è scarsa. La presenza di eteroatomi come azoto, zolfo e ossigeno spesso rende l'eteroarylation un campo di ricerca impegnativo a causa dell'avvelenamento da catalizzatore, della decomposizione del prodotto e del resto. Questo protocollo descrive in dettaglio un'eteroarylazione diretta di chetoni altamente efficiente sotto irradiazione a microonde. I fattori chiave per il successo dell'eteroroarylazione includono l'uso di XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, la base in eccesso per sopprimere le reazioni laterali e l'alta temperatura e pressione raggiunta in una fiala sigillata sotto l'irradiazione a microonde. I composti eteroristicalazione preparati con questo metodo erano completamente caratterizzati dalla spettroscopia a risonanza magnetica nucleare protonica (1H NMR), dalla spettroscopia a risonanza magnetica nucleare carbonizzata (13C NMR) e dalla spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Questa metodologia presenta diversi vantaggi rispetto ai precedenti letterari, tra cui un ampio ambito di substrato, tempi di reazione rapidi, procedure più ecologiche e semplicità operativa eliminando la preparazione di intermedi come l'etere silyl enol. Le possibili applicazioni per questo protocollo includono, ma non si limitano a, la sintesi orientata alla diversità per la scoperta di piccole molecole biologicamente attive, la sintesi domino per la preparazione di prodotti naturali e lo sviluppo del ligando per nuovi sistemi catalitici metallici di transizione.

Introduzione

Le microonde interagiscono con i materiali attraverso la conduzione ionica o la polarizzazione dipolare per fornire un riscaldamento rapido e omogeneo. Le reazioni organiche assistite da microonde hanno guadagnato una crescente popolarità nei laboratori di ricerca dopo la prima relazione per la rapida sintesi organica nel 19861. Anche se l'esatta natura del riscaldamento a microonde non è chiara e l'esistenza di un effetto microonde "non termico" è ancora in discussione, significativi miglioramenti del tasso per le reazioni organiche assistite da microonde sono stati osservati e segnalati2. Reazioni lente che normalmente richiedono ore o giorni per finire sono state segnalate per essere completato in pochi minuti sotto irradiazione a microonde3,4,5,6. Difficili reazioni organiche che richiedono un'elevata energia di attivazione come le ciclizzazioni e la costruzione di siti ostacolati sterically sono state segnalate per avere successo sotto l'irradiazione delle microonde con rendimenti di reazione migliorati e purezza7. In combinazione con altre caratteristiche come le reazioni senza solventi e le reazioni domino, la sintesi organica assistita da microonde offre vantaggi senza precedenti nella progettazione di reazioni eco-compatibili.

A differenza del suo equivalente di arylazione, che è stato ampiamente studiato, l'eteroarylation, in particolare sul zo-C(sp3) di composti carbonili, è stato raramente riportato nella letteratura8,9,10. Le poche pubblicazioni letterarie di eteroarylazione di composti carbonili avevano grandi limitazioni come una quantità stoichiometrica di catalizzatori, portata di substrato stretto e isolamento degli intermedi di reazione11,12,13. Ci sono diverse sfide per la diretta eteroarylazione dei chetoni rimangono da risolvere al fine di renderlo un approccio generale. In primo luogo, gli eteroatomi tendono a coordinarsi al catalizzatore metallico di transizione e causare avvelenamento da catalizzatore14,15. In secondo luogo, la z-H nel prodotto mono(etero)arylation è più acida di quelle nel materiale di partenza. Pertanto, tende a reagire ulteriormente per rendere i prodotti indesiderati (bishetero)arylation o (multietero)Arylation. In terzo luogo, composti carbonili spesso hanno un costo inferiore rispetto ai composti eteroari, quindi è pratico utilizzare composti carbonili in eccesso per guidare la reazione al completamento. Tuttavia, l'eccesso di composti carbonilici spesso causava l'autocondensazione, un problema frequentemente incontrato nella transizione con il metallo catalizzato , di composti carbonili.

In questa relazione, descriviamo il nostro recente studio sull'eteroarylazione diretta dei chetoni utilizzando un protocollo di reazione assistita da microonde. Per affrontare la prima sfida, sono stati utilizzati avvelenamento da catalizzatore discusso in precedenza, coordinando fortemente e legandosi sterically-ostacolati per ridurre al minimo l'avvelenamento da catalizzatore da eteroatomi. Si prevedeva anche che i ligandi ingombranti rallentassero le reazioni laterali come (bishetero)arylation o (multihetero)arylation16,17, la seconda sfida di cui sopra. Per minimizzare l'effetto della terza sfida, la formazione dei prodotti lato auto-condensazione chetoni, più di 2 equivalenti di base è stato impiegato per convertire i chetoni ai corrispondenti enotoramenti. Il lungo tempo di reazione e l'alta temperatura di reazione, insieme alle sfide specificamente associate all'eteroarylazione diretta dei chetoni, lo rendono un candidato adatto per la ricerca di sintesi organica a microonde.

Protocollo

Attenzione:

  • Le fiale di reazione a microonde devono essere azionate sotto 20 bar per il reattore a microonde dotato di un rotore 4 x 24MG5. Se la reazione utilizza solventi molto volatili, genera gas, o se i solventi si decompongono, è necessario calcolare la pressione a determinate temperature di reazione per assicurarsi che la pressione totale nella fiala sia inferiore a 20 bar.
  • In questo protocollo vengono utilizzate tecniche standard di sintesi organica per scatola di guanti, cromatografia flash e risonanza magnetica nucleare (NMR).
  • Durante l'esperimento deve essere utilizzata un'adeguata attrezzatura di protezione personale (PPE). Questi includono occhiali di sicurezza, un camice da laboratorio, guanti nitrile, pantaloni lunghi e scarpe chiuse.
  • Consultare tutte le schede tecniche di sicurezza (SDS) prima dell'uso delle sostanze chimiche in questa procedura, poiché alcune sostanze chimiche sono pericolose, corrosive, tossiche o infiammabili.
  • Tutti i rifiuti chimici devono essere smaltiti correttamente in contenitori di rifiuti designati.

1. Sistema di reazione

  1. Utilizzare le seguenti quantità di reagenti per la reazione di esempio nella Figura 1 - la formazione di 1-phenyl-2-(pyridin-3-yl)etano (composto 1a) da acetofenee e 3-iodopyridine.
  2. Fiale di reazione a microonde a forno dotate di barre di agitazione durante la notte. Spurare l'argon vigorosamente in toluene per 30 minuti a degas il solvente prima dell'uso.
  3. Preparazione di reagenti e forniture per l'uso del portaoggetti
    1. Raccogliere due siringhe da 100, quattro piccole spatole, due pipet di vetro, due guarnizioni a microonde, due tappi a microonde, due barre di agitazione a microonde, almeno quattro pezzi di carta di pesatura prepiegata, quattro Kimwipe, quattro elastici e due becher da 100 mL insieme a tutti i reattori/solventi necessari.
    2. Mettere le fiale a microonde, guarnizioni e tappi in uno dei becher da 100 mL, quindi coprire il becher con un Kimwipe e avvolgere un elastico intorno al becher per mantenere il Kimwipe in posizione.
    3. Posizionare il becher e il resto degli articoli dal punto 1.3.1 nella scatola di trasporto e portarlo nella postazione di lavoro del portaoggetti.
  4. Trasportare i reagenti e le forniture nel passaggio 1.3 nel vano portaoggetti.
    1. All'interno del vano portaoggetti purificato, pesare 115 mg di NaOtBu (peso molecolare (MW) 96.1, 1,2 mmol, 2.4 eq.) direttamente nella fiala reazione a microonde.
    2. Utilizzare un pipet di vetro per aggiungere metà del toluene degassato (1 mL) nella fiala reazione a microonde.
    3. Pesare 9 mg di precatalyst XPhos Pd G4 (MW 860.5, 0,01 mmol, 2 mol%) e aggiungerlo nella fiala a microonde. Immergere una spatola nella soluzione nella fiala e girare per garantire il trasferimento completo del catalizzatore.
    4. Utilizzare una siringa microlitro adatta per aggiungere 64,4 l di acetofene (MW 120.15, 66,1 mg, 0,55 mmol, 1,1 eq.) nella fiala a microonde.
    5. Pesare 103 mg di 3-iodopyridine (MW 205.0, 0.5 mmol, 1.0 eq.) e aggiungerlo nella fiala del microonde.
    6. Aggiungere la restante metà del toluene degassato in modo che la miscela di reazione totale sia di circa 3 mL.
      NOTA: il volume della soluzione di reazione non deve superare i 3/4 della capacità totale del volume della fiala di reazione a microonde. Per le fiale di vetro standard utilizzate in questo protocollo, il volume della fiala è di 4 mL e il volume di reazione consigliato è di 0,3 mL – 3 mL.
    7. Allineare attentamente il sigillo e il tappo e metterli sulla fiala reazione a microonde. Il cappuccio deve essere stretto con le dita.
    8. Togli le sostanze chimiche, le provviste e la spazzatura dal vano portaoggetti.

2. Irradiazione a microonde

  1. Prendere la fiala di reazione assemblata sul reattore a microonde e posizionarla sulla piastra di carburo di silicio (SiC) sul rotore. Per le fiale a reazione multipla, distanziarle uniformemente attraverso le quattro piastre di carburo di silicio (SiC) sul rotore.
  2. Impostazione dei parametri
    NOTA: I parametri più importanti sono il limite di temperatura del sensore IR, la potenza del microonde e il tempo.
    1. Impostare il limite di temperatura del sensore a infrarossi (IR) su 113 .
      NOTA: le temperature misurate con sensore IR tendono ad essere inferiori alle temperature delle soluzioni di reazione a causa di un gradiente di temperatura non prevenibile tra il campione e l'esterno del recipiente. C'è una relazione lineare tra queste due temperature: IR T (C) , Reazione T /C) / 1.152. Quando la temperatura del sensore IR è di 113 gradi centigradi, la temperatura di reazione effettiva sarà di 130 gradi centigradi utilizzando l'equazione sopra indicata.
    2. Programmare la potenza del microonde e il tempo per ogni passo:
      Passo 1: Rampa di potenza 1300 W, 10 min, Livello del ventilatore 1, Stirrer - Alto
      Passo 2: Presa di potenza 1300 W, 10 min, Livello del ventilatore 1, Stirrer - Alto
      Fase 3: Raffreddamento: 60 gradi centigradi, livello della ventola
      NOTA: La potenza del microonde si regola automaticamente quando la temperatura di reazione effettiva raggiunge la temperatura di destinazione.
  3. Eseguire la reazione sotto l'irradiazione a microonde. Registrare il tempo di reazione effettivo e la temperatura.

3. Isolamento del prodotto

  1. Dopo che la fiala reazione a microonde si raffredda a temperatura ambiente, trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore utilizzando una quantità minima di acetato etilico (EtOAc).
  2. Utilizzare l'estrazione acido-base per isolare il prodotto grezzo.
    1. Aggiungere 2 mL di NH4Cl saturo all'imbuto separatore.
    2. Aggiungere 10 mL di EtOAc all'imbuto separatore ed estrarre il prodotto. Separare lo strato organico e salvarlo in un becher pulito e asciutto. Ripetere l'estrazione altre due volte e combinare gli strati organici.
    3. Asciugare lo strato organico combinato con anhydrous Na2SO4 per 20 min.
    4. Decant la soluzione chiara in un flacone inferiore rotondo ed evaporare il solvente per evaporazione rotatoria sotto pressione ridotta per produrre il prodotto grezzo.
    5. Registrare la forma, il colore e la massa del prodotto grezzo.
  3. Prendere 1H e 13C spettri NMR per il prodotto grezzo per confermare la presenza dei picchi caratteristici per il prodotto previsto.
  4. Combinare il prodotto grezzo del campione NMR con il resto del prodotto grezzo per la purificazione della cromatografia flash qui sotto.
  5. Utilizzare la cromatografia flash automatica per purificare il prodotto finale.
    1. Caricamento del campione: Sciogliere il prodotto grezzo in 1-2 mL di acetone, seguito dall'aggiunta di 1,5 g di gel di silice per fare un liquame. Utilizzare l'evaporazione rotativa per rimuovere l'acetone con molta attenzione in modo che il prodotto venga caricato sul gel di silice. Trasferire il gel di silice risultante in una cartuccia di caricamento flash vuoto.
    2. Assemblare la cartuccia di carico, la colonna preconfezionata, il rack della provetta e le linee di solvente per il sistema di cromatografia liquida a media pressione (MPLC) automatizzato.
    3. Impostare il gradiente del solvente e altri parametri per il sistema MPLC ed eseguire la cromatografia flash.
      NOTA: I gradienti di solvente per cromatografia flash automatizzati sono suggeriti in base alle caratteristiche strutturali del prodotto eteroaryl:
      1) Se il prodotto ha uno o zero atomi di azoto (N) o gruppi idrossili (OH), utilizzare EtOAc/hexanes (da 0% a 100% oltre 12 min) con estensione al 100% gradiente EtOAc per 2-6 min.
      2) Se il prodotto ha due o più atomi di azoto (N) o gruppi idrossili (OH), utilizzare CH3OH/CH2Cl2 (0% a 30% oltre 12 min) con estensione a 30% CH3OH gradiente per 1-3 min.
    4. Unire le frazioni MPLC desiderate ed far evaporare il solvente per raccogliere il prodotto puro. Asciugare il prodotto purificato sotto vuoto elevato per almeno 1 h per rimuovere il solvente residuo.

4. Caratterizzazione del prodotto

  1. Pesare 5 - 10 mg del prodotto purificato finale, scioglierlo nel cloroformio deuterato (CDCl3) (o altro solvente deuterato appropriato), e prendere uno spettro 1H NMR.
  2. Pesare 10 - 30 mg del prodotto purificato finale, scioglierlo in CDCl3 (o altro solvente deuterato appropriato), e prendere uno spettro 13C NMR.
  3. Analizzare gli spettri NMR per confermare la struttura del prodotto.
  4. Recuperare il campione NMR in una fiala da 1 dram facendo evaporare il solvente.
  5. Una volta che gli spettri NMR supportano la struttura corretta, presentare un campione di 1 mg per il test HRMS per confermare la formula molecolare.

Risultati

L'eteroarylazione diretta di chetoni da z-C(sp3) può essere eseguita utilizzando questo efficiente protocollo assistito a microonde. Esempi selezionati di chetoni eteroaryl sintetizzati in questo studio sono mostrati Figura 1. In particolare, composto 1a è stato sintetizzato e isolato come un olio giallo pallido (0,49 mmol, 192 mg, 98 %). I suoi spettri NMR da 1H e 13C sono illustrati nella Figura 2 per confermare la stru...

Discussione

La metodologia qui descritta è stata sviluppata per accedere a preziosi elementi costitutivi della sintesi – composti eteroari. Rispetto alle precedenti relazioni di letteratura sull'eteroarylation, la scelta di questo attuale sistema catalitico ha mostrato diversi vantaggi significativi. In primo luogo, evita l'uso di gruppi di protezione, l'isolamento degli intermedi reattivi, il requisito di stoichiometria dei catalizzatori e i tempi di reazione estesi11,17...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il riconoscimento viene fatto ai donatori dell'American Chemical Society Petroleum Research Fund per il sostegno di questa ricerca (PRF 54968-UR1). Questo lavoro è stato sostenuto anche dalla National Science Foundation (CHE-1760393). Ringraziamo con gratitudine il Centro NKU per l'integrazione di scienza e matematica, il programma di ricerca internazionale NKU-STEM e il Dipartimento di Chimica e Biochimica per il sostegno finanziario e logistico. Ringraziamo anche il Laboratorio di Spettrometria di Massa della Scuola di Scienze Chimiche presso l'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign per aver ottenuto i dati HRMS.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloroform-d (99.8+% atome D)Acros OrganicsAC209561000contains 0.03 v/v% TMS
CombiFlash Rf Flash Chromatography systemTeledyne Iscoautomated flash chromatography system
CombiFlash Solid load catridges (5 gram)Teledyne Isco69-3873-235disposable
CombiFlash prepacked column (4g)Teledyne Isco69-2203-304RediSep Rf silica 40-60 um, disposable
Microwave Reactor - Multiwave ProAnton Paar108041Microwave Reactor
Microwave Reactor Rotor 4X24 MG5Anton Paar79114for parallel organic synthesis with with 4 SiC Well Plate 24
Microwave reaction vialsWheaton® glass224882disposible, 13-425, 15x46 mm, reaction solution 0.3 - 3.0 mL, working pressure 20 bar
Microwave reaction vial seals, setAnton Paar41186made of Teflon; disposable
Microwave reaction vial screw capAnton Paar41188made of PEEK; forever reusable
Microwave reaction vial stirring barCTechGlassS00001-0000Magnetic, PTFE, Length 9mm. Diameter: 3mm. (Package of 5)
NaOtBuSigma-Aldrich703788stored in a glovebox under nitrogen atmosphere
Nuclear Magnetic Resonance SpectrometerJoel500 MHz spectrometer
Silica gelTeledyne Isco60539447840-60 microns, 60 angstroms
TolueneSigma-Aldrich244511vigorously purged with argon for 2 h before use
XPhos Palladacycle Gen. 4 CatalystSTREM46-0327stored in a glovebox under nitrogen atmosphere
various ketonesSigma-Aldrich or Fisher or Ark Pharm.substrates for heteroarylation
various heteroaryl halidesSigma-Aldrich or Fisher or Ark Pharm.substrates for heteroarylation

Riferimenti

  1. Gedye, R. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Letters. 27 (3), 279-282 (1986).
  2. Garbacia, S., Desai, B., Lavastre, O., Kappe, C. O. Microwave-Assisted Ring-Closing Metathesis Revisited. On the Question of the Nonthermal Microwave Effect. The Journal of Organic Chemistry. 68 (23), 9136-9139 (2003).
  3. Amato, E., et al. Investigation of fluorinated and bifunctionalized 3-phenylchroman-4-one (isoflavanone) aromatase inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 22 (1), 126-134 (2014).
  4. Bonfield, K., et al. Development of a new class of aromatase inhibitors: Design, synthesis and inhibitory activity of 3-phenylchroman-4-one (isoflavanone) derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 20 (8), 2603-2613 (2012).
  5. Yılmaz, F., Mentese, E. A Rapid Protocol for the Synthesis of N-[2-(alkyl/aryl)-4-phenyl-1Himidazol-1-yl] benzamides via Microwave Technique. Current Microwave Chemistry. 1 (1), 47-51 (2014).
  6. Xia, Y., Chen, L. Y., Lv, S., Sun, Z., Wang, B. Microwave-Assisted or Cu-NHC-Catalyzed Cycloaddition of Azido-Disubstituted Alkynes: Bifurcation of Reaction Pathways. The Journal of Organic Chemistry. 79 (20), 9818-9825 (2014).
  7. Lei, C., Jin, X., Zhou, J. S. Palladium-Catalyzed Heteroarylation and Concomitant ortho-Alkylation of Aryl Iodides. Angewandte Chemie International Edition. 54 (45), 13397-13400 (2015).
  8. Muratake, H., Hayakawa, A., Nataume, M. A Novel Phenol-Forming Reaction for Preparation of Benzene, Furan, and Thiophene Analogs of CC-1065/Duocarmycin Pharmacophores. Tetrahedron Letters. 38 (43), 7577 (1997).
  9. Viciu, M. S., Germaneau, R. F., Nolan, S. P. Well-Defined, Air-Stable (NHC)Pd(Allyl)Cl (NHC=N-Heterocyclic Carbene) Catalysts for the Arylation of Ketones. Organic Letters. 23 (4), 4053-4056 (2002).
  10. Biscoe, M. R., Buchwald, S. L. Selective Monoarylation of Acetate Esters and Aryl Methyl Ketones Using Aryl Chlorides. Organic Letters. 11 (8), 1773-1775 (2009).
  11. Chobanian, H. R., Liu, P., Chioda, M. D., Guo, Y., Lin, L. S. A facile, microwave-assisted, palladium-catalyzed arylation of acetone. Tetrahedron Letters. 48 (7), 1213-1216 (2007).
  12. Amat, M., Hadida, S., Pshenichnyi, G., Bosch, J. Palladium(0)-Catalyzed Heteroarylation of 2- and 3-Indolylzinc Derivatives. An Efficient General Method for the Preparation of (2-Pyridyl)indoles and Their Application to Indole Alkaloid Synthesis. The Journal of Organic Chemistry. 62 (10), 3158-3175 (1997).
  13. Tennant, G. J., Wallis, C. W., Weaver C, G. Synthesis of the first examples of the imidazo[4,5-c]isoxazole ring system. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1, 817-826 (1999).
  14. Spergel, S. H., Okoro, D. R., Pitts, W. One-Pot Synthesis of Azaindoles via Palladium-Catalyzed α-Heteroarylation of Ketone Enolates. The Journal of Organic Chemistry. 75 (15), 5316-5319 (2010).
  15. Jiang, Y., Liang, G., Zhang, C., Loh, T. P. Palladium-Catalyzed C-S Bond Formation of Stable Enamines with Arene/Alkanethiols: Highly Regioselective Synthesis of β-Amino Sulfides. European Journal of Organic Chemistry. 2016 (20), 3326-3330 (2016).
  16. King, S. M., Buchwald, S. L. Development of a Method for the N-Arylation of Amino Acid Esters with Aryl Triflates. Organic Letters. 18 (16), 4128-4131 (2016).
  17. Ge, S., Hartwig, J. F. Nickel-catalyzed asymmetric alpha-arylation and heteroarylation of ketones with chloroarenes: effect of halide on selectivity, oxidation state, and room-temperature reactions. The Journal of the American Chemical Society. 133 (41), 16330-16333 (2011).
  18. Quillen, A., et al. Palladium-Catalyzed Direct α-C(sp3) Heteroarylation of Ketones under Microwave Irradiation. The Journal of Organic Chemistry. 84 (12), 7652-7663 (2019).
  19. Kremsner, J. M., Kappe, C. O. Silicon Carbide Passive Heating Elements in Microwave-Assisted Organic Synthesis - SI. The Journal of Organic Chemistry. 71 (12), 4651-4658 (2006).
  20. Erythropel, H. C., et al. The Green ChemisTREE: 20 years after taking root with the 12 principles. Green Chemistry. 20 (9), 1929-1961 (2018).
  21. Barge, A., Tagliapietra, S., Tei, L., Cintas, P., Cravotto, G. Pd-catalyzed reactions promoted by ultrasound and/or microwave irradiation. Current Organic Chemistry. 12 (18), 1588-1612 (2008).
  22. Kimura, M., Mukai, R., Tanigawa, N., Tanaka, S., Tamaru, Y. Triethylborane as an efficient promoter for palladium-catalyzed allylation of active methylene compounds with allyl alcohols. Tetrahedron. 59 (39), 7767-7777 (2003).

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