Modello di roditore migliorato di ischemia miocardica e danno da riperfusione

Riepilogo

Il modello di ischemia-riperfusione miocardica del cuore di ratto viene migliorato utilizzando un riavvolgitore autoprodotto, un tubo di cloruro di polivinile e un metodo di annodatura unico. L'elettrocardiogramma, il cloruro di trifeniltetrazolio e la colorazione istologica e i risultati dell'analisi percentuale di sopravvivenza hanno mostrato che il gruppo modello migliorato ha tassi di successo e sopravvivenza più elevati rispetto al gruppo modello già esistente.

Abstract

L'ischemia miocardica e il danno da riperfusione (MIRI), indotti dalla malattia coronarica (CHD), causano danni ai cardiomiociti. Inoltre, le prove suggeriscono che la terapia trombolitica o l'intervento coronarico percutaneo primario (PPCI) non previene le lesioni da riperfusione. Non esiste ancora un modello animale ideale per MIRI. Questo studio mira a migliorare il modello MIRI nei ratti per rendere la chirurgia più facile e più fattibile. Un metodo unico per stabilire MIRI viene sviluppato utilizzando un tubo morbido durante una fase chiave del periodo ischemico. Per esplorare questo metodo, trenta ratti sono stati divisi casualmente in tre gruppi: gruppo fittizio (n = 10); gruppo modello sperimentale (n = 10); e il gruppo di modelli esistente (n = 10). I risultati della colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio, dell'elettrocardiografia e della sopravvivenza percentuale vengono confrontati per determinare le precisioni e i tassi di sopravvivenza delle operazioni. Sulla base dei risultati dello studio, è stato concluso che il metodo chirurgico migliorato è associato a un tasso di sopravvivenza più elevato, a un segmento ST-T elevato e a una maggiore dimensione dell'infarto, che dovrebbe imitare meglio la patologia di MIRI.

Introduzione

La cardiopatia ischemica è la principale causa di mortalità in tutto il mondo. La mortalità cardiovascolare ha un ruolo cruciale nella salute pubblica e nell'epidemiologia a livello globale¹. L'ischemia miocardica e il danno da riperfusione svolgono funzioni essenziali nella cardiopatia ischemica, che si riferisce a un complesso processo fisiopatologico che include l'esaurimento dell'adenosina trifosfato², l'eccessiva generazione di specie reattive dell'ossigeno³, le reazioni infiammatorie⁴ e la disfunzione mitocondriale dovuta al sovraccarico di calcio⁵, che innesca l'infarto miocardico acuto attraverso la disfunzione metabolica e il danno strutturale⁶.

Tuttavia, i meccanismi dettagliati alla base dell'ischemia miocardica e del danno da riperfusione (MIRI) rimangono sconosciuti. Il presente lavoro mira a sviluppare un modello animale unico che simula adeguatamente la presentazione clinica e il trattamento di MIRI. Altrimenti, nel processo di ricerca del modello MIRI, i grandi animali⁷ (come i maiali) richiedono un intervento chirurgico, che è costoso. I piccoli animali (come i conigli⁸, i topi 9,10,11,12 e i ratti ¹³) richiedono un delicato intervento chirurgico al microscopio¹⁰, sacculi telecomandati ^8,11 o spremere il cuore dalla cavità⁹, che richiede un alto livello di tecnologia e può causare diverse complicazioni postoperatorie che disturbano l'accuratezza dei risultati. Un modello MIRI ideale con un tasso di sopravvivenza più elevato e un costo inferiore svolgerà un ruolo cruciale nella ricerca patologica.

Questo studio mirava a combattere questi problemi stabilendo un modello più accessibile e fattibile di MIRI nei ratti per facilitare la ricerca sulla patologia di MIRI, che potrebbe portare alla scoperta di terapie cliniche per MIRI.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (permesso n. 202004A002). Lo studio ha seguito rigorosamente le linee guida del National Institutes of Health (NIH) sull'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 2011). Trenta ratti maschi Sprague-Dawley (peso, 300 ± 50 g; età, 12 ± 14 settimane) sono stati utilizzati in questo lavoro.

1. Preparazione animale

1. Privare i ratti di cibo e acqua per 12 ore prima dell'intervento chirurgico. Il digiuno preoperatorio mira a prevenire l'aspirazione polmonare¹⁴.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'intervento chirurgico utilizzando uno sterilizzatore a vapore ad alta pressione.
3. Anestetizzare i ratti somministrando pentobarbital sodico (1,5%, 75 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale (vedere Tabella dei materiali).
4. Valutare l'efficacia dell'anestesia eseguendo il test del pizzico.toe.
   NOTA: Il ratto è considerato sufficientemente anestetizzato se non si osservano riflessi quando la zampa posteriore è trattenuta dalle pinzette.
5. Raddrizzare la sezione centrale di due graffette per formare una forma a "S". Tirare verso il basso l'ampia sezione di ogni "S" per formare un piccolo riavvolgitore.
6. Tagliare un tubo di cloruro di polivinile (PVC) di 2 mm di diametro in pezzi di 7 mm di lunghezza. Inserire una sutura 4-0 lunga 10 cm nel tubo in PVC e legarne le estremità.
7. Ligate l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) e il tubo in PVC insieme usando una sutura 6-0. Tagliare una scanalatura nel mezzo del tubo in PVC usando forbici oftalmiche e utilizzare la scanalatura per infilare la sutura 6-0 attraverso il tubo per evitare che cada.
   NOTA: il tubo in PVC e i riavvolgitori a forma di "S" sono mostrati nella Figura supplementare 1.

2. Procedura chirurgica

1. Eseguire un intervento chirurgico per generare il modello di ratto MIRI migliorato seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: il gruppo di modelli animali generato dal metodo MIRI migliorato è indicato come gruppo di modelli sperimentali in tutto l'articolo.
   1. Dopo l'anestesia (passaggio 1.2), fissare gli arti del ratto con del nastro adesivo posizionando il ratto sulla lavagna chirurgica in posizione supina. Rasare il collo e l'area anteriore sinistra del torace con crema depilatoria e pulire la pelle con alcol al 75% e scrub iodoforico.
   2. Tagliare la pelle del collo longitudinalmente lungo la linea cervicale mediana usando forbici oftalmiche.
   3. Separare i muscoli del collo usando pinzette oftalmiche e posizionare un divaricatore (passo 1.4) su ciascun lato per ritrarli ulteriormente.
      NOTA: È necessario esporre adeguatamente la trachea, in quanto è fondamentale per prevenire il sanguinamento dalla ghiandola tiroidea durante questo passaggio.
   4. Dopo aver esposto la trachea, identificare lo spazio tra il quarto e il quinto anello tracheale. Questo spazio è il punto di foratura.
   5. Segna questo punto usando il bordo smussato della punta di un ago. Fai un'incisione di 3 mm parallela alla cartilagine cricoide a questo punto.
   6. Inserire un trocar di aspirazione (vedere Tabella dei materiali) nella trachea attraverso l'incisione (punto 2.1.5) e ventilare meccanicamente il ratto per mantenere la normale respirazione ad una velocità di 80 respiri/min e un volume di marea di 8 ml/kg.
   7. Quindi, fai un'incisione di 4-5 cm dallo xifoide al centro del secondo spazio intercostale sinistro mentre tieni il bisturi con un angolo di 45 °. Delicatamente e lentamente, separare i muscoli pettorali maggiori e serrato anteriori usando pinzette oftalmiche per accedere allo spazio intercostale.
   8. Fai un'incisione di 1,5 cm trasversalmente tra la terza e la quarta costola sinistra usando le forbici oftalmiche.
   9. Se necessario, ritagliare la quarta costola per esporre il cuore coperto dal polmone sinistro. Questo dà una migliore visibilità.
   10. Per prevenire lesioni, posizionare batuffoli di cotone imbevuti della soluzione salina fisiologica sopra i polmoni nella cavità toracica. Sezionare il pericardio usando pinzette oftalmiche, sollevare l'appendice atriale sinistra con una pinzetta e identificare l'ostio coronarico presente alla radice dell'arteria aortica.
   11. Nella sezione tra il polmone sinistro e il padiglione auricolare, legare insieme il LAD e il tubo corto pre-preparato (fase 1.6) usando una sutura chirurgica 6-0 e legarlo usando uno slipknot. Posizionare lo slipknot nella scanalatura del tubo in PVC e stringere il tubo legato e il LAD usando un secondo slipknot per 45 min¹⁵ (Figura 1A,B).
   12. Registrare il cambiamento di colore nella parte anteriore del ventricolo sinistro e l'elevazione del segmento ST sull'elettrocardiogramma (ECG) durante il periodo di ischemia.
       NOTA: La parte anteriore del ventricolo sinistro diventa pallida durante il periodo di ischemia.
   13. Blocca i muscoli del torace e la pelle usando una clip per arterie e copri la ferita con una garza salina umida.
   14. Allentare lo slipknot e rimuovere il tubo corto pre-preparato dopo 45 min¹⁵ (Figura 1C).
   15. Tenere i ratti anestetizzati durante la riperfusione per 2 ore.
2. Eseguire un intervento chirurgico per generare il modello di ratto seguendo la procedura precedentemente pubblicata¹⁶.
   NOTA: questo gruppo di modelli animali viene definito gruppo di modelli esistente in tutto l'articolo.
   1. Prima della legatura dell'arteria coronaria LAD, eseguire gli stessi passaggi del gruppo modello sperimentale.
   2. Durante il periodo ischemico, legare l'arteria coronaria LAD prossimale di ciascun ratto con uno slipknot solo utilizzando una sutura chirurgica 6-0 nella stessa posizione del gruppo modello sperimentale e legare uno slipknot per 45 min.
   3. Dopo la legatura, allentare lo slipknot con una pinzetta, suturare le incisioni del ratto con un ago di sutura e una pinzetta e mantenere l'animale in anestesia profonda all'1,5% di pentobarbital sodico per tutto il periodo di riperfusione 17,18,19 per 2 ore prima di raccogliere i cuori del ratto.

3. Valutazione della colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio

1. Alla fine della riperfusione, i ratti vengono eutenizzati mentre sono ancora profondamente anestetizzati. Sacrifica i topi e raccogli immediatamente i loro cuori^16,20. Lavare i cuori in soluzione pbs e conservarli a -20 °C per ~20 minuti per indurire i tessuti.
2. Successivamente, tagliare i cuori in fette da 2 mm con una lama microtomatica, incubarli con cloruro di trifeniltetrazolio al 2% (TTC) (vedi Tabella dei materiali) a 37 °C per ~ 30 minuti e fissarli in formalina neutra al 10%.
3. Fotografare le fette di cuore e calcolare le aree di infarto utilizzando un programma di elaborazione delle immagini del software ImageJ (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: A causa della colorazione, i siti di infarto appaiono bianco pallido, mentre i tessuti normali appaiono rosso scuro.

4. Colorazione istologica

1. Raccogli i cuori in anestesia profonda con l'1,5% di pentobarbital sodico alla fine del periodo di riperfusione.
2. Fissare i cuori in formalina al 10% a 4 °C per 48 ore.
3. Successivamente, sezionare i cuori con un microtomo in almeno 6 fette (5 μm di spessore) e garantire almeno tre fette per ematossilina ed eosina (H&E) e colorazione Masson^20,21.
4. Osserva i vetrini al microscopio ottico e fotografali.

5. Valutazione ECG

1. Dividere casualmente gli animali in gruppi modello MIRI sperimentali o esistenti o gruppi fittizi per valutare i cambiamenti dell'ECG.
2. Anestetizzare tutti i ratti durante le legature chirurgiche e valutare il lead II standard degli arti tracciando^20,21 per identificare i cambiamenti dell'ECG e confermare l'ischemia miocardica.
3. Memorizza tutte le immagini in una libreria digitale.

6. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando grafici scientifici e software statistici (vedi Tabella dei materiali).
2. Esprimere tutti i dati come media ± errore standard della media. Dopo i test di normalità e lognormalità di ciascun gruppo, eseguire un'analisi unidirezionale della varianza e t-test²² per determinare differenze significative tra i gruppi. Considera il valore p <0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Colorazione TTC
Le sezioni cardiache di ratti che hanno subito la procedura MIRI esistente o migliorata o un intervento chirurgico fittizio sono state macchiate con TTC e le immagini sono state archiviate digitalmente e analizzate utilizzando ImageJ. I ratti sottoposti alle procedure MIRI già esistenti o migliorate hanno avuto infarti miocardici, mentre i ratti del gruppo sham non lo hanno fatto (Figura 2B). Rispetto ai ratti del gruppo sham, i ratti nei gruppi modello MIRI esistenti (p < 0,0001) e sperimentali (p < 0,0001) avevano una differenza significativa nella dimensione dell'infarto miocardico e il gruppo modello sperimentale aveva una dimensione dell'infarto miocardico più grande rispetto al gruppo modello esistente (p = 0,0176) (Figura 3B).

Colorazione istologica
L'analisi di campioni colorati utilizzando macchie di H&E e Masson ^22,23 ha mostrato che rispetto al gruppo sham, i cardiomiociti sia del gruppo modello sperimentale che di quello esistente avevano subito danni critici e nucleolisi ed erano infiltrati da numerosi neutrofili (Figura 3).

Test ECG
I segmenti ECG ST-T dei ratti nei gruppi modello MIRI esistenti e sperimentali sono stati elevati rispetto a quelli dei ratti nel gruppo sham (Figura 4A) e le differenze tra il modello sperimentale e i gruppi sham (p < 0,0001) o il modello esistente e i gruppi sham (p < 0,0001) sono state significative (Figura 4B). Inoltre, il segmento ST-T era più elevato nel gruppo modello sperimentale rispetto al gruppo modello esistente (p = 0,0274) (Figura 4C).

Percentuale di sopravvivenza
Il tasso di sopravvivenza era significativamente diverso tra i due gruppi modello MIRI (Figura 4D). Quattro dei dieci ratti sono morti nel gruppo modello esistente. Il tasso di mortalità è stato del 40% durante il periodo di riperfusione. Al contrario, nessuno dei ratti nel gruppo modello sperimentale è morto durante l'intervento chirurgico, dimostrando che l'attuale modello migliorato aveva un tasso di sopravvivenza più elevato (p = 0,0291).

Figura 1: Fasi chiave della chirurgia modello di lesione ischemica e riperfusione miocardica (MIRI). I punti verdi indicano il protocollo della legatura durante il periodo ischemico, incluso il posizionamento del tubo morbido sulle arterie coronarie (A), l'aggancio della linea di sutura nella scanalatura del tubo morbido pre-preparato (B), l'allentamento dello slipknot e la rimozione del tubo morbido quando è stato avviato il periodo di riperfusione (barra della scala = 1 cm) (C ). LAA: Appendice atriale sinistra, RAA: Appendice atriale destra, LAD: Discendente anteriore sinistra, RCA: Arteria coronaria destra, IVC: Vena cava inferiore, SVC: Vena cava superiore, AO: Arteria aorta, PA: Arteria polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'intera procedura chirurgica e le differenze nella colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio (TTC) tra i diversi gruppi. Vengono mostrati il piccolo riavvolgitore pre-preparato (barra della scala = 15 mm), il tubo morbido (barra della scala = 10 mm) e l'intero intervento chirurgico (barra della scala = 15 mm). Trenta ratti sono stati divisi casualmente in gruppi sperimentali (n = 10), gruppi fittizi (n = 10) e modelli esistenti (n = 10). La colorazione TTC ha indicato che sia i gruppi di modelli sperimentali che quelli esistenti hanno avuto cambiamenti significativi rispetto al gruppo sham (B). La parete anteriore del miocardio nella parete sperimentale e laterale nei gruppi modello esistenti è diventata bianca pallida, confermando la posizione dell'area ischemica (barra della scala = 5 mm). Il "modello esistente" è raffigurato come il "vecchio modello" nella figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Differenze nella colorazione H&E e Masson tra i gruppi. Trenta ratti maschi di Sprague Dawley sono stati divisi in modo casuale in gruppi sperimentali (n = 10), gruppi fittizi (n = 10) e modelli esistenti (n = 10) e viene mostrato il confronto dei cambiamenti morfologici cellulari tra i gruppi (barra di scala = 2 mm). L'ematossilina e l'eosina (H & E) e la colorazione di Masson mostrano che le cellule miocardiche del modello sperimentale e dei gruppi modello esistenti hanno danni critici, nucleolisi e sono infiltrate da numerosi neutrofili rispetto a quelli del gruppo sham (barra di scala = 100 μm). Il "modello esistente" è raffigurato come il "vecchio modello" nella figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Differenze nei risultati statistici tra i gruppi. Trenta ratti maschi di Sprague Dawley sono stati divisi in modo casuale nei gruppi sperimentali (n = 10), nel gruppo fittizio (n = 10) e nei gruppi modello esistente (n = 10). I risultati dell'elettrocardiogramma mostrano che rispetto al gruppo modello già esistente, il gruppo modello sperimentale ha una dimensione dell'infarto miocardico più grande (****p < 0,0001, *p = 0,0176) (A), un aumento del segmento ST più elevato (****p < 0,0001, *p = 0,0274) (B) e una percentuale di sopravvivenza più elevata (p = 0,0291) (C ). In particolare, i ratti del gruppo modello esistente avevano maggiori probabilità di morire all'inizio del periodo di ischemia e all'inizio del periodo di riperfusione (D). Il "modello esistente" è raffigurato come il "vecchio modello" nella figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: I dettagli del riavvolgitore pre-preparato e del tubo in PVC. Vengono mostrati il riavvolgitore pre-preparato (A) e il tubo in PVC (B). Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

La principale differenza tra i metodi già esistenti e migliorati era l'uso di tubi in PVC nel processo di legatura. Nel metodo chirurgico esistente, il tessuto miocardico è stato legato utilizzando solo la sutura di seta 6-0, che ha indotto danni al miocardio durante la legatura con conseguente morte intraoperatoria. Inoltre, la pulsazione del cuore allenterebbe lo slipknot. Al contrario, nel metodo migliorato con il tubo in PVC, lo slipknot posto nella scanalatura del tubo potrebbe essere stretto e l'area del miocardio interessata dalla legatura aumentata. Questi benefici sono stati osservati durante la procedura sperimentale e confermati dai risultati della colorazione TTC e della percentuale di sopravvivenza.

Il passo critico del metodo chirurgico migliorato è stato il posizionamento del tubo morbido sull'arteria coronaria LAD prossimale, accompagnato da nervi, vasi linfatici e tessuto miocardico durante la legatura nel periodo ischemico. Questo tubo morbido pre-preparato può fungere da cuscino che protegge i tessuti periferici (nervi, miocardia e vasi linfatici) e diminuisce la mortalità durante la legatura dell'arteria coronaria. L'intervento chirurgico eseguito con il metodo già esistente era simile all'intervento chirurgico per infarto miocardico. I risultati percentuali di sopravvivenza hanno indicato che i ratti nel gruppo modello esistente sono morti principalmente durante il periodo ischemico (due ratti sono morti a 2 minuti dopo la legatura e due ratti sono morti a 45 minuti dopo la legatura). Altrimenti, le cause alla base della morte non sono ancora chiare e ci sono una serie di ipotesi, tra cui ulteriori danni alle strutture nervose²³, ai vasi linfatici e alla miocardia.

Per quanto riguarda il danno nervoso, studi precedenti hanno indicato che durante il periodo ischemico nel modello animale, oltre agli effetti locali diretti dell'ischemia sulle strutture nervose, c'è probabilmente anche una significativa diminuzione dei livelli di neuropeptide Y (NPY) che contribuiscono a disturbi nel trasporto axoplasmatico nell'innervazione simpatica²⁴. Questa scoperta concorda con i risultati riportati da Han et ^al.25, che hanno rivelato che una graduale scomparsa di NPY si è verificata all'interno del miocardio infartuato dopo la legatura dell'arteria coronaria LAD nei ratti. Tuttavia, il ruolo dell'NPY in questo contesto rimane poco chiaro. La sua delezione attenua la disfunzione cardiaca e l'apoptosi durante l'infarto miocardico acuto²⁶ ed è associata ad aritmia²⁷, ipertensione e funzione microvascolare coronarica²⁸.

Inoltre, l'ostruzione avversa del flusso linfatico cardiaco si è verificata durante il periodo ischemico, portando a grave edema cardiaco, disfunzione sinistra ed emorragie²⁹, che potrebbero essere un'altra causa di morte nei ratti. Durante questo processo patologico, la legatura dell'arteria coronaria LAD potrebbe essere attribuita all'ostruzione delle arterie coronarie o al trasporto linfatico cardiaco all'interno dell'area dell'infarto, che può causare ulteriori complicazioni, come il rimodellamento avverso dei linfatici del collettore epicardico, il flusso linfatico ridotto e l'edema persistente³⁰.

Pertanto, la circolazione nei vasi linfatici svolge un ruolo funzionale nell'omeostasi cardiaca³¹ e nella guarigione delle ferite³², e i risultati percentuali di sopravvivenza in questo studio suggeriscono che la procedura chirurgica MIRI migliorata potrebbe evitare danni linfatici e promuovere la riperfusione linfatica posizionando il tubo morbido sull'arteria coronaria LAD durante la legatura. In confronto, il metodo chirurgico esistente ha maggiori probabilità di strappare il muscolo cardiaco e causare una massiccia emorragia durante la legatura dell'arteria coronaria LAD, senza l'effetto ammortizzante del tubo morbido. Inoltre, il diametro del tubo morbido pre-preparato era molto più grande della sutura di seta 6-0 e il tubo potrebbe essersi contratto e indurre una dimensione di infarto maggiore quando lo slipknot era legato al tubo durante il periodo ischemico.

Questo studio aveva alcune limitazioni. La dimensione dell'infarto del cuore è stata analizzata nell'esperimento preliminare. La formula di sostituzione (N = 7,75) è stata calcolata utilizzando un'equazione³³ precedentemente riportata. Considerando la possibile morte di ratti durante l'operazione, N è stato aumentato del 25%; quindi, n = 10 (dieci ratti per ogni gruppo) è stato deciso. Altrimenti, il metodo già esistente per generare il modello MIRI aveva un alto tasso di mortalità. Pertanto, pochi casi (bassa dimensione del campione) nel gruppo modello sperimentale hanno influenzato i risultati statistici. Diverse valutazioni, tra cui l'ecocardiografia³⁰, la colorazione blu evans³⁴ e la misurazione dell'enzima miocardico³⁵, sono state essenziali per la valutazione e l'analisi della funzione cardiaca. A causa delle basse dimensioni del campione di questo lavoro, queste valutazioni non sono state eseguite e saranno descritte in un futuro studio di ricerca farmacodinamica in MIRI. Tuttavia, considerando che la procedura chirurgica esistente per generare il modello MIRI è associata a un ampio danno miocardico, vale la pena segnalare questo metodo attuale per migliorare la modellazione di MIRI nei ratti e portare luce a questo modello preclinico che simula correttamente la cardiopatia ischemica.

In conclusione, il metodo chirurgico migliorato per generare il modello MIRI aveva un tasso di sopravvivenza più elevato, un segmento ST-T elevato e una dimensione dell'infarto maggiore rispetto al metodo di generazione del modello MIRI esistente, suggerendo che il modello migliorato simula meglio la patologia MIRI.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Formalin	Chunyu, China	_
2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride	Solarbio, China	T8107
75% Alchol	SCR, China	10009261
Artery Clip	Zhonglin Dongsheng, China	6.5cm
Camera	Olympus Corporation, Japan	EPL5
Cotton ball	Huachen, China	_
Dpilatory cream	Veet, China	_
Eye speculum	Shanghai Jingzhong, China	_
Gauze	Zhonggan, China	_
GraphPad	GraphPad Software, USA	8.0
H&E Kit	Solarbio, China	G1120
High-pressure steam sterilizer	TOMY, Japan	SX-500
ImageJ	NIH, USA	_
Masson Kit	Solarbio, China	G1340
Medical Tape	Mr.Song, China	_
Microscope	Olympus Corporation, Japan	CKX31
Microscopy	TEKSQRAY, China	_
Microtome	Leica, Germany	RM2235
Microtome Blade	Leica, Germany	819
Needle holder	Shanghai Jingzhong, China	_
Ophthalmic scissors	Shanghai Jingzhong, China	_
Ophthalmic tweezers	Shanghai Jingzhong, China	_
Paper clip	Chenguang, China	ABS91613
Physiological saline solution	Kelun, China	_
Powerlab ECG	ADINSTRUMENTS ,China	4/35
PVC tube	Guanzhijia, China	_
Small animal ventilator	TECHMAN, China	HX-101E
Sodium Pentobarbital	SIGEMA, USA	1030001
Suction trocar	TECHMAN, China	HX-101E
Suture line	Lingqiao, China	4-0
Suture needle with thread	Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China	6-0