Modelo de roedor melhorado de Isquemia do Miocárdio e Lesão de Reperfusão

Resumo

O modelo de isperfusão de isquessões miocárdicas de coração de rato é melhorado usando um retrátil auto-fabricado, tubo de cloreto de polivinil e um método único de nó. Os resultados de eletrocardiograma, cloreto de tripheniltetrazolium e coloração histológica, e os resultados de análise de sobrevivência percentual mostraram que o grupo modelo melhorado tem maior sucesso e taxas de sobrevivência do que o grupo modelo já existente.

Resumo

Isquemia miocárdica e lesão por reperfusão (MIRI), induzida por doença cardíaca coronariana (ACC), causa danos aos cardiomiócitos. Além disso, evidências sugerem que a terapia trombolítica ou intervenção coronária percutânea primária (PPCI) não previne lesões por reperfusão. Ainda não existe um modelo animal ideal para o MIRI. Este estudo tem como objetivo melhorar o modelo de MIRI em ratos para tornar a cirurgia mais fácil e viável. Um método único para estabelecer o MIRI é desenvolvido usando um tubo macio durante uma etapa chave do período isquêmico. Para explorar este método, trinta ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos: grupo falso (n = 10); grupo modelo experimental (n = 10); e grupo modelo existente (n = 10). Os achados de coloração de cloreto de triphenyltetrazolium, eletrocardiografia e por cento de sobrevivência são comparados para determinar as precisão e taxas de sobrevivência das operações. Com base nos resultados do estudo, concluiu-se que o método de cirurgia melhorado está associado a uma maior taxa de sobrevivência, segmento ST-T elevado e maior tamanho do infarto, que deverá imitar melhor a patologia do MIRI.

Introdução

A doença isquêmica do coração é a principal causa de mortalidade em todo o mundo. A mortalidade cardiovascular tem um papel crucial na saúde pública e na epidemiologia globalmente¹. Isquemia do miocárdio e lesão de reperfusão desempenham funções essenciais na doença isquêmica do coração, que se refere a um processo fisiopatológico complexo que inclui esgotamento do triphosfato de adenosina², geração excessiva de espécies reativas de oxigênio³, reações inflamatórias⁴ e disfunção mitocondrial devido à sobrecarga de cálcio⁵, que desencadeia infarto agudo do miocárdio através de disfunção metabólica e danos estruturais⁶.

No entanto, os mecanismos detalhados subjacentes à isquemia do miocárdio e lesão por reperfusão (MIRI) permanecem desconhecidos. O presente trabalho tem como objetivo desenvolver um modelo animal único que simule adequadamente a apresentação clínica e o tratamento do MIRI. Caso contrário, no processo de pesquisa do modelo MIRI, animais de grande^{porte 7} (como suínos) necessitam de cirurgia intervencionista, o que é caro. Animais de pequeno porte (como coelhos⁸, camundongos 9,10,11,12 e ratos¹³) necessitam de cirurgia delicada sob microscopia¹⁰, saccultos de controle remoto ^8,11, ou espremer o coração para fora da cavidade⁹, o que requer um alto nível de tecnologia e pode causar várias complicações pós-operatórias que perturbam a precisão dos achados. Um modelo ideal de MIRI com maior taxa de sobrevivência e menor custo desempenhará um papel crucial na pesquisa patológica.

Este estudo teve como objetivo combater essas questões, estabelecendo um modelo mais acessível e viável de MIRI em ratos para facilitar a pesquisa sobre a patologia do MIRI, o que poderia levar à descoberta de terapias clínicas para o MIRI.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (permissão nº 202004A002). O estudo seguiu rigorosamente as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sobre o Uso de Animais de Laboratório (publicação NIH nº 85-23, revisada em 2011). Trinta ratos sprague-dawley masculinos (peso, 300 ± 50 g; idade, 12 ± 14 semanas) foram utilizados neste trabalho.

1. Preparação animal

1. Privar os ratos de comida e água por 12 h antes da cirurgia. O jejum pré-operatório visa prevenir a aspiração pulmonar¹⁴.
2. Esterilize todos os instrumentos antes da cirurgia usando um esterilizador a vapor de alta pressão.
3. Anestesiar os ratos administrando sódio pentobarbital (1,5%, 75 mg/kg) via injeção intraperitoneal (ver Tabela de Materiais).
4. Avalie a eficácia da anestesia realizando o teste do dedo do ponta dos andares.
   NOTA: O rato é considerado suficientemente anestesiado se não forem observados reflexos quando sua pata traseira é segurada pelas pinças.
5. Endireitar a seção do meio de dois clipes de papel para formar uma forma "S". Puxe para baixo a seção larga de cada "S" para formar um pequeno retrátil.
6. Corte um tubo de cloreto de polivinil de 2 mm de diâmetro (PVC) em pedaços de 7 mm de comprimento. Insira uma sutura de 4-0 de comprimento de 10 cm de comprimento no tubo de PVC e amarre suas extremidades.
7. Ligate a artéria coronária anterior esquerda (LAD) e o tubo de PVC juntos usando uma sutura 6-0. Corte uma ranhura no meio do tubo de PVC usando uma tesoura oftálmica e use a ranhura para enfiar a sutura 6-0 através do tubo para evitar que ela caia.
   NOTA: Os retres de forma de PVC e "S" são mostrados na Figura Suplementar 1.

2. Procedimento cirúrgico

1. Realizar uma cirurgia para gerar o modelo de rato MIRI melhorado seguindo as etapas abaixo.
   NOTA: O grupo modelo animal gerado pelo método MIRI melhorado é referido como o grupo modelo experimental ao longo do artigo.
   1. Após a anestesia (etapa 1.2), fixar os membros do rato com fita, colocando o rato na placa cirúrgica na posição supina. Raspe o pescoço e a área anterior do peito com creme depilatório, e limpe a pele com 75% de álcool e esfoliante de iodophor.
   2. Corte a pele do pescoço longitudinalmente ao longo da linha cervical mediana usando tesoura oftálmica.
   3. Separe os músculos do pescoço usando pinças oftálmicas e coloque um retrátil (passo 1.4) em cada lado para retratá-los ainda mais.
      NOTA: É necessário expor adequadamente a traqueia, pois é fundamental para evitar sangramentos da glândula tireoide durante esta etapa.
   4. Depois de expor a traqueia, identifique o espaço entre o quarto e o quinto anéis traqueais. Este espaço é o ponto de perfuração.
   5. Marque este ponto usando a borda cega de uma ponta de agulha. Faça uma incisão de 3 mm paralela à cartilagem cricoide neste momento.
   6. Insira um trocarte de sucção (ver Tabela de Materiais) na traqueia através da incisão (etapa 2.1.5), e ventile mecanicamente o rato para manter a respiração normal a uma taxa de 80 respirações/min e um volume de maré de 8 mL/kg.
   7. Em seguida, faça uma incisão de 4-5 cm do xifoide para o meio do segundo espaço intercostal esquerdo enquanto segura o bisturi em um ângulo de 45°. Suavemente e lentamente, separe os músculos peitoral e serratus anterior usando pinças oftálmicas para acessar o espaço intercostal.
   8. Faça uma incisão de 1,5 cm transversalmente entre a terceira esquerda e a quarta costelas usando uma tesoura oftálmica.
   9. Se necessário, corte a quarta costela para expor o coração coberto pelo pulmão esquerdo. Isso dá melhor visibilidade.
   10. Para evitar lesões, coloque bolas de algodão encharcadas na solução fisiológica salina acima dos pulmões na cavidade torácica. Disseca o pericárdio usando pinças oftálmicas, levante o apêndice atrial esquerdo por pinças e identifique o ostium coronário presente na raiz da artéria aórtica.
   11. Na seção entre o pulmão esquerdo e a aurícula, ligate o LAD e o tubo curto pré-preparado (passo 1.6) juntos usando uma sutura cirúrgica 6-0, e amarre-o usando um slipknot. Coloque o slipknot na ranhura do tubo de PVC e aperte o tubo ligado e LAD usando um segundo slipknot por 45 min¹⁵ (Figura 1A,B).
   12. Regissuor da mudança de cor na parte anterior do ventrículo esquerdo e elevação do segmento ST no eletrocardiograma (ECG) durante o período de isquemia.
       NOTA: A parte anterior do ventrículo esquerdo fica pálida durante o período de isquemia.
   13. Fixar os músculos do peito e a pele usando um clipe de artéria, e cobrir a ferida com gaze salina úmida.
   14. Solte o slipknot e remova o tubo curto pré-preparado após 45 min¹⁵ (Figura 1C).
   15. Mantenha os ratos anestesiados durante a reperfusão por 2h.
2. Realizar cirurgia para gerar o modelo de rato após o procedimento publicado anteriormente¹⁶.
   NOTA: Este grupo de modelos animais é referido como o grupo modelo existente ao longo do artigo.
   1. Antes da ligadura da artéria coronária LAD, realize os mesmos passos do grupo modelo experimental.
   2. Durante o período isquêmico, ligate a artéria coronária lad proximal de cada rato com um slipknot usando apenas uma sutura cirúrgica 6-0 na mesma posição do grupo modelo experimental e amarre um slipknot por 45 min.
   3. Após a ligadura, solte o slipknot com pinças, suture as incisões do rato com uma agulha de sutura e pinça, e mantenha o animal em anestesia profunda de 1,5% de sódio pentobarbital durante todo o período de reperfusão 17,18,19 por 2 h antes de colher o coração do rato.

3. Avaliação da coloração do cloreto de tripheniltetrazolium

1. No final da reperfusão, os ratos são euthenizados enquanto ainda profundamente anestesiados. Sacrifique os ratos e colher seus corações^16,20 imediatamente. Lave os corações na solução PBS e armazene-os a -20 °C por ~20 min para endurecer os tecidos.
2. Posteriormente, corte os corações em fatias de 2 mm com uma lâmina de microtome, incuba-os com 2% de cloreto de tripheniltetrazolium (TTC) (ver Tabela de Materiais) a 37 °C por ~30 min, e fixe-os em formalina neutra de 10%.
3. Fotografe as fatias do coração e calcule as áreas de infarto usando um programa de processamento de imagem do software ImageJ (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Devido à coloração, os locais de infarto parecem brancos pálidos, enquanto os tecidos normais parecem vermelho escuro.

4. Coloração histológica

1. Colher os corações sob anestesia profunda de 1,5% de sódio pentobarbital no final do período de reperfusão.
2. Fixar os corações em 10% de formalina a 4 °C por 48 h.
3. Posteriormente, sele os corações com um microtome em pelo menos 6 fatias (5 μm de espessura) e garanta pelo menos três fatias para hematoxilina e eosina (H&E) e Masson manchando ^20,21.
4. Observe os slides sob um microscópio leve e fotografe-os.

5. Avaliação do ECG

1. Divida aleatoriamente os animais em grupos modelos MIRI experimentais ou existentes ou grupos falsos para avaliar as alterações do ECG.
2. Anestesiar todos os ratos durante as ligaduras cirúrgicas e avaliar o chumbo padrão do membro II traçando^20,21 para identificar alterações de ECG e confirmar a isquemia do miocárdio.
3. Guarde todas as imagens em uma biblioteca digital.

6. Análise estatística

1. Realizar análises estatísticas utilizando gráficos científicos e software estatístico (ver Tabela de Materiais).
2. Expresse todos os dados como ± erro padrão da média. Após normalidade e testes de lognormalidade de cada grupo, realize uma análise unidirecionais de variância e t-testes²² para determinar diferenças significativas entre os grupos. Considere o valor p <0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Coloração TTC
Seções cardíacas de ratos submetidos ao procedimento MIRI existente ou melhorado ou cirurgia falsa foram manchadas com TTC, e as imagens foram armazenadas digitalmente e analisadas usando ImageJ. Os ratos submetidos aos procedimentos MIRI já existentes ou melhorados tiveram infartos do miocárdio, enquanto os ratos do grupo falso não (Figura 2B). Em comparação com ratos do grupo sham, os ratos nos grupos de modelos MIRI existentes (p < 0,0001) e experimentais (p < 0,0001) os grupos modelo MIRI tiveram uma diferença significativa no tamanho do infarto do miocárdio, e o grupo de modelo experimental apresentou um tamanho infarto miocárdico maior do que o grupo modelo existente (p = 0,0176) (Figura 3B).

Manchas histológicas
A análise de espécimes manchados usando manchas de H&E e Masson^22,23 mostrou que, em comparação com o grupo falso, os cardiomiócitos tanto dos grupos experimentais quanto dos modelos existentes sofreram danos críticos e nucleolise e foram infiltrados por numerosos neutrófilos (Figura 3).

Teste de ECG
Os segmentos ECG ST-T de ratos nos grupos modelo MIRI existentes e experimentais foram elevados em comparação com os de ratos do grupo sham (Figura 4A), e as diferenças entre o modelo experimental e os grupos falsos (p < 0,0001) ou os grupos modelo e farsa existentes (p < 0,0001) foram significativas (Figura 4B). Além disso, o segmento ST-T foi mais elevado no grupo de modelos experimentais do que no grupo modelo existente (p = 0,0274) (Figura 4C).

Por cento de sobrevivência
A taxa de sobrevivência foi significativamente diferente entre os dois grupos modelo MIRI (Figura 4D). Quatro dos dez ratos morreram no grupo modelo existente. A taxa de mortalidade foi de 40% durante o período de reperfusão. Em contrapartida, nenhum dos ratos do grupo modelo experimental morreu durante a cirurgia, demonstrando que o modelo melhorado atual apresentou maior taxa de sobrevivência (p = 0,0291).

Figura 1: Passos-chave da cirurgia do modelo isquêmico e de reperfusão do miocárdio (MIRI). Pontos verdes indicam o protocolo de ligadura durante o período isquêmico, incluindo a colocação do tubo macio nas artérias coronárias (A), o gancho da linha de sutura na ranhura do tubo macio pré-preparado (B), afrouxamento do slipknot e remoção do tubo macio quando o período de reperfusão foi iniciado (barra de escala = 1 cm) (C ). LAA: Apêndice Atrial Esquerdo, RAA: Apêndice Atrial Direito, LAD: Descendente Anterior Esquerdo, RCA: Artéria Coronária Direita, IVC: Veia Inferior Cava, SVC: Superior Vena Cava, AO: Artéria aorta, PA: Artéria Pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Todo o procedimento cirúrgico e diferenças na coloração do cloreto de tripheniltetrazolium (TTC) entre diferentes grupos. O retículo pequeno pré-preparado (barra de escala = 15 mm), o tubo macio (barra de escala = 10 mm) e toda a cirurgia (barra de escala = 15 mm) são mostrados (A). Trinta ratos foram divididos aleatoriamente nos grupos experimental (n = 10), grupo falso (n = 10) e modelo existente (n = 10). A coloração do TTC indicou que tanto os grupos dos modelos experimentais quanto os existentes tiveram mudanças significativas em relação ao grupo sham (B). A parede anterior do miocárdio no experimental e a parede lateral nos grupos modelo existentes ficou pálida, confirmando a localização da área isquêmica (barra de escala = 5 mm). O "modelo existente" é retratado como o "modelo antigo" na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diferenças na mancha de H&E e Masson entre os grupos. Trinta ratos de Sprague Dawley foram divididos aleatoriamente nos grupos experimentais (n = 10), grupo falso (n = 10) e modelo existente (n = 10) e a comparação de alterações morfológicas celulares entre os grupos é mostrada (barra de escala = 2 mm). Hematoxylin e Eosin (H&E), e as manchas de Masson mostram que as células miocárades do modelo experimental e dos grupos de modelos existentes têm danos críticos, nucleolise, e são infiltradas por numerosos neutrófilos em comparação com as do grupo falso (barra de escala = 100 μm). O "modelo existente" é retratado como o "modelo antigo" na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Diferenças nos resultados estatísticos entre os grupos. Trinta ratos de Sprague Dawley foram divididos aleatoriamente nos grupos experimentais (n = 10), sham group (n = 10) e modelo existente (n = 10). Os achados do eletrocardiograma mostram que, em comparação com o grupo modelo já existente, o grupo de modelos experimentais tem um tamanho maior de infarto miocárdio (****p < 0,0001, *p = 0,0176) (A), maior elevação do segmento ST (****p < 0,0001, *p = 0,0274) (B) e maior percentual de sobrevida (p = 0,0291) (C ). Especialmente, ratos do grupo modelo existente eram mais propensos a morrer no início do período de isquemia e no início do período de reperfusão (D). O "modelo existente" é retratado como o "modelo antigo" na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Os detalhes do retículo pré-preparado e do tubo de PVC. O retículo pré-preparado (A) e o tubo de PVC (B) são mostrados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

A principal diferença entre os métodos já existentes e aprimorados foi o uso de tubos de PVC no processo de ligadura. No método de cirurgia existente, o tecido miocárdio foi ligado usando apenas a sutura de seda 6-0, que induziu danos ao miocárdio durante a ligadura resultando em morte intraoperatória. Além disso, a pulsação do coração afrouxaria o slipknot. Em contraste, no método melhorado com o tubo de PVC, o slipknot colocado na ranhura do tubo poderia ser apertado, e a área do miocárdio afetada pela ligadura aumentou. Esses benefícios foram observados durante o procedimento experimental e confirmados pelos achados de coloração e sobrevida por cento do TTC.

A etapa crítica do método de cirurgia melhorada foi colocar o tubo macio na artéria coronária proximal LAD, acompanhado de nervos, vasos linfáticos e tecido miocárdio durante a ligadura no período isquêmico. Este tubo macio pré-preparado pode atuar como uma almofada que protege os tecidos periféricos (nervos, miocártia e vasos linfáticos) e diminui a mortalidade durante a ligadura da artéria coronária. A cirurgia realizada pelo método já existente foi semelhante à cirurgia para infarto do miocárdio. Os achados de sobrevivência por cento indicaram que os ratos do grupo modelo existente morreram principalmente durante o período isquêmico (dois ratos morreram a 2 min após a ligadura, e dois ratos morreram aos 45 min pós-ligadura). Caso contrário, as causas básicas da morte ainda não são claras, e há uma série de hipóteses, incluindo danos adicionais às estruturas nervosas²³, vasos linfáticos e miocártia.

Em relação aos danos nervosos, estudos anteriores indicaram que durante o período isquêmico no modelo animal, além dos efeitos locais diretos da isquemia nas estruturas nervosas, também há também uma diminuição significativa nos níveis de neuropeptídeos Y (NPY) que contribuem para distúrbios no transporte axoplasmático na inervação simpática²⁴. Este achado concorda com os resultados relatados por Han et ^al.25, que revelaram que um desaparecimento gradual da NPY ocorreu dentro do miocárdio infartado após a ligadura da artéria coronária LAD em ratos. No entanto, o papel da NPY neste contexto permanece incerto. Sua exclusão atenua disfunção cardíaca e apoptose durante o infarto agudo do miocárdio²⁶, e está associada à arritmia²⁷, pressão alta e função microvascular coronariana²⁸.

Além disso, a obstrução adversa do fluxo linfático cardíaco ocorreu durante o período isquêmico, levando a edema cardíaco grave, disfunção esquerda e hemorragias²⁹, o que pode ser outra causa de morte em ratos. Durante esse processo patológico, a ligadura da artéria coronária LAD pode ser atribuída à obstrução das artérias coronárias ou ao transporte linfático cardíaco dentro da área infarto, o que pode causar complicações adicionais, como remodelação adversa dos linfáticos coletores epicádicos, redução do fluxo linfático e edema persistente³⁰.

Portanto, a circulação em vasos linfáticos desempenha um papel funcional na homeostase cardíaca³¹ e na cicatrização da ferida³², e os achados por cento de sobrevivência neste estudo sugerem que o melhor procedimento cirúrgico MIRI pode evitar danos linfáticos e promover a reperfusão linfática colocando o tubo macio na artéria coronária LAD durante a ligadura. Em comparação, o método de cirurgia existente é mais propenso a rasgar o músculo cardíaco e causar uma hemorragia maciça durante a ligadura da artéria coronária LAD, sem o efeito de amortecimento do tubo macio. Além disso, o diâmetro do tubo macio pré-preparado era muito maior do que a sutura de seda 6-0, e o tubo pode ter contraído e induzido um tamanho maior de infarto quando o slipknot foi amarrado ao tubo durante o período isquêmico.

Este estudo teve algumas limitações. O tamanho do infarto do coração foi analisado no experimento preliminar. A fórmula de substituição (N = 7,75) foi calculada utilizando-se uma equação³³ relatada anteriormente. Considerando a possível morte de ratos durante a operação, N foi aumentada em 25%; assim, n = 10 (dez ratos para cada grupo) foi decidido. Caso contrário, o método já existente para gerar o modelo MIRI apresentou alta taxa de mortalidade. Portanto, poucos casos (baixo tamanho amostral) no grupo modelo experimental influenciaram os achados estatísticos. Várias avaliações, incluindo ecocardiografia³⁰, mancha azul evans³⁴, e a medição da enzima miocárdia³⁵, foram essenciais para avaliação e análise da função cardíaca. Devido ao baixo tamanho amostral deste trabalho, essas avaliações não foram realizadas e serão descritas em um estudo futuro da pesquisa farmacodinâmica no MIRI. No entanto, considerando que o procedimento cirúrgico existente para gerar o modelo MIRI está associado a extensos danos miocárdios, vale a pena relatar este método atual para melhorar a modelagem do MIRI em ratos e trazer luz a este modelo pré-clínico que simula corretamente a doença isquêmica do coração.

Em conclusão, o método de cirurgia melhorado para gerar o modelo MIRI apresentou maior taxa de sobrevivência, segmento ST-T elevado e maior tamanho infarto do que o método de geração de modelo MIRI existente, sugerindo que o modelo melhorado simula melhor a patologia MIRI.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Formalin	Chunyu, China	_
2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride	Solarbio, China	T8107
75% Alchol	SCR, China	10009261
Artery Clip	Zhonglin Dongsheng, China	6.5cm
Camera	Olympus Corporation, Japan	EPL5
Cotton ball	Huachen, China	_
Dpilatory cream	Veet, China	_
Eye speculum	Shanghai Jingzhong, China	_
Gauze	Zhonggan, China	_
GraphPad	GraphPad Software, USA	8.0
H&E Kit	Solarbio, China	G1120
High-pressure steam sterilizer	TOMY, Japan	SX-500
ImageJ	NIH, USA	_
Masson Kit	Solarbio, China	G1340
Medical Tape	Mr.Song, China	_
Microscope	Olympus Corporation, Japan	CKX31
Microscopy	TEKSQRAY, China	_
Microtome	Leica, Germany	RM2235
Microtome Blade	Leica, Germany	819
Needle holder	Shanghai Jingzhong, China	_
Ophthalmic scissors	Shanghai Jingzhong, China	_
Ophthalmic tweezers	Shanghai Jingzhong, China	_
Paper clip	Chenguang, China	ABS91613
Physiological saline solution	Kelun, China	_
Powerlab ECG	ADINSTRUMENTS ,China	4/35
PVC tube	Guanzhijia, China	_
Small animal ventilator	TECHMAN, China	HX-101E
Sodium Pentobarbital	SIGEMA, USA	1030001
Suction trocar	TECHMAN, China	HX-101E
Suture line	Lingqiao, China	4-0
Suture needle with thread	Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China	6-0