Улучшенная модель грызунов ишемии миокарда и реперфузионной травмы

Резюме

Ишемия-реперфузионная модель сердца крысы улучшается с помощью самодельного втягивающего устройства, поливинилхлоридной трубки и уникального метода завязывания узлов. Результаты анализа электрокардиограммы, трифенилтетразолия и гистологического окрашивания, а также процентной выживаемости показали, что улучшенная модельная группа имеет более высокие показатели успеха и выживаемости, чем уже существующая модельная группа.

Аннотация

Ишемия миокарда и реперфузионное повреждение (MIRI), вызванное ишемической болезнью сердца (ИБС), вызывает повреждение кардиомиоцитов. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что тромболитическая терапия или первичное чрескожное коронарное вмешательство (PPCI) не предотвращает реперфузионное повреждение. До сих пор нет идеальной животной модели для MIRI. Это исследование направлено на улучшение модели MIRI на крысах, чтобы сделать операцию проще и более осуществимой. Уникальный метод установления МИРИ разработан с использованием мягкой трубки на ключевом этапе ишемического периода. Чтобы исследовать этот метод, тридцать крыс были случайным образом разделены на три группы: фиктивная группа (n = 10); экспериментальная модельная группа (n = 10); и существующая модельная группа (n = 10). Результаты окрашивания трифенилтетразолия хлоридом, электрокардиографии и процентной выживаемости сравниваются для определения точности и выживаемости операций. На основании результатов исследования был сделан вывод о том, что улучшенный метод хирургии связан с более высокой выживаемостью, повышенным сегментом ST-T и большим размером инфаркта, который, как ожидается, будет лучше имитировать патологию MIRI.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смертности во всем мире. Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний играет решающую роль в общественном здравоохранении и эпидемиологии во всем^мире1. Ишемия миокарда и реперфузионное повреждение играют важную роль при ишемической болезни сердца, которая относится к сложному патофизиологическому процессу, который включает истощение аденозинтрифосфата², чрезмерную генерацию активных форм кислорода³, воспалительные реакции⁴ и митохондриальную дисфункцию из-за перегрузки кальцием⁵, которая вызывает острый инфаркт миокарда через метаболическую дисфункцию и структурное повреждение⁶.

Тем не менее, подробные механизмы, лежащие в основе ишемии миокарда и реперфузионного повреждения (MIRI), остаются неизвестными. Настоящая работа направлена на разработку уникальной животной модели, которая адекватно имитирует клиническую картину и лечение МИРИ. В противном случае, в процессе исследования модели MIRI, крупным животным⁷ (например, свиньям) требуется интервенционная хирургия, которая стоит дорого. Мелкие животные (такие как кролики⁸, мыши 9,10,11,12 и крысы¹³) требуют деликатного хирургического вмешательства под микроскопией ¹⁰, дистанционно управляемых саккул ^8,11 или выдавливания сердца из полости⁹, что требует высокого уровня технологии и может вызвать несколько послеоперационных осложнений, которые нарушают точность результатов. Идеальная модель MIRI с более высокой выживаемостью и более низкой стоимостью будет играть решающую роль в патологических исследованиях.

Это исследование было направлено на борьбу с этими проблемами путем создания более доступной и осуществимой модели MIRI на крысах, чтобы облегчить исследование патологии MIRI, что может привести к открытию клинических методов лечения MIRI.

протокол

Исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Нанкинского университета китайской медицины (разрешение No 202004A002). Исследование строго соответствовало руководящим принципам Национального института здравоохранения (NIH) по использованию лабораторных животных (публикация NIH No 85-23, пересмотренная в 2011 году). В этой работе использовались тридцать самцов крыс Sprague-Dawley (вес, 300 ± 50 г; возраст, 12 ± 14 недель).

1. Подготовка животных

1. Лишите крыс пищи и воды за 12 ч до операции. Предоперационное голодание направлено на предотвращение легочной аспирации¹⁴.
2. Стерилизуйте все инструменты перед операцией с помощью парового стерилизатора высокого давления.
3. Анестезируют крыс путем введения пентобарбитала натрия (1,5%, 75 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции (см. Таблицу материалов).
4. Оцените эффективность анестезии, выполнив тест на защемление пальцев ног.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса считается достаточно обезболенной, если не наблюдается никаких рефлексов, когда ее задняя лапа удерживается пинцетом.
5. Выпрямите среднюю часть двух скрепок, чтобы сформировать форму «S». Потяните вниз широкий участок каждой буквы «S», чтобы сформировать небольшой втягивающий механизм.
6. Разрежьте трубку диаметром 2 мм из поливинилхлорида (ПВХ) на куски длиной 7 мм. Вставьте шов длиной 10 см 4-0 в трубку ПВХ и завяжите его концы.
7. Разложите левую переднюю нисходящую (LAD) коронарную артерию и трубку ПВХ вместе с помощью шва 6-0. Вырежьте канавку в середине трубки из ПВХ с помощью офтальмологических ножниц и используйте канавку, чтобы продеть шов 6-0 через трубку, чтобы предотвратить его падение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка из ПВХ и втягивающие устройства формы "S" показаны на дополнительном рисунке 1.

2. Хирургическая процедура

1. Выполните операцию для создания улучшенной модели крыс miri, выполнив следующие действия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Группа моделей животных, сгенерированная улучшенным методом MIRI, во всей статье упоминается как экспериментальная модельная группа.
   1. После анестезии (шаг 1.2) зафиксируйте конечности крысы скотчем, поместив крысу на хирургическую доску в лежачем положении. Побрейте шею и левую переднюю часть грудной клетки кремом для депиляции, а кожу очистите 75% спиртом и йодофорным скрабом.
   2. Разрезайте кожу шеи вдоль вдоль срединной линии шейки матки с помощью офтальмологических ножниц.
   3. Отделите мышцы шеи с помощью офтальмологического пинцета и поместите втягивающее устройство (шаг 1.4) с каждой стороны, чтобы втянуть их дальше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо адекватно обнажить трахею, так как это имеет решающее значение для предотвращения кровотечения из щитовидной железы во время этого этапа.
   4. После обнажения трахеи определите пространство между четвертым и пятым кольцами трахеи. Это пространство является точкой прокола.
   5. Отметьте эту точку тупым краем кончика иглы. Сделайте разрез 3 мм параллельно крикоидному хрящу в этой точке.
   6. Вставьте всасывающий троакар (см. Таблицу материалов) в трахею через разрез (этап 2.1.5) и механически проветрите крысу для поддержания нормального дыхания со скоростью 80 вдохов/мин и приливным объемом 8 мл/кг.
   7. Далее делают разрез 4-5 см от мечевидного до середины второго левого межреберного пространства, удерживая скальпель под углом 45°. Осторожно и медленно отделите большую грудную клетку и зазубренную переднюю мышцы с помощью офтальмологического пинцета для доступа к межреберному пространству.
   8. Сделайте разрез 1,5 см поперечно между левым третьим и четвертым ребрами с помощью офтальмологических ножниц.
   9. При необходимости вырежьте четвертое ребро, чтобы обнажить сердце, покрытое левым легким. Это обеспечивает лучшую видимость.
   10. Для предотвращения травм поместите ватные шарики, смоченные в физиологическом растворе, над легкими в грудной полости. Рассекните перикард с помощью офтальмологического пинцета, поднимите пинцетом придаток левого предсердия и определите коронарный остий, присутствующий в корне аортальной артерии.
   11. В срезе между левым легким и ушной раковиной сажайте LAD и предварительно подготовленную короткую трубку (шаг 1.6) вместе, используя хирургический шов 6-0, и свяжите его с помощью slipknot. Поместите скользящий узел в канавку трубки из ПВХ и затяните лигированную трубку и LAD с помощью второго скользящего узла в течение 45 мин¹⁵ (рисунок 1A,B).
   12. Фиксируют изменение цвета передней части левого желудочка и подъем ST-сегмента на электрокардиограмме (ЭКГ) в период ишемии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя часть левого желудочка бледнеет в период ишемии.
   13. Зажмите мышцы грудной клетки и кожу с помощью зажимной артерии и накройте рану влажной солевой марлей.
   14. Ослабьте скользящий узел и удалите предварительно подготовленный короткий тюбик через 45 мин¹⁵ (рисунок 1С).
   15. Держите крыс под наркозом во время реперфузии в течение 2 ч.
2. Выполните операцию по генерации модели крысы в соответствии с ранее опубликованной процедурой¹⁶.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модельная группа животных упоминается как существующая модельная группа на протяжении всей статьи.
   1. Перед перевязкой коронарной артерии LAD выполните те же шаги, что и экспериментальная модельная группа.
   2. Во время ишемического периода связывайте проксимальную коронарную артерию LAD каждой крысы с помощью скользящего узла только с использованием хирургического шва 6-0 в том же положении, что и экспериментальная модельная группа, и завязывайте скользящий узел в течение 45 минут.
   3. После перевязки ослабьте пинцетом скользящий узел, зашить разрезы крысы шовной иглой и пинцетом, а животное держать в глубоком наркозе 1,5% пентобарбитала натрия в течение всего периода реперфузии 17,18,19 в течение 2 ч перед сбором сердец крысы.

3. Оценка окрашивания трифенилтетразолия хлоридом

1. В конце реперфузии крысы эвтенизируются, в то время как еще глубоко обезболиваются. Принесите в жертву крыс и соберите их сердца^{сразу 16,20}. Промыть сердца в растворе PBS и хранить их при −20 °C в течение ~20 мин для затвердевания тканей.
2. Затем нарежьте сердечки на 2 мм ломтиками микротома, инкубируйте их с 2% трифенилтетразолия хлорида (TTC) (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение ~30 мин и зафиксируйте их в 10% нейтральном формалине.
3. Сфотографируйте срезы сердца и рассчитайте области инфаркта с помощью программы обработки изображений программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за окрашивания участки инфаркта выглядят бледно-белыми, тогда как нормальные ткани кажутся темно-красными.

4. Гистологическое окрашивание

1. Заготавливают сердца под глубоким наркозом 1,5% пентобарбитала натрия в конце периода реперфузии.
2. Зафиксируйте сердечки в 10% формалине при 4 °C в течение 48 ч.
3. Впоследствии разделите сердца микротомом по меньшей мере на 6 ломтиков (толщиной 5 мкм) и обеспечьте не менее трех ломтиков для гематоксилина и эозина (H&E) и окрашивания Массона^20,21.
4. Наблюдайте за слайдами под световым микроскопом и фотографируйте их.

5. Оценка ЭКГ

1. Случайным образом разделите животных на экспериментальные или существующие модельные группы MIRI или фиктивные группы для оценки изменений ЭКГ.
2. Обезболить всех крыс во время хирургических перевязок и оценить стандартный вывод конечности II, отслеживая^20,21 для выявления изменений ЭКГ и подтверждения ишемии миокарда.
3. Храните все изображения в цифровой библиотеке.

6. Статистический анализ

1. Проведение статистического анализа с использованием программного обеспечения для построения научных графиков и статистики (см. Таблицу материалов).
2. Выражайте все данные как среднее ± стандартной погрешности среднего значения. После тестов нормальности и логнормальности каждой группы выполняют односторонний анализ дисперсии и t-тесты²² для определения значимых различий между группами. Рассмотрим p-значение <0,05 как статистически значимое.

Результаты

Окрашивание TTC
Участки сердца у крыс, которые подверглись либо существующей, либо улучшенной процедуре MIRI или фиктивной операции, были окрашены TTC, а изображения были сохранены в цифровом виде и проанализированы с использованием ImageJ. Крысы, которые прошли либо уже существующие, либо улучшенные процедуры MIRI, имели инфаркты миокарда, в то время как крысы из фиктивной группы этого не делали (рисунок 2B). По сравнению с крысами в фиктивной группе, крысы в существующих (p < 0,0001) и экспериментальных (p < 0,0001) модельных группах MIRI имели значительную разницу в размере инфаркта миокарда, а экспериментальная модельная группа имела больший размер инфаркта миокарда, чем существующая модельная группа (p = 0,0176) (рисунок 3B).

Гистологическое окрашивание
Анализ образцов, окрашенных с использованием пятен H&E и Masson^22,23, показал, что по сравнению с фиктивной группой кардиомиоциты как экспериментальной, так и существующей модельной групп испытали критическое повреждение и нуклеолиз и были инфильтрированы многочисленными нейтрофилами (рисунок 3).

Тест ЭКГ
Сегменты ЭКГ ST-T крыс в существующих и экспериментальных модельных группах MIRI были повышены по сравнению с сегментами крыс в фиктивной группе (рисунок 4A), а различия между экспериментальной моделью и фиктивными группами (p < 0,0001) или существующими модельными и фиктивными группами (p < 0,0001) были значительными (рисунок 4B). Кроме того, сегмент ST-T был более высоким в экспериментальной модельной группе, чем в существующей модельной группе (p = 0,0274) (рисунок 4C).

Процент выживаемости
Выживаемость значительно различалась между двумя группами моделей MIRI (рисунок 4D). Четыре из десяти крыс умерли в существующей модельной группе. Смертность составила 40% в период реперфузии. Напротив, ни одна из крыс в экспериментальной модельной группе не умерла во время операции, демонстрируя, что текущая улучшенная модель имела более высокую выживаемость (p = 0,0291).

Рисунок 1: Ключевые этапы моделирования ишемической и реперфузионной травмы миокарда (MIRI). Зеленые точки указывают на протокол лигатуры в течение ишемического периода, включая размещение мягкой трубки на коронарных артериях (А), зацепление шовной линии в борозду предварительно подготовленной мягкой трубки (В), ослабление скользящего узла и удаление мягкой трубки при начале периода реперфузии (шкала бар = 1 см) (C ). LAA: придаток левого предсердия, RAA: правый предсердный придаток, LAD: левый передний нисходящий, RCA: правая коронарная артерия, IVC: нижняя полая вена, SVC: верхняя полая вена, AO: артерия аорты, PA: легочная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Вся процедура операции и различия в окрашивании трифенилтетразолия хлорида (ТТС) между различными группами. Показаны предварительно подготовленный малый втягивающий механизм (шкала = 15 мм), мягкая трубка (шкала = 10 мм) и вся операция (шкала = 15 мм). Тридцать крыс были случайным образом разделены на экспериментальную (n = 10), фиктивную группу (n = 10) и существующую модельную (n = 10) группы. Окрашивание TTC показало, что как экспериментальные, так и существующие группы моделей имели значительные изменения по сравнению с фиктивной группой (B). Передняя стенка миокарда в экспериментальной и боковая стенка в существующих модельных группах стали бледно-белыми, что подтверждает расположение ишемической области (шкала бар = 5 мм). «Существующая модель» изображена как «старая модель» на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Различия в окрашивании H&E и Masson между группами. Тридцать самцов крыс Sprague Dawley были случайным образом разделены на экспериментальную (n = 10), фиктивную группу (n = 10) и существующую модельную (n = 10) группы, и показано сравнение морфологических изменений клеток между группами (шкала бар = 2 мм). Гематоксилин и Эозин (H&E), а также окрашивание Массона показывают, что клетки миокарда экспериментальной модели и существующих модельных групп имеют критическое повреждение, нуклеолиз и инфильтрированы многочисленными нейтрофилами по сравнению с клетками фиктивной группы (шкала бар = 100 мкм). «Существующая модель» изображена как «старая модель» на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Различия в статистических результатах между группами. Тридцать самцов крыс Sprague Dawley были случайным образом разделены на экспериментальную (n = 10), фиктивную группу (n = 10) и существующую модельную (n = 10) группы. Результаты электрокардиограммы показывают, что по сравнению с уже существующей модельной группой экспериментальная модельная группа имеет больший размер инфаркта миокарда (****p < 0,0001, *p = 0,0176) (A), более высокую высоту сегмента ST (****p < 0,0001, *p = 0,0274) (B) и более высокий процент выживаемости (p = 0,0291) (C ). В частности, крысы существующей модельной группы чаще умирали в начале периода ишемии и начале периода реперфузии (D). «Существующая модель» изображена как «старая модель» на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Детали предварительно подготовленного втягивающего устройства и трубы из ПВХ. Показаны предварительно подготовленные втягивающие устройства (А) и трубка из ПВХ (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Основным отличием уже существующих и усовершенствованных методов стало использование трубок ПВХ в процессе лигирования. В существующем хирургическом методе ткань миокарда была перевязана с использованием только шелкового шва 6-0, что вызвало повреждение миокарда во время лигирования, что привело к интраоперационной смерти. Более того, пульсация сердца ослабила бы скользящий узел. Напротив, в улучшенном методе с трубкой ПВХ скользящий узел, помещенный в канавку трубки, можно было затянуть, а площадь миокарда, пораженного перевязкой, увеличилась. Эти преимущества наблюдались во время экспериментальной процедуры и подтверждались результатами окрашивания TTC и процентной выживаемости.

Критическим этапом усовершенствованного хирургического метода было размещение мягкой трубки на проксимальной коронарной артерии LAD, сопровождаемой нервами, лимфатическими сосудами и тканью миокарда во время перевязки в ишемическом периоде. Эта предварительно подготовленная мягкая трубка может выступать в качестве подушки, которая защищает периферические ткани (нервы, миокардию и лимфатические сосуды) и снижает смертность во время перевязки коронарных артерий. Операция, выполненная уже существующим методом, была похожа на операцию по инфаркту миокарда. Результаты процентной выживаемости показали, что крысы в существующей модельной группе в основном умирали во время ишемического периода (две крысы умерли через 2 мин после лигирования, а две крысы умерли через 45 мин после лигирования). В противном случае основные причины смерти до сих пор неясны, и существует ряд гипотез, включая дополнительное повреждение нервных структур²³, лимфатических сосудов и миокардию.

Что касается нервного повреждения, предыдущие исследования показали, что во время ишемического периода на животной модели, помимо прямого локального воздействия ишемии на нервные структуры, также, вероятно, наблюдается значительное снижение уровней нейропептида Y (NPY), которые способствуют нарушениям аксоплазматического транспорта в симпатической иннервации²⁴. Этот вывод согласуется с результатами, опубликованными Han et ^al.25, которые показали, что постепенное исчезновение NPY произошло в инфарктированном миокарде после перевязки коронарной артерии LAD у крыс. Однако роль NPY в этом контексте остается неясной. Его делеция ослабляет сердечную дисфункцию и апоптоз при остром инфаркте миокарда²⁶ и связана с аритмией²⁷, высоким кровяным давлением и коронарной микрососудистой функцией²⁸.

Кроме того, неблагоприятная обструкция сердечного лимфотока произошла во время ишемического периода, что привело к тяжелому отеку сердца, дисфункции левого нерва и кровоизлияниям²⁹, которые могут быть еще одной причиной смерти у крыс. Во время этого патологического процесса лигатура коронарной артерии LAD может быть отнесена к обструкции коронарных артерий или сердечного лимфатического транспорта в области инфаркта, что может вызвать дополнительные осложнения, такие как неблагоприятное ремоделирование лимфатики эпикардиального коллектора, снижение лимфатического потока и стойкий отек³⁰.

Таким образом, кровообращение в лимфатических сосудах играет функциональную роль в сердечном гомеостазе³¹ и заживлении ран³², и результаты процентной выживаемости в этом исследовании свидетельствуют о том, что улучшенная хирургическая процедура MIRI может избежать лимфатического повреждения и способствовать лимфатической реперфузии путем размещения мягкой трубки на коронарной артерии LAD во время лигатуры. Для сравнения, существующий хирургический метод с большей вероятностью разрывает сердечную мышцу и вызывает массивное кровоизлияние во время перевязки коронарной артерии LAD, без амортизирующего эффекта мягкой трубки. Кроме того, диаметр предварительно подготовленной мягкой трубки был намного больше, чем шелковый шов 6-0, и трубка, возможно, сжималась и вызывала больший размер инфаркта, когда скользящий узел был привязан к трубке во время ишемического периода.

Это исследование имело несколько ограничений. Размер инфаркта сердца анализировали в предварительном эксперименте. Формула подстановки (N = 7,75) была рассчитана с использованием ранее сообщенного уравнения³³. Учитывая возможную гибель крыс во время операции, N был повышен на 25%; следовательно, было решено n = 10 (десять крыс для каждой группы). В противном случае уже существующий метод генерации модели МИРИ имел высокий уровень смертности. Поэтому несколько случаев (низкий размер выборки) в экспериментальной модельной группе повлияли на статистические результаты. Несколько оценок, включая эхокардиографию³⁰, синее окрашивание Эванса³⁴ и измерение фермента миокарда³⁵, были необходимы для оценки и анализа сердечной функции. Из-за низкого размера выборки этой работы эти оценки не были выполнены и будут описаны в будущем исследовании фармакодинамических исследований в MIRI. Однако, учитывая, что существующая хирургическая процедура для генерации модели MIRI связана с обширным повреждением миокарда, стоит сообщить об этом настоящем методе, чтобы улучшить моделирование MIRI у крыс и пролить свет на эту доклиническую модель, которая правильно имитирует ишемическую болезнь сердца.

В заключение, улучшенный хирургический метод для генерации модели MIRI имел более высокую выживаемость, повышенный сегмент ST-T и больший размер инфаркта, чем существующий метод генерации модели MIRI, предполагая, что улучшенная модель лучше имитирует патологию MIRI.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Formalin	Chunyu, China	_
2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride	Solarbio, China	T8107
75% Alchol	SCR, China	10009261
Artery Clip	Zhonglin Dongsheng, China	6.5cm
Camera	Olympus Corporation, Japan	EPL5
Cotton ball	Huachen, China	_
Dpilatory cream	Veet, China	_
Eye speculum	Shanghai Jingzhong, China	_
Gauze	Zhonggan, China	_
GraphPad	GraphPad Software, USA	8.0
H&E Kit	Solarbio, China	G1120
High-pressure steam sterilizer	TOMY, Japan	SX-500
ImageJ	NIH, USA	_
Masson Kit	Solarbio, China	G1340
Medical Tape	Mr.Song, China	_
Microscope	Olympus Corporation, Japan	CKX31
Microscopy	TEKSQRAY, China	_
Microtome	Leica, Germany	RM2235
Microtome Blade	Leica, Germany	819
Needle holder	Shanghai Jingzhong, China	_
Ophthalmic scissors	Shanghai Jingzhong, China	_
Ophthalmic tweezers	Shanghai Jingzhong, China	_
Paper clip	Chenguang, China	ABS91613
Physiological saline solution	Kelun, China	_
Powerlab ECG	ADINSTRUMENTS ,China	4/35
PVC tube	Guanzhijia, China	_
Small animal ventilator	TECHMAN, China	HX-101E
Sodium Pentobarbital	SIGEMA, USA	1030001
Suction trocar	TECHMAN, China	HX-101E
Suture line	Lingqiao, China	4-0
Suture needle with thread	Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China	6-0