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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Abstract

La caratterizzazione degli eventi molecolari quando le cellule danno origine a tessuti e organi aumenta il potenziale per comprendere meglio lo sviluppo normale e progettare rimedi efficaci per le malattie. Le tecnologie che consentono l'identificazione e la quantificazione accurate di diversi tipi e di un gran numero di proteine fornirebbero informazioni ancora mancanti sui meccanismi molecolari che orchestrano lo sviluppo di tessuti e organismi nello spazio e nel tempo. Qui, presentiamo un protocollo basato sulla spettrometria di massa che consente la misurazione di migliaia di proteine in linee cellulari identificate in embrioni di Xenopus laevis (rana). L'approccio si basa su mappe riproducibili del destino cellulare e metodi consolidati per identificare, etichettare, tracciare e campionare in modo fluorescente le cellule e la loro progenie (cloni) da questo modello di sviluppo dei vertebrati. Dopo aver raccolto il contenuto cellulare utilizzando il microcampionamento o isolando le cellule mediante dissezione o selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, le proteine vengono estratte e processate per l'analisi proteomica bottom-up. La cromatografia liquida e l'elettroforesi capillare vengono utilizzate per fornire una separazione scalabile per il rilevamento e la quantificazione delle proteine con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Vengono forniti esempi rappresentativi per la caratterizzazione proteomica delle cellule adipose del tessuto neurale. La proteomica HRMS guidata dalla linea cellulare è adattabile a diversi tessuti e organismi. È sufficientemente sensibile, specifico e quantitativo per scrutare le dinamiche spazio-temporali del proteoma durante lo sviluppo dei vertebrati.

Introduzione

La nostra comprensione della differenziazione cellulare e della genesi di tessuti e organi è il risultato di decenni di elaborati screening mirati di geni e dei loro prodotti. Aumentare la nostra conoscenza di tutte le biomolecole e delle loro quantità durante importanti eventi cellulari aiuterebbe a svelare i meccanismi molecolari che controllano il modello spaziale e temporale del piano corporeo dei vertebrati. Le tecnologie che consentono l'amplificazione molecolare e il sequenziamento sono ora in grado di riferire regolarmente su un gran numero di geni e trascrizioni, supportando studi basati su ipotesi nella ricerca biologica e traslazionale di base. Per comprend....

Protocollo

Tutti i protocolli che garantiscono il mantenimento e la manipolazione umana delle rane adulte di Xenopus laevis sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Maryland, College Park (numeri di approvazione R-DEC-17-57 e R-FEB-21-07).

1. Preparare le soluzioni

  1. Per l'embriologia
    1. Preparare 1x, 0,5x e 0,2x la soluzione di Steinberg (SS), quindi sterilizzarli in autoclave (120 °C per 20 min) fino alla sterilità seguendo i protocolli standard12.
    2. Preparare il 3% (p/v) di Ficoll in 1x SS sterilizzato seguendo i p....

Risultati

Questo protocollo ha permesso lo studio delle proteine nelle singole cellule e dei loro lignaggi mentre stabiliscono i tessuti negli embrioni di X. laevis. La Figura 1 illustra una di queste applicazioni dell'approccio per studiare le proteine nelle cellule fatali del tessuto neurale e l'ectoderma neurale appena indotto nell'embrione. Come mostrato nella Figura 1A, il flusso di lavoro bioanalitico ha integrato gli strumenti tradizionali della biologia c.......

Discussione

Questo protocollo consente la caratterizzazione dell'espressione proteica in linee cellulari identificate in embrioni della specie Xenopus . Derivando dalla HRMS, la metodologia combina una squisita specificità nell'identificazione molecolare, capacità di rilevamento multi-proteina senza sonde molecolari (di solito centinaia o migliaia di proteine diverse) e una capacità di quantificazione. L'adattabilità agli strumenti e ai flussi di lavoro classici nella (neuro)biologia cellulare e dello sviluppo espande l.......

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Siamo grati a Jie Li (University of Maryland, College Park) per le preziose discussioni sulla dissociazione embrionale e sulla FACS. Ringraziamo Vi M. Quach e Camille Lombard-Banek per l'assistenza nella preparazione dei campioni e nella raccolta dei dati in studi precedenti che esemplificano le applicazioni proteomiche evidenziate in questo protocollo. Parti di questo lavoro sono state sostenute dalla National Science Foundation con il numero di premio IOS-1832968 CAREER (a P.N.), dal National Institutes of Health con il numero di premio R35GM124755 (a P.N.), dall'Università del Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (a P.N.) e dai premi di ricerca de....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile (LC-MS-grade)Fisher ScientificA955
AgaroseThermoFisher ScientificR0492
Ammonium bicarbonateFisher ScientificA643-500
Analytical ColumnThermo Scientific164941
Analytical microbalanceMettler-ToledoXSE105DU
Automatic peptide fractionation platformAgilent1260 Infinity II
Borosilicate CapillariesSutter Instruments Co.B100-50-10
Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)Sutter InstrumentsB100-75-10
C18 spin columns (for desalting)ThermoFisher Scientific89870
Camera ro monitor electrosprayEdmund Optics Inc.EO-2018C
Combretastatin A4Millipore SigmaC7744
Commercial CESI systemAB SCIEXCESI
(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)VWR97061-492
Cytochalasin DMillipore SigmaC8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, FixableThermoFisher ScientificD22910
DiothiothreitolFisher ScientificFERR0861
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
Epifluorescence light sourceLumencoreAURA III
Eppendorf LoBing microcentrifuge  tubes: proteinFisher Scientific13-698-793
Formic acid (LC-MS-grade)Fisher ScientificA117-50
Freezer (-20 °C)Fisher Scientific97-926-1 
Freezer (-80 °C)Thermo ScientificTSX40086A
Fused silica capillaryMolex1088150596
Heat BlockBenchmarkBSH300
High pressure liquid Chromatography SystemThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
High voltage power supplySpellmanCZE1000R
High-resolution Mass SpectrometerThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC capsThermo ScientificC4013-40A
HPLC VialsThermo ScientificC4013-11
Illuminator e.g. GoosenecksNikonC-FLED2
Ingenuity Pathway AnalysisQiagen
IodoacetamideFisher ScientificAC122275000
Methanol (LC-MS-grade)Fisher ScientificA456
Methanol (LC-MS-grade)Fisher ScientificA456-4
Microcapillary pullerSuttor InstrumentsP-2000
MicroinjectorWarner Instrument, Handem, CTPLI-100A
Micropippette pullerSutter Instruments Co.P-1000
MS data analysis software, commercialProteomeDiscoverer
MS data analysis software, opensourceMaxQuant
non-idet 40 substituteMillipore Sigma11754599001
Petri dish 60 mm and 80 mmFisher ScientificS08184
Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting)ThermoFisher Scientific87782
Pierce bicinchoninic acid protein assay kitThermoFisher Scientific23225
Pierce quantitative colorimetric peptide assayThermoFisher Scientific23275
Pierce Trypsin Protease (MS Grade)Fisher ScientificPI90058
Protein LoBind vialsEppendorf0030108434
, 0030108442
Refrigerated CentrifugeEppendorf5430R
Refrigerated IncubatorThermo ScientificPR505755R/3721
sodium isethionateMillipore Sigma220078
sodium pyrophosphateSigma Aldrich221368-100G
Stainless steel BGE vialCustom-Built
Stainless steel sample vialsCustom-Built
Stereomicroscope (objective 10x)NikonSMZ 1270, SZX18
SucroseVWR97063-790
Syringe pumps (2)Harvard Apparatus704506
Syringes (gas-tight): 500–1000 µLHamilton1750TTL
Transfer pipettes (Plastic, disposable)Fisher Scientific13-711-7M
Trap ColumnThermo Scientific164750
Tris-HCl (1 M solution)Fisher ScientificAAJ22638AP
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °CLabconco7310022
Vortex-mixerBenchmarkBS-VM-1000
Water (LC-MS-grade)Fisher ScientificW6
Water (LC-MS-grade)Fisher ScientificW6
XYZ translation stageThorlabsPT3
XYZ translation stageCustom-Built

Riferimenti

  1. Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
  2. Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells ....

Ristampe e Autorizzazioni

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