Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Riepilogo

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Abstract

La caratterizzazione degli eventi molecolari quando le cellule danno origine a tessuti e organi aumenta il potenziale per comprendere meglio lo sviluppo normale e progettare rimedi efficaci per le malattie. Le tecnologie che consentono l'identificazione e la quantificazione accurate di diversi tipi e di un gran numero di proteine fornirebbero informazioni ancora mancanti sui meccanismi molecolari che orchestrano lo sviluppo di tessuti e organismi nello spazio e nel tempo. Qui, presentiamo un protocollo basato sulla spettrometria di massa che consente la misurazione di migliaia di proteine in linee cellulari identificate in embrioni di Xenopus laevis (rana). L'approccio si basa su mappe riproducibili del destino cellulare e metodi consolidati per identificare, etichettare, tracciare e campionare in modo fluorescente le cellule e la loro progenie (cloni) da questo modello di sviluppo dei vertebrati. Dopo aver raccolto il contenuto cellulare utilizzando il microcampionamento o isolando le cellule mediante dissezione o selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, le proteine vengono estratte e processate per l'analisi proteomica bottom-up. La cromatografia liquida e l'elettroforesi capillare vengono utilizzate per fornire una separazione scalabile per il rilevamento e la quantificazione delle proteine con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Vengono forniti esempi rappresentativi per la caratterizzazione proteomica delle cellule adipose del tessuto neurale. La proteomica HRMS guidata dalla linea cellulare è adattabile a diversi tessuti e organismi. È sufficientemente sensibile, specifico e quantitativo per scrutare le dinamiche spazio-temporali del proteoma durante lo sviluppo dei vertebrati.

Introduzione

La nostra comprensione della differenziazione cellulare e della genesi di tessuti e organi è il risultato di decenni di elaborati screening mirati di geni e dei loro prodotti. Aumentare la nostra conoscenza di tutte le biomolecole e delle loro quantità durante importanti eventi cellulari aiuterebbe a svelare i meccanismi molecolari che controllano il modello spaziale e temporale del piano corporeo dei vertebrati. Le tecnologie che consentono l'amplificazione molecolare e il sequenziamento sono ora in grado di riferire regolarmente su un gran numero di geni e trascrizioni, supportando studi basati su ipotesi nella ricerca biologica e traslazionale di base. Per comprend....

Protocollo

Tutti i protocolli che garantiscono il mantenimento e la manipolazione umana delle rane adulte di Xenopus laevis sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Maryland, College Park (numeri di approvazione R-DEC-17-57 e R-FEB-21-07).

1. Preparare le soluzioni

1. Per l'embriologia
   1. Preparare 1x, 0,5x e 0,2x la soluzione di Steinberg (SS), quindi sterilizzarli in autoclave (120 °C per 20 min) fino alla sterilità seguendo i protocolli standard¹².
   2. Preparare il 3% (p/v) di Ficoll in 1x SS sterilizzato seguendo i p....

Risultati

Questo protocollo ha permesso lo studio delle proteine nelle singole cellule e dei loro lignaggi mentre stabiliscono i tessuti negli embrioni di X. laevis. La Figura 1 illustra una di queste applicazioni dell'approccio per studiare le proteine nelle cellule fatali del tessuto neurale e l'ectoderma neurale appena indotto nell'embrione. Come mostrato nella Figura 1A, il flusso di lavoro bioanalitico ha integrato gli strumenti tradizionali della biologia c.......

Discussione

Questo protocollo consente la caratterizzazione dell'espressione proteica in linee cellulari identificate in embrioni della specie Xenopus . Derivando dalla HRMS, la metodologia combina una squisita specificità nell'identificazione molecolare, capacità di rilevamento multi-proteina senza sonde molecolari (di solito centinaia o migliaia di proteine diverse) e una capacità di quantificazione. L'adattabilità agli strumenti e ai flussi di lavoro classici nella (neuro)biologia cellulare e dello sviluppo espande l.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (LC-MS-grade)	Fisher Scientific	A955
Agarose	ThermoFisher Scientific	R0492
Ammonium bicarbonate	Fisher Scientific	A643-500
Analytical Column	Thermo Scientific	164941
Analytical microbalance	Mettler-Toledo	XSE105DU
Automatic peptide fractionation platform	Agilent	1260 Infinity II
Borosilicate Capillaries	Sutter Instruments Co.	B100-50-10
Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)	Sutter Instruments	B100-75-10
C18 spin columns (for desalting)	ThermoFisher Scientific	89870
Camera ro monitor electrospray	Edmund Optics Inc.	EO-2018C
Combretastatin A4	Millipore Sigma	C7744
Commercial CESI system	AB SCIEX	CESI
(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)	VWR	97061-492
Cytochalasin D	Millipore Sigma	C8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	ThermoFisher Scientific	D22910
Diothiothreitol	Fisher Scientific	FERR0861
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA	Fisher Scientific	AAJ62786AP
Epifluorescence light source	Lumencore	AURA III
Eppendorf LoBing microcentrifuge  tubes: protein	Fisher Scientific	13-698-793
Formic acid (LC-MS-grade)	Fisher Scientific	A117-50
Freezer (-20 °C)	Fisher Scientific	97-926-1
Freezer (-80 °C)	Thermo Scientific	TSX40086A
Fused silica capillary	Molex	1088150596
Heat Block	Benchmark	BSH300
High pressure liquid Chromatography System	ThermoFisher Scientific	Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
High voltage power supply	Spellman	CZE1000R
High-resolution Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC caps	Thermo Scientific	C4013-40A
HPLC Vials	Thermo Scientific	C4013-11
Illuminator e.g. Goosenecks	Nikon	C-FLED2
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen
Iodoacetamide	Fisher Scientific	AC122275000
Methanol (LC-MS-grade)	Fisher Scientific	A456
Methanol (LC-MS-grade)	Fisher Scientific	A456-4
Microcapillary puller	Suttor Instruments	P-2000
Microinjector	Warner Instrument, Handem, CT	PLI-100A
Micropippette puller	Sutter Instruments Co.	P-1000
MS data analysis software, commercial	ProteomeDiscoverer
MS data analysis software, opensource	MaxQuant
non-idet 40 substitute	Millipore Sigma	11754599001
Petri dish 60 mm and 80 mm	Fisher Scientific	S08184
Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting)	ThermoFisher Scientific	87782
Pierce bicinchoninic acid protein assay kit	ThermoFisher Scientific	23225
Pierce quantitative colorimetric peptide assay	ThermoFisher Scientific	23275
Pierce Trypsin Protease (MS Grade)	Fisher Scientific	PI90058
Protein LoBind vials	Eppendorf	0030108434 , 0030108442
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5430R
Refrigerated Incubator	Thermo Scientific	PR505755R/3721
sodium isethionate	Millipore Sigma	220078
sodium pyrophosphate	Sigma Aldrich	221368-100G
Stainless steel BGE vial	Custom-Built
Stainless steel sample vials	Custom-Built
Stereomicroscope (objective 10x)	Nikon	SMZ 1270, SZX18
Sucrose	VWR	97063-790
Syringe pumps (2)	Harvard Apparatus	704506
Syringes (gas-tight): 500–1000 µL	Hamilton	1750TTL
Transfer pipettes (Plastic, disposable)	Fisher Scientific	13-711-7M
Trap Column	Thermo Scientific	164750
Tris-HCl (1 M solution)	Fisher Scientific	AAJ22638AP
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C	Labconco	7310022
Vortex-mixer	Benchmark	BS-VM-1000
Water (LC-MS-grade)	Fisher Scientific	W6
Water (LC-MS-grade)	Fisher Scientific	W6
XYZ translation stage	Thorlabs	PT3
XYZ translation stage	Custom-Built