Autofluorescenza per valutare la fisiologia delle alghe rosse

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'imaging autofluorescenza passo-passo e la valutazione dei cambiamenti ficobiliproteici nelle alghe rosse sulla base dell'analisi spettrale. Questo è un metodo privo di etichette e non distruttivo per valutare l'adattamento cellulare ad habitat estremi, quando è disponibile solo materiale scarso e le cellule crescono lentamente, o per niente, in condizioni di laboratorio.

Abstract

Le alghe rosse (Rhodophyta) contengono ficobiliproteine e colonizzano gli habitat con luce fioca, tuttavia alcune (ad esempio, alcune specie di Chroothece ) possono anche svilupparsi in pieno sole. La maggior parte delle rodofite sono rosse, tuttavia alcune possono apparire bluastre, a seconda della proporzione di biliproteine blu e rosse (ficocianina e ficoeritrina). Diverse ficobiliproteine possono catturare la luce a diverse lunghezze d'onda e trasmetterla alla clorofilla a, il che rende possibile la fotosintesi in condizioni di luce molto diverse. Questi pigmenti rispondono ai cambiamenti dell'habitat nella luce e la loro autofluorescenza può aiutare a studiare i processi biologici. Utilizzando Chroothece mobilis come organismo modello e la modalità di scansione lambda spettrale in un microscopio confocale, è stato studiato l'adattamento dei pigmenti fotosintetici a diverse luci monocromatiche a livello cellulare per indovinare le condizioni di crescita ottimali della specie. I risultati hanno mostrato che, anche quando il ceppo studiato è stato isolato da una grotta, si è adattato sia a intensità luminose fioche che medie. Il metodo presentato è particolarmente utile per studiare gli organismi fotosintetici che non crescono o crescono molto lentamente in condizioni di laboratorio, come di solito accade per coloro che vivono in habitat estremi.

Introduzione

Le alghe rosse, come il genere Chroothece, possono crescere in habitat estremi, dove spesso devono far fronte a marcati cambiamenti ambientali¹. Inondazioni e siccità sono frequenti nelle regioni semi-aride dove questo genere può essere trovato, e alcune specie sono state segnalate in torrenti, scogliere, grotte o persino acque termali². Tuttavia, la maggior parte delle volte, le variabili biologiche, come la competizione o il pascolo, relegano le specie a condizioni non ottimali per la loro crescita. Poiché questi organismi sono spesso difficili da coltivare e non crescono o crescono molto lentamente in condizioni di laboratorio, una delle principali limitazioni è la dimensione del campione disponibile. Pertanto, è molto importante seguire metodi non distruttivi o metodi che comportano una manipolazione minima del campione ^3,4.

Le abilità fisiologiche necessarie per sopravvivere in questi ambienti difficili possono essere monitorate seguendo i cambiamenti nei loro sistemi fotosintetici. I meccanismi metabolici, l'efficienza fotosintetica e la sensibilità alla luce o alle condizioni di coltura possono essere rivelati dai profili di emissione di fluorescenza dei pigmenti, a causa di accurati cambiamenti nel loro trasferimento di energia o intrappolamento 5,6,7,8.

L'autofluorescenza dei composti cellulari può essere utilizzata come marker per la citodiagnosi o come indicatore naturale dello stato cellulare o del metabolismo in risposta a segnali esterni e interni attraverso cambiamenti nell'emissione⁹. Può anche essere usato per discriminare tassonomicamente diversi gruppi di organismi fotosintetici¹⁰. A seconda della posizione filogenetica dei microrganismi fototrofi, si possono trovare diverse caratteristiche di fluorescenza in vivo. Pertanto, un'identificazione tassonomica basata sulle caratteristiche in vivo della fluorescenza fototrofica (compresi gli spettri di assorbimento e di emissione della fluorescenza) è stata tentata in diverse occasioni^11,12. A causa della diversità nei pigmenti accessori tra i taxa di fitoplancton, le differenze nelle lunghezze d'onda alle quali viene stimolata la fluorescenza della clorofilla a (Chl a), o le differenze negli spettri di emissione, possono essere utilizzate per dedurre la tassonomia¹³. Gli spettri di eccitazione ed emissione di fluorescenza in vivo di questi campioni si basano non solo sui phyla delle alghe, ma anche sull'adattamento del fotosistema¹⁴. L'efficienza del trasferimento di energia a Chl a, o il rapporto tra Chl a e pigmenti accessori, e il contenuto di pigmenti cellulari sono sensibili alle condizioni di crescita⁵.

Le alghe rosse, in particolare Chroothece, hanno diversi pigmenti fluorescenti accessori: ficobiliproteine e carotenoidi; I primi si concentrano nei ficobilisomi attaccati ai tilacoidi dei cloroplasti. Le ficobiliproteine (ficocianina, ficoeritrina e alloficocianina) possono catturare la luce a diverse lunghezze d'onda e trasmetterla a Chl a, il che rende possibile la fotosintesi in condizioni di luce e coltura molto diverse¹⁵. Ad esempio, le specie di Chroothece possono crescere all'interno di grotte o quasi emergere in torrenti calcarei leggermente salini².

Le luci monocromatiche influenzano la crescita e la composizione pigmentata degli organismi fotosintetici e sono state studiate per prevenire o controllare la crescita di organismi fotosintetici nelle caverne. Mulec et al. hanno dimostrato che l'illuminazione arricchita di rosso promuove la crescita di cianobatteri, alghe e piante¹⁶. Studi precedenti hanno anche riportato che la luce verde influisce sulla composizione del pigmento dei cianobatteri¹⁷, mentre altri hanno rivelato che la luce verde impedisce la crescita della maggior parte degli organismi fotosintetici e alcuni cianobatteri mostrano una riduzione dei tilacoidi e un'intensità media di fluorescenza più debole¹⁸.

Per comprendere la capacità di Chroothece come organismo modello di superare condizioni difficili, le cellule coltivate sono state esposte a crescenti intensità luminose e luce monocromatica (verde o rossa)¹⁵, per vedere come affronta le condizioni di scarsa illuminazione delle grotte (dove predomina la luce rossa). Il protocollo qui presentato riproduce l'effetto delle suddette variabili sulle ficobiliproteine di Chroothece a livello cellulare utilizzando la propria autofluorescenza.

Al giorno d'oggi, la fluorescenza è comunemente usata come strumento per studiare le risposte fisiologiche di piante vascolari, microalghe, macroalghe e cianobatteri^13,14,16. La microscopia a fluorescenza confocale spettrale è uno strumento eccellente per gli studi in vivo per valutare la fisiologia dei campioni fotosintetici a livello di singola cellula 10,17,18,19,20^, evitando i problemi associati al basso tasso di crescita in laboratorio e le difficoltà di ottenere abbastanza biomassa per i metodi di estrazione e biochimici associati⁸ . Una volta che le cellule vengono trattate in diverse condizioni di coltura per 2 settimane, il profilo di scansione lambda può essere misurato in vivo. Sebbene ci siano diverse pubblicazioni in cui sono state utilizzate diverse lunghezze d'onda di eccitazione mediante imaging confocale ^3,4,10,17, la maggior parte delle ficobiliproteine e Chl a possono essere rilevate utilizzando una linea di eccitazione a lunghezza d'onda di 561 nm e l'emissione rilevata varia da 570 a ⁷⁶⁰ nm di lunghezza d'onda. Questi criteri sono stati basati su un'analisi precedentemente eseguita 10 con pigmenti puri commerciali (Tabella 1) mediante imaging confocale e sui risultati ottenuti in diverse specie di alghe^20,21,22.

Pigmenti	λflmax (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11,2 ± 0,2	1,8 ± 0,05	2,0 ± 0,08	12,2 ± 0,7	6,0 ± 0,3	4,2 ± 0,16	80,7 ± 1,5
R-PE	569.2-583.3	5,9 ± 0,6	5,9 ± 0,16	11,1 ± 0,04	42,2 ± 0,3	100,0 ± 0	90,0 ± 0,3	99,2 ± 0,08	-
	652.1-668.6	-	-	1,5 ± 0,01	3,7 ± 0,04	26,7 ± 0,5	8,7 ± 0,16	11,1 ± 0,16	11,3 ± 0,2
C-PC	636.2-676.4	2,3 ± 0,04	1,0 ± 0,01	0,6 ± 0,004	0,7 ± 0,008	2,0 ± 0,08	2,0 ± 0,04	3,3 ± 0,16	33,6 ± 0,9
APC-XL	667.3-683.8	15,1 ± 1,5	9,6 ± 0,98	1,0 ± 0,04	1,2 ± 0,08	5,9 ± 0,7	4,1 ± 0,5	23,2 ± 3,5	91,4 ± 2,3

Tabella 1: Informazioni sui pigmenti puri utilizzate per eseguire l'analisi della scansione lambda. Questa tabella mostra i picchi di emissione e i massimi di banda di spalle/fluorescenza di diversi fluorocromi/pigmenti mediante spettrofotometria di imaging confocale per tutte le lunghezze d'onda di eccitazione e la percentuale di emissione luminosa da parte di pigmenti/fluorocromi. I valori sono stati calcolati con la formula: = MFI*100/255. Ogni valore è la media ± SE (media ± errore standard dalla media). Per calibrare il microscopio laser a scansione confocale sono stati utilizzati pigmenti puri come segue ^1,2,10. La clorofilla a è stata ottenuta da Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) da Porphyra tenera e C-phycocyanin (C-PE) da Spirulina sp. Tutte le specie sono state sciolte in acqua distillata filtrata. L'allophycocyanin-XL (APC-XL) è stata ottenuta da Mastigocladus laminosus, che è stato sciolto in solfato di ammonio (60%) e fosfato di potassio (pH = 7) per raggiungere una concentrazione di 38 mM. Le scansioni sono state eseguite con 400 μL di ciascuna soluzione di pigmento (concentrazione di 1 mg/ml) utilizzando una camera inferiore di vetro coperta a 8 pozzetti.

Lo studio di una singola lunghezza d'onda di eccitazione è una prima approssimazione abbastanza utile. In questo caso, tuttavia, è necessario chiarire il contributo relativo dei diversi complessi nel segnale di fluorescenza, che si raccomanda di eseguire un rapporto di fluorescenza o un'analisi dello spettro a diverse lunghezze d'onda, tra gli altri metodi.

Protocollo

La specie algale Chroothece mobilis è stata utilizzata per il presente studio. La specie è stata ottenuta dalla collezione di colture Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Una panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1.

Figura 1: Panoramica dello studio. Chroothece mobilis viene incubato in condizioni di habitat estreme, come diverse luci monocromatiche, per 2 settimane. L'effetto sulla fisiologia di Chroothece viene valutato mediante autofluorescenza delle proteine contenute nei ficobilisomi e nei fotosistemi utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Preparazione del campione

1. Preparare l'inoculo di Chroothece mobilis dalla coltura di agar della raccolta trasferendolo al mezzo liquido SWES (Tabella 2).
   NOTA: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = mezzo di acqua di mare²³.
2. Mantenere tutte le colture per 2 settimane con un fotoperiodo chiaro/scuro 16:8 a 20 °C in condizioni di bassa intensità della luce bianca (LL: 80 μM/m²/s) e senza agitare, fino ad ottenere la densità cellulare desiderata (vedere punto 1.3).
   NOTA: Le condizioni di luce di crescita sono 80 μM/m²/s di intensità luminosa (radiazione fotosintetica attiva, PAR). Queste condizioni sono utilizzate come condizioni di scarsa illuminazione (controllo). La composizione del mezzo SWES è fornita nella tabella 2.
3. Effettuare inoculazioni per i diversi esperimenti nella fase di coltura esponenziale con una densità cellulare di 5 x 10³ cellule/ml in una piastra a 24 pozzetti, utilizzando 1 mL per pozzetto.
   NOTA: Eseguire il conteggio delle cellule con una camera Neubauer²⁴ e diluire la coltura con SWES quando necessario.

SWES composizione media
Componente	Concentrazione
KNO3	1,98 mM
K2HPO4	115 μM
MgSO4	81 μM
ZnSO4, 7H2O	17 nM
MnSO4, 7H2O	45 Nm
H3 BO3, 4H2O	3,1 mM
Co(N.3)2	17 mM
Na 2 MoO4, 6H2O	21 nM
CuSO4, 2H2O	0,1 nM
FeSO4, 5H2O	13 μM
EDTA, 7H2O	11 μM
Vit B12	5 μg
Estratto di terreno	30 ml
Acqua fluviale filtrata	455 ml

Tabella 2: Composizione media SWES.

2. Riproduzione di condizioni estreme dell'habitat delle alghe: effetto di luce monocromatica verde e rossa

1. Aggiungere 1 mL della coltura cellulare dalla coltura madre preparata alla suddetta densità cellulare (fase 1.2) per inoculare ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
2. Tenere la coltura cellulare coperta per 2 settimane per riprodurre l'effetto di luce monocromatica.
   1. Utilizzare il filtro verde che consente alla luce verde di passare da 470 a 570 nm con un picco alla lunghezza d'onda di 506 nm (secondo le specifiche del produttore; vedere Tabella dei materiali) ed esporlo alla coltura²⁵.
   2. Utilizzare il filtro rosso che consente alla luce rossa tra 590 e 720 nm e picchi a 678 nm (secondo le specifiche del produttore; vedi Tabella dei materiali) di esporlo alla coltura²⁵.
      NOTA: La condizione di bassa intensità della luce bianca (LL: 80 μM/m²/s; vedere la tabella dei materiali) viene utilizzata come controllo dell'intensità luminosa per confrontare gli effetti ottenuti. Le unità di intensità luminosa impiegate sono micromole al secondo e metro quadrato (μmol ^{m-2 s-1}) o densità di flusso di fotoni fotosintetici (PPFD).

3. Imaging ad autofluorescenza

NOTA: la configurazione del software di imaging (vedere la tabella dei materiali) è illustrata nella Figura 2.

1. Accendere tutti i componenti del microscopio a scansione laser confocale invertita (CLSM; vedere Tabella dei materiali), compreso il laser.
2. Montare le celle da ciascun pozzetto sperimentale della piastra a 24 pozzetti nel mezzo di crescita SWES su un piatto inferiore di vetro da 35 mm (vedi Tabella dei materiali) per l'imaging.
3. Scegli l'obiettivo ad immersione con glicerolo 63x/1,30 NA e posizionalo sopra l'obiettivo (vedi Tabella dei materiali).
4. Posizionare la piastra del pozzetto sul palco del microscopio e assicurarsi che il campione non si muova durante l'acquisizione dell'immagine.
5. Centrare il campione nel percorso della luce e concentrarsi sul centro della cella selezionando il piano con la più alta intensità di fluorescenza.
6. Apri il software di acquisizione immagini e scegli xyλ dall'elenco a discesa nella modalità di acquisizione²⁶.
7. Selezionare la linea di eccitazione del laser su 561 nm DPSS, 8 bit di gamma dinamica e 1024 x 1024 pixel.
   NOTA: Assicurarsi che il microscopio confocale disponga di un laser DPSS da 561 nm o di un laser a luce bianca (WLL).
8. Raccogliere gli spettri di emissione di fluorescenza nella larghezza di banda di 10 nm e la dimensione del passo lambda di 4 nm nell'intervallo 570-760 nm.
9. Impostare il foro stenopeico su 1 unità Airy ed eseguire l'acquisizione della scansione lambda.
10. Ripetere questo processo il maggior numero di volte possibile in diversi campi visivi per raccogliere una quantità accettabile di dati per l'analisi statistica (di solito una deviazione standard inferiore al 10%²²).
11. Ripetere l'ultimo passaggio nelle diverse condizioni (sotto luci rosse e verdi) e salvare i dati.
    NOTA: utilizzare le stesse impostazioni di acquisizione per i diversi campioni e condizioni per confrontare e condurre l'analisi statistica.

Figura 2: Configurazione del software. Interfaccia utente del software di imaging per impostare i parametri di scansione lambda. (A) Da sinistra a destra, selezionare la modalità di acquisizione xyλ dall'elenco a discesa, che corrisponde al punto 3.6 del protocollo, e selezionare il tipo di lente ad immersione destra, corrispondente al punto 3.3 del protocollo. Assicurarsi di rimuovere qualsiasi filtro dal percorso luminoso nel passaggio 3.9. (B) Il pannello per l'impostazione dei parametri di scansione lambda corrisponde al punto 3.8 del protocollo. (C) Eseguire la scansione lambda nel passaggio 3.10. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Parametri per valutare la fisiologia di Chroothece

1. Una volta acquisita la scansione lambda, fare clic sulla finestra di quantificazione nella parte superiore del software (come mostrato nella Figura 3) per valutare gli spettri di emissione di fluorescenza raccolti. Passare alla finestra Apri progetto e selezionare un file xyλ (Figura 3).
2. Selezionare Analisi profilo stack nel software di imaging.
3. Definire una regione di interesse (ROI) di 4 μm² al centro di una cella per analizzare l'intensità media di fluorescenza (MFI). Esporta i dati in formato CSV.
   NOTA: è importante evitare la presenza di pixel neri (per garantire che i pixel selezionati contengano valori positivi) e mantenere sempre un ROI delle stesse dimensioni.
4. Ripetere questo processo con celle diverse in condizioni diverse per produrre dati sufficienti per eseguire analisi statistiche.
5. Apri i file CSV per selezionare i diversi picchi di emissione di fluorescenza dalle ficobiliproteine e dalle clorofille di tutti i ROI misurati.
   1. Selezionare i dati di fluorescenza di ficoeritrina-ficocianobilina (PE-PCB; 620 nm), C-ficocianina (CPC; 648 nm), alloficocianina (APC; 660 nm) e clorofilla a (Chl a; 680 nm), rispettivamente, nel file csv.
6. Creare una nuova tabella con tutti i valori massimi di fluorescenza ottenuti da ciascun picco di ficobiliproteina e clorofilla e tracciare i dati su un grafico.
7. Eseguire analisi statistiche.
   1. Analizzare se i dati ottenuti soddisfano la normalità e l'omoscedasticità²⁷.
   2. Procedere all'analisi t-test^27,28 se la prima condizione è vera. In caso contrario, eseguire un test Mann-Whitney U²⁹.
   3. Considera le differenze significative ai valori p <0,05.

Figura 3: Valutazione dell'autofluorescenza di Chroothece. Per eseguire l'analisi di autofluorescenza, assicurarsi di selezionare la finestra di quantificazione e un file xyλ nella finestra dei progetti aperti (punto 4.1); Selezionare la visualizzazione del profilo dello stack (passaggio 4.2); selezionare un ROI di 4 μm² al centro di una cella e fare clic sul pulsante Report per esportare i dati di scansione lambda in formato CSV (passaggio 4.3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

La clorofilla a generalmente assorbe le lunghezze d'onda blu e rosse della luce visibile, mentre le ficobiliproteine usano lunghezze d'onda verdi, gialle e arancioni⁷. L'autofluorescenza di questi pigmenti rende possibile il primo approccio per studiare le ficobiliproteine e il comportamento della clorofilla in condizioni sperimentali e di campo.

Confrontando i dati ottenuti e tracciando su grafici diversi, è possibile distinguere cambiamenti significativi nell'intensi...

Discussione

Alcune alghe rosse unicellulari o coloniali, come Chroothece, crescono lentamente in vitro, ma contengono più composti autofluorescenti che possono essere analizzati mediante analisi spettrale al microscopio confocale, dove possono essere rilevate differenze nei picchi di emissione di pigmento. La microscopia a fluorescenza confocale spettrale ha permesso di condurre studi in vivo per valutare l'adattamento o l'acclimatazione di organismi fotosintetici 8,10,17,18,19,20....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	-
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	-
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	-
red filter	PNTA, LEE filters	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	-	-
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol