Autofluorescenza per valutare la fisiologia delle alghe rosse

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'imaging autofluorescenza passo-passo e la valutazione dei cambiamenti ficobiliproteici nelle alghe rosse sulla base dell'analisi spettrale. Questo è un metodo privo di etichette e non distruttivo per valutare l'adattamento cellulare ad habitat estremi, quando è disponibile solo materiale scarso e le cellule crescono lentamente, o per niente, in condizioni di laboratorio.

Abstract

Le alghe rosse (Rhodophyta) contengono ficobiliproteine e colonizzano gli habitat con luce fioca, tuttavia alcune (ad esempio, alcune specie di Chroothece ) possono anche svilupparsi in pieno sole. La maggior parte delle rodofite sono rosse, tuttavia alcune possono apparire bluastre, a seconda della proporzione di biliproteine blu e rosse (ficocianina e ficoeritrina). Diverse ficobiliproteine possono catturare la luce a diverse lunghezze d'onda e trasmetterla alla clorofilla a, il che rende possibile la fotosintesi in condizioni di luce molto diverse. Questi pigmenti rispondono ai cambiamenti dell'habitat nella luce e la loro autofluorescenza può aiutare a studiare i processi biologici. Utilizzando Chroothece mobilis come organismo modello e la modalità di scansione lambda spettrale in un microscopio confocale, è stato studiato l'adattamento dei pigmenti fotosintetici a diverse luci monocromatiche a livello cellulare per indovinare le condizioni di crescita ottimali della specie. I risultati hanno mostrato che, anche quando il ceppo studiato è stato isolato da una grotta, si è adattato sia a intensità luminose fioche che medie. Il metodo presentato è particolarmente utile per studiare gli organismi fotosintetici che non crescono o crescono molto lentamente in condizioni di laboratorio, come di solito accade per coloro che vivono in habitat estremi.

Introduzione

Le alghe rosse, come il genere Chroothece, possono crescere in habitat estremi, dove spesso devono far fronte a marcati cambiamenti ambientali¹. Inondazioni e siccità sono frequenti nelle regioni semi-aride dove questo genere può essere trovato, e alcune specie sono state segnalate in torrenti, scogliere, grotte o persino acque termali². Tuttavia, la maggior parte delle volte, le variabili biologiche, come la competizione o il pascolo, relegano le specie a condizioni non ottimali per la loro crescita. Poiché questi organismi sono spesso difficili da coltivare e non crescono o crescono molto lentamente in condizi....

Protocollo

La specie algale Chroothece mobilis è stata utilizzata per il presente studio. La specie è stata ottenuta dalla collezione di colture Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Una panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1.

Figura 1: Panoramica dello studio. Chroothece mobilis viene incubato in condizioni di habitat estreme, come diverse luci monocromatiche, per 2 settiman....

Risultati

La clorofilla a generalmente assorbe le lunghezze d'onda blu e rosse della luce visibile, mentre le ficobiliproteine usano lunghezze d'onda verdi, gialle e arancioni⁷. L'autofluorescenza di questi pigmenti rende possibile il primo approccio per studiare le ficobiliproteine e il comportamento della clorofilla in condizioni sperimentali e di campo.

Confrontando i dati ottenuti e tracciando su grafici diversi, è possibile distinguere cambiamenti significativi nell'intensi.......

Discussione

Alcune alghe rosse unicellulari o coloniali, come Chroothece, crescono lentamente in vitro, ma contengono più composti autofluorescenti che possono essere analizzati mediante analisi spettrale al microscopio confocale, dove possono essere rilevate differenze nei picchi di emissione di pigmento. La microscopia a fluorescenza confocale spettrale ha permesso di condurre studi in vivo per valutare l'adattamento o l'acclimatazione di organismi fotosintetici 8,10,17,18,19,20........

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	-
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	-
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	-
red filter	PNTA, LEE filters	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	-	-
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol