Автофлуоресцентная визуализация для оценки физиологии красных водорослей

Резюме

Настоящий протокол описывает пошаговую автофлуоресцентную визуализацию и оценку изменений фикобилипротеина у красных водорослей на основе спектрального анализа. Это безымянный и неразрушающий метод оценки клеточной адаптации к экстремальным местам обитания, когда доступен только дефицитный материал, а клетки растут медленно или вообще не растут в лабораторных условиях.

Аннотация

Красные водоросли (Rhodophyta) содержат фикобилипротеины и колонизируют места обитания с тусклым светом, однако некоторые (например, некоторые виды Chroothece ) также могут развиваться при полном солнечном свете. Большинство родофитов красные, однако некоторые из них могут казаться голубоватыми, в зависимости от пропорции синих и красных билипротеинов (фикоцианина и фикоэритрина). Различные фикобилипротеины могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его хлорофиллу а, что делает возможным фотосинтез при самых разных условиях освещения. Эти пигменты реагируют на изменения среды обитания в свете, и их автофлуоресценция может помочь в изучении биологических процессов. Используя Chroothece mobilis в качестве модельного организма и режим спектрального лямбда-сканирования в конфокальном микроскопе, адаптация фотосинтетических пигментов к различным монохроматическим источникам света была изучена на клеточном уровне, чтобы угадать оптимальные условия роста вида. Результаты показали, что даже когда исследуемый штамм был изолирован из пещеры, он адаптировался как к тусклому, так и к среднему освещению. Представленный метод особенно полезен для изучения фотосинтезирующих организмов, которые не растут или растут очень медленно в лабораторных условиях, что обычно имеет место для тех, кто живет в экстремальных средах обитания.

Введение

Красные водоросли, такие как род Chroothece, могут расти в экстремальных местах обитания, где им часто приходится справляться с заметными изменениями окружающей среды¹. Наводнения и засухи часты в полузасушливых регионах, где можно найти этот род, а некоторые виды были зарегистрированы в ручьях, скалах, пещерах или даже в термальных водах². Однако в большинстве случаев биологические переменные, такие как конкуренция или выпас скота, низводят виды до неоптимальных условий для их роста. Поскольку эти организмы часто трудно культивировать и они либо не растут, либо растут очень медленно в лабораторных условиях, одним из основных ограничений является доступный размер выборки. Поэтому очень важно следовать неразрушающим методам или методам, которые предполагают минимальные манипуляции с образцом ^3,4.

Физиологические навыки, необходимые для выживания в этих суровых условиях, можно контролировать, следя за изменениями в их фотосинтетических системах. Метаболические механизмы, эффективность фотосинтеза и чувствительность к свету или условиям культуры могут быть выявлены с помощью профилей излучения флуоресценции пигментов из-за точных изменений в их передаче энергии или улавливании 5,6,7,8.

Аутофлуоресценция клеточных соединений может быть использована в качестве маркера для цитодиагностики или в качестве естественного индикатора клеточного состояния или метаболизма в ответ на внешние и внутренние сигналы посредством изменений излучения⁹. Он также может быть использован для различения таксономически различных групп фотосинтезирующих организмов¹⁰. В зависимости от филогенетического положения фототрофных микроорганизмов можно обнаружить различные особенности флуоресценции in vivo. Таким образом, таксономическая идентификация, основанная на характеристиках фототрофной флуоресценции in vivo (включая спектры поглощения флуоресценции и излучения), была предпринята несколько раз^11,12. Из-за разнообразия вспомогательных пигментов среди таксонов фитопланктона различия в длинах волн, на которых стимулируется флуоресценция хлорофилла a (Chl a), или различия в спектрах излучения могут быть использованы для вывода^{таксономии 13}. Спектры возбуждения и излучения флуоресценции in vivo этих образцов зависят не только от типа водорослей, но и от адаптации фотосистемы¹⁴. Эффективность передачи энергии к Chl a, или отношение Chl a к вспомогательным пигментам, и содержание клеточного пигмента чувствительны к условиям роста⁵.

Красные водоросли, особенно Chroothece, имеют несколько дополнительных флуоресцентных пигментов - фикобилипротеинов и каротиноидов; Первые концентрируются в фикобилисомах, прикрепленных к тилакоидам хлоропластов. Фикобилипротеины (фикоцианин, фикоэритрин и аллофикоцианин) могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его Chl a, что делает возможным фотосинтез в самых разных условиях света и культуры¹⁵. Например, виды Chroothece могут расти внутри пещер или почти появляться в слегка соленых известковых ручьях².

Монохроматические огни влияют на рост и пигментный состав фотосинтезирующих организмов и были изучены для предотвращения или контроля роста фотосинтезирующих организмов в пещерах. Mulec et al. показали, что освещение, обогащенное красным цветом, способствует росту цианобактерий, водорослей и растений¹⁶. В предыдущих исследованиях также сообщалось, что зеленый свет влияет на пигментный состав цианобактерий¹⁷, в то время как другие показали, что зеленый свет предотвращает рост большинства фотосинтезирующих организмов, а некоторые цианобактерии демонстрируют снижение тилакоидов и более слабую среднюю интенсивность флуоресценции¹⁸.

Чтобы понять способность Chroothece как модельного организма преодолевать суровые условия, культивируемые клетки подвергались воздействию увеличения интенсивности света и монохроматического света (зеленого или красного)¹⁵, чтобы увидеть, как он справляется с тусклыми условиями пещер (где преобладает красный свет). Протокол, представленный в настоящем описании, воспроизводит влияние вышеупомянутых переменных на фикобилипротеины Chroothece на клеточном уровне с использованием собственной автофлуоресценции.

В настоящее время флуоресценция широко используется в качестве инструмента для изучения физиологических реакций сосудистых растений, микроводорослей, макроводорослей и цианобактерий^13,14,16. Спектральная конфокальная флуоресцентная микроскопия является превосходным инструментом для исследований in vivo для оценки физиологии фотосинтезирующих образцов на уровне отдельных клеток 10,17,18,19,20, избегая проблем^, связанных с низкой скоростью роста в лаборатории и трудностями с получением достаточного количества биомассы для соответствующей экстракции и биохимических методов⁸ . После обработки клеток в различных условиях культивирования в течение 2 недель профиль лямбда-сканирования можно измерить in vivo. Хотя существует несколько публикаций, в которых использовались различные длины волн возбуждения с помощью конфокальной визуализации 3,4,10,17, большинство фикобилипротеинов и Chl a могут быть обнаружены с использованием линии возбуждения с длиной волны 561 нм^, а обнаруженное излучение колеблется от 570 до ⁷⁶⁰ нм. Эти критерии были основаны на анализе, ранее проведенном 10 с коммерческими чистыми пигментами (таблица 1) с помощью конфокальной визуализации, и полученных результатах на различных видах водорослей^20,21,22.

Пигменты	λflmax (нм)	λ exc (нм)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11.2 ± 0.2	1.8 ± 0.05	2.0 ± 0.08	12.2 ± 0.7	6.0 ± 0.3	4.2 ± 0.16	80,7 ± 1,5
Р-ПЭ	569.2-583.3	5.9 ± 0.6	5.9 ± 0.16	11.1 ± 0.04	42.2 ± 0.3	100.0 ± 0	90,0 ± 0,3	99.2 ± 0.08	-
	652.1-668.6	-	-	1.5 ± 0.01	3.7 ± 0.04	26.7 ± 0.5	8.7 ± 0.16	11.1 ± 0.16	11.3 ± 0.2
С-ПК	636.2-676.4	2.3 ± 0.04	1.0 ± 0.01	0,6 ± 0,004	0,7 ± 0,008	2.0 ± 0.08	2.0 ± 0.04	3.3 ± 0.16	33.6 ± 0.9
БТР-XL	667.3-683.8	15.1 ± 1.5	9.6 ± 0.98	1.0 ± 0.04	1.2 ± 0.08	5.9 ± 0.7	4.1 ± 0.5	23.2 ± 3.5	91,4 ± 2,3

Таблица 1: Информация о чистом пигменте, используемая для выполнения анализа лямбда-сканирования. В этой таблице показаны пики излучения и максимумы плеч / полос флуоресценции различных флуорохромов/пигментов с помощью спектрофотометрии конфокальной визуализации для всех длин волн возбуждения, а также процент светового излучения пигментов/флуорохромов. Значения рассчитывались по формуле: = MFI*100/255. Каждое значение является средним значением ± SE (среднее ± стандартной ошибки от среднего). Чистые пигменты были использованы для калибровки конфокального сканирующего лазерного микроскопа следующим образом^: 1,2,10. Хлорофилл а был получен из Spinacia oleracea, R-фикоэритрин (R-PE) из Porphyra tenera и C-фикоцианин (C-PE) из Spirulina sp. Все виды растворяли в фильтрованной дистиллированной воде. Аллофикоцианин-XL (APC-XL) был получен из Mastigocladus laminosus, который растворяли в сульфате аммония (60%) и фосфате калия (pH = 7) для достижения концентрации 38 мМ. Сканирование проводили с 400 мкл каждого пигментного раствора (концентрация 1 мг / мл) с использованием 8-лунной стеклянной нижней камеры.

Изучение одной длины волны возбуждения является весьма полезным первым приближением. В этом случае, однако, необходимо выяснить относительный вклад различных комплексов в сигнал флуоресценции, что рекомендуется для выполнения коэффициента флуоресценции или спектрального анализа на нескольких длинах волн, среди других методов.

протокол

Для настоящего исследования был использован вид водорослей Chroothece mobilis . Вид был получен из коллекции культур Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Обзор протокола показан на рисунке 1.

Рисунок 1: Обзор исследования. Chroothece mobilis инкубируется в экстремальных условиях обитания, таких как различные монохроматические огни, в течение 2 недель. Влияние на физиологию Chroothece оценивается путем автофлуоресценции белков, содержащихся в фикобилисомах и фотосистемах, с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Пробоподготовка

1. Приготовьте инокулят Chroothece mobilis из агаровой культуры коллекции, перенеся его в жидкую среду SWES (табл. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = среда морской воды²³.
2. Выдерживают все культуры в течение 2 недель с фотопериодом светлый/темный 16:8 при 20 °C в условиях низкой интенсивности белого света (LL: 80 мкМ/м²/с) и без встряхивания до тех пор, пока не будет получена желаемая плотность клеток (см. этап 1.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия освещения для роста составляют 80 мкМ / м² / с интенсивность света (активное фотосинтетическое излучение, PAR). Эти условия используются в качестве условий низкой освещенности (контроль). Состав среды SWES приведен в таблице 2.
3. Проводите посевы для различных экспериментов в экспоненциальной фазе культивирования с плотностью клеток 5 x 10³ клеток/мл в 24-луночном планшете, используя 1 мл на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите подсчет клеток с помощью камеры^{Нойбауэра 24} и при необходимости разбавьте культуру SWES.

Средний состав SWES
Компонент	Концентрация
КНО3	1,98 мМ
К2ГПО4	115 мкМ
МгСО4	81 мкМ
ZnSO4, 7H2O	17 нМ
MnSO4, 7H2O	45 Нм
H 3BO3, 4H2O	3,1 мМ
Co(NO3)2	17 мМ
Na 2 MoO4, 6H2O	21 нМ
CuSO4, 2H2O	0,1 нМ
FeSO4, 5H2O	13 мкМ
ЭДТА, 7Ч2О	11 мкМ
Вит Б12	5 мкг
Экстракт почвы	30 мл
Фильтрованная речная вода	455 мл

Таблица 2: Состав среды SWES.

2. Воспроизведение экстремальных условий обитания водорослей: зеленый и красный монохроматический световой эффект

1. Добавьте 1 мл клеточной культуры из исходной культуры, приготовленной при вышеупомянутой плотности клеток (этап 1.2), чтобы инокулировать каждую лунку 24-луночной пластины.
2. Держите клеточную культуру закрытой в течение 2 недель, чтобы воспроизвести монохроматический световой эффект.
   1. Используйте зеленый фильтр, который пропускает зеленый свет в диапазоне от 470 до 570 нм с пиком на длине волны 506 нм (в соответствии со спецификациями производителя; см. Таблицу материалов), и подвергните его воздействию культуры²⁵.
   2. Используйте красный фильтр, который пропускает красный свет в диапазоне от 590 до 720 нм и пики при 678 нм (в соответствии со спецификациями производителя; см. Таблицу материалов), чтобы подвергнуть его воздействию культуры²⁵.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условие низкой интенсивности белого света (LL: 80 мкМ/м²/с; см. Таблицу материалов) используется в качестве регулятора интенсивности света для сравнения полученных эффектов. Используемыми единицами интенсивности света являются микромоль в секунду и квадратный метр (^{мкмоль, м-2} , ^с-1) или плотность потока фотосинтетических фотонов (PPFD).

3. Автофлуоресцентная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов) показана на рисунке 2.

1. Включите все компоненты инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM; см. Таблицу материалов), включая лазер.
2. Смонтируйте ячейки из каждой экспериментальной лунки 24-луночной пластины в питательной среде SWES в стеклянную нижнюю чашку диаметром 35 мм (см. Таблицу материалов) для визуализации.
3. Выберите иммерсионный объектив с глицерином 63x/1.30 NA и поместите глицерин поверх объектива (см. Таблицу материалов).
4. Поместите луночную пластину на столик микроскопа и убедитесь, что образец не перемещается во время получения изображения.
5. Отцентрируйте образец по световому пути и сфокусируйтесь на центре клетки, выбрав плоскость с наибольшей интенсивностью флуоресценции.
6. Откройте программное обеспечение для получения изображений и выберите xyλ из выпадающего списка в режиме съемки²⁶.
7. Выберите линию возбуждения лазера на 561 нм DPSS, 8 бит динамического диапазона и 1024 x 1024 пикселей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что конфокальный микроскоп оснащен DPSS-лазером с длиной волны 561 нм или лазером белого света (WLL).
8. Соберите спектры флуоресцентного излучения в полосе пропускания 10 нм и размер шага лямбда 4 нм в диапазоне 570-760 нм.
9. Установите точечное отверстие на 1 единицу Эйри и запустите сбор лямбда-сканирования.
10. Повторите этот процесс как можно больше раз в разных полях зрения, чтобы собрать приемлемый объем данных для статистического анализа (обычно стандартное отклонение ниже 10%²²).
11. Повторите последний шаг в разных условиях (при красном и зеленом свете) и сохраните данные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одни и те же настройки сбора данных для разных образцов и условий для сравнения и проведения статистического анализа.

Рисунок 2: Настройка программного обеспечения. Пользовательский интерфейс программного обеспечения для обработки изображений для настройки параметров лямбда-сканирования. (A) Слева направо, чтобы выбрать режим сбора данных xyλ из выпадающего списка, который соответствует шагу 3.6 в протоколе, и выбрать правый тип погружной линзы, соответствующий шагу 3.3 в протоколе. Убедитесь, что все фильтры удалены из светового тракта на шаге 3.9. (B) Панель настройки параметров лямбда-сканирования соответствует шагу 3.8 протокола. (C) Запустите лямбда-сканирование на шаге 3.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Параметры для оценки физиологии Chroothece

1. После получения лямбда-сканирования щелкните окно количественной оценки в верхней части программного обеспечения (как показано на рисунке 3), чтобы оценить собранные спектры флуоресцентного излучения. Перейдите в окно Open project и выберите один файл xyλ (рисунок 3).
2. Выберите Анализ профиля стека в программном обеспечении для обработки изображений.
3. Определите область интереса (ROI) 4^мкм2 в центре ячейки, чтобы проанализировать среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Экспортируйте данные в формате CSV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать присутствия черных пикселей (чтобы выбранные пиксели содержали положительные значения) и всегда поддерживать рентабельность инвестиций одинакового размера.
4. Повторите этот процесс с разными ячейками в разных условиях, чтобы получить достаточно данных для выполнения статистического анализа.
5. Откройте файлы CSV, чтобы выбрать различные пики излучения флуоресценции из фикобилипротеинов и хлорофиллов всех измеренных ROI.
   1. Выберите данные флуоресценции фикоэритрина-фикоцианобилина (PE-PCB; 620 нм), C-фикоцианина (CPC; 648 нм), аллофикоцианина (APC; 660 нм) и хлорофилла a (Chl a; 680 нм) соответственно в файле csv.
6. Создайте новую таблицу со всеми максимальными значениями флуоресценции, полученными от каждого пика фикобилипротеина и хлорофилла, и нанесите данные на график.
7. Проведите статистический анализ.
   1. Проанализируйте, соответствуют ли полученные данные нормальности и гомоскедастичности²⁷.
   2. Переходим к анализу t-критерия^27,28, если выполняется первое условие. Если нет, запустите тест Mann-Whitney U²⁹.
   3. Рассмотрим различия, значимые при значениях p <0,05.

Рисунок 3: Оценка автофлуоресценции Chroothece. Чтобы выполнить автофлуоресцентный анализ, убедитесь, что в окне открытых проектов выбрано окно количественного определения и один файл xyλ (этап 4.1); выберите визуализацию профиля стека (шаг 4.2); выберите ROI 4^мкм2 в центре ячейки и нажмите кнопку отчета, чтобы экспортировать данные лямбда-сканирования в формате CSV (шаг 4.3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Хлорофилл a обычно поглощает синие и красные длины волн видимого света, тогда как фикобилипротеины используют зеленые, желтые и оранжевые длины волн⁷. Автофлуоресценция этих пигментов делает возможным первый подход к изучению фикобилипротеинов и поведения хлорофилла в эк...

Обсуждение

Некоторые одноклеточные или колониальные красные водоросли, такие как Chroothece, медленно растут in vitro, но содержат несколько автофлуоресцентных соединений, которые могут быть проанализированы с помощью спектрального анализа под конфокальным микроскопом, где могут быть обнаруж...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	-
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	-
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	-
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	-
red filter	PNTA, LEE filters	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	-	-
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol