Un metodo point-of-care con uno strumento di supporto decisionale integrato per stimare l'anemia a livello di popolazione

Riepilogo

Un metodo accurato di stima dell'emoglobina manca al punto di cura e può ostacolare i programmi basati sulla popolazione per il trattamento dell'anemia. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo point-of-care basato su sangue capillare aggregato e un auto-analizzatore integrato in un'applicazione software personalizzata per classificare i valori di emoglobina in diversi gradi di anemia.

Abstract

Sono necessari solidi metodi point-of-care per stimare l'anemia a livello di popolazione. I metodi accurati sono basati sul laboratorio e non possono essere utilizzati presso il punto di cura. Per rispondere a questo avvertimento, è stato sviluppato un nuovo metodo basato su sangue capillare aggregato e un autoanalizzatore portatile per la stima dell'Hb. Inoltre, è stato sviluppato un software personalizzato per l'integrazione quasi in tempo reale dei valori di Hb dall'analizzatore automatico al server. Inoltre, è stato sviluppato uno strumento di supporto decisionale in grado di classificare immediatamente i partecipanti in diversi stadi dell'anemia. Lo strumento di supporto decisionale è stato progettato sulla base del cut-off dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per l'anemia a livello di popolazione ed era disponibile per tutti i gruppi di età e sesso. Questo strumento semplice e intuitivo potrebbe essere facilmente utilizzato dagli operatori sanitari in prima linea che hanno competenze tecniche limitate. Nel complesso, il metodo sviluppato potrebbe essere utilizzato presso il punto di cura ed è accurato. Questo metodo ad alto rendimento potrebbe essere utilizzato per lo screening dell'anemia a livello di popolazione per tutti i gruppi di età e sesso.

Introduzione

L'anemia è un grave problema di salute pubblica a livello globale, in particolare in India. È noto che l'anemia ha un impatto negativo sulla produttività lavorativa della popolazione e sulla crescita economica del paese¹. Per sfruttare gli sforzi a livello nazionale per ridurre l'anemia, l'ultimo programma di salute pubblica avviato nel 2018 è il programma Anemia Mukt Bharat (AMB). L'AMB identifica il "test" seguito da un "trattamento" personalizzato come uno degli approcci più promettenti per ridurre la prevalenza dell'anemia nei gruppi di età vulnerabili². Tuttavia, per implementare la strategia "test and treat" dell'AMB è necessaria una stima accurata dell'emoglobina (Hb) al punto di cura (POC) per diagnosticare l'anemia. Inoltre, metodi robusti sono utili per stimare con precisione l'anemia nelle indagini comunitarie su larga scala. Gli attuali metodi POC includono dispositivi non invasivi e minimamente invasivi e utilizzano campioni di sangue capillare per la stima dell'Hb³. Tuttavia, diversi fattori pre-analitici, come la variazione delle dimensioni della puntura del dito, lo spessore della pelle e la stabilità dei dispositivi POC in condizioni ambientali, portano a misurazioni imprecise e si traducono in grandi differenze nelle stime di prevalenza ^3,4,5. Pertanto, è necessario stabilire un metodo di stima dell'Hb che sia mobile, abbia un breve tempo di risposta (TAT) e sia adatto a contesti poveri di risorse⁶. Al fine di soddisfare queste esigenze, è stato sviluppato un metodo di raccolta del sangue capillare aggregato utilizzando una lancetta attivata al tocco (per garantire una profondità e una dimensione uniformi della puntura) per facilitare 6-8 gocce del campione di sangue a flusso libero in provette microtainer di acido etilendiamminotetraacetico di potassio (EDTA). L'Hb in questi campioni è stato poi misurato utilizzando un auto-analizzatore portatile posizionato in un veicolo presso il POC dotato di un'alimentazione ininterrotta o in un centro vicino con elettricità (Anganwadi, clinica sanitaria, Panchayath o famiglia). Uno studio di validazione che ha confrontato questo metodo con due metodi gold standard (campioni di sangue venoso appaiato e metodo della cianometamoglobina) ha mostrato un'elevata accuratezza e precisione ^7,8.

Oltre a mettere a punto un metodo POC valido e affidabile, c'è bisogno di un rapido processo decisionale per facilitare lo screening e il trattamento dell'anemia a livello di popolazione. Ciò non è attualmente fattibile quando la stima dell'Hb viene effettuata presso la struttura sanitaria e un ufficiale medico supervisiona direttamente la somministrazione di integratori di ferro e acido folico (IFA). A causa della grande popolazione assistita dagli ufficiali medici presso i centri sanitari di base, c'è un ritardo significativo nell'avvio dell'intervento. C'è bisogno di una tecnologia in grado di ridurre l'onere lavorativo dell'ufficiale medico e consentire agli operatori sanitari in prima linea di eseguire l'intervento senza il coinvolgimento diretto del personale medico. Pertanto, lo studio mirava a sviluppare un'applicazione personalizzata (app eSTAR) in grado di trasmettere automaticamente i dati dalla macchina e un algoritmo integrato che fornisca supporto decisionale ai lavoratori in prima linea sul dosaggio di IFA in base ai valori di Hb, all'età e ai gruppi di genere. Il software è stato progettato utilizzando strumenti open source come PHP: linguaggio di scripting PHP (hypertext preprocessor) e PHP desktop chrome con Visual Studio Code come ambiente di sviluppo integrato. Un protocollo di trattamento dettagliato basato sulle linee guida dell'anemia Mukt Bharat è stato integrato nell'applicazione Android².

Questo metodo integrato risponde alla crescente richiesta di ridurre i tempi di consegna dei risultati dei test, pur mantenendo l'accuratezza e la precisione. Inoltre, la capacità di fornire risultati in pochi minuti consente un rapido processo decisionale sull'inizio del trattamento e si traduce in una migliore erogazione dell'intervento⁹. Questo metodo integrato può essere adattato per qualsiasi indagine a livello di campo o programma di intervento che includa il test dell'Hb. Inoltre, può essere utilizzato presso la struttura sanitaria come aiuto lavorativo per il personale medico per decidere sul trattamento IFA.

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Protocollo

Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board dell'ICMR-National Institute of Nutrition, Hyderabad, India (IRB. n. 08/I/2018).

1. Raccolta di campioni capillari aggregati per l'analisi dell'Hb utilizzando l'analizzatore ematologico ^10,11

1. Configurazione della stampante e dello scanner di codici a barre
   1. Collegare la stampante di codici a barre al sistema portatile.
   2. Installare il driver della stampante di codici a barre sul laptop.
   3. Condividere la stampante nelle proprietà della stampante.
   4. Verificare la presenza di eventuali errori nella stampa del codice a barre nell'applicazione.
   5. Collegare lo scanner di codici a barre all'analizzatore automatico e si configurerà automaticamente.
   6. Fare doppio clic sull'icona per aprire il software applicativo installato sul computer desktop/portatile. Immettere le credenziali autorizzate nella pagina di accesso.
      NOTA: La home page dell'applicazione è costituita da schede per il caricamento dei risultati di laboratorio, i rapporti di controllo della qualità (QC) della stampa di codici a barre e il rapporto ematologico finale.
   7. Per generare codici a barre, fare clic sulla scheda Stampa codici a barre . L'elenco dei partecipanti viene visualizzato automaticamente nella scheda di stampa del codice a barre dopo aver inserito dettagli geografici come i nomi dei villaggi.
   8. Fare clic sulla selezione del display. Viene visualizzato l'elenco. Fare clic su Stampa codice a barre.
2. Raccolta di campioni di sangue capillare aggregato (Figura 1)
   1. Utilizzare una delle tre dita medie della mano sinistra per il prelievo di sangue capillare in un paziente adulto.
   2. Chiedere al partecipante di sedersi in una posizione comoda, che fornisca al flebotomo l'accesso al dito.
   3. Pulisci il dito con una salvietta imbevuta di alcol (contenente il 70% di alcol isopropilico) e lascialo asciugare.
   4. Etichettare i microtainer con le informazioni relative al partecipante (codice a barre) subito dopo l'identificazione del partecipante e prima della puntura cutanea.
   5. Raccogliere il campione di sangue utilizzando una lancetta di sicurezza monouso (lancetta attivata dal contatto 2,0 X 1,5 mm). Per raccogliere il campione di sangue, perforare la pelle a circa 1 cm dalla punta del dito tra il punto medio e il lato del dito. La puntura deve avvenire sulla superficie del palmo rivolto verso l'alto del polpastrello del medio o dell'anulare.
   6. Pulisci la prima goccia di sangue e raccogli i campioni di sangue successivi in un microtainer rivestito.
   7. Non massaggiare il dito.
   8. Posizionare il microtainer verticalmente sotto il sito di puntura in modo che le goccioline di sangue fluiscano liberamente nel tubo senza applicare pressione. Ripetere fino a raccogliere 4-6 gocce (circa 200 μL).
   9. Mescolare delicatamente il contenuto agitando e capovolgendo solo dopo aver tappato il contenitore del microtainer.
   10. Una volta raccolte 3-4 gocce di sangue, premere un batuffolo di cotone sulla punta del dito e far sedere il partecipante. Applicare una pressione manuale per fermare l'emorragia.
   11. Smaltire immediatamente la lancetta secondo le linee guida per lo smaltimento dei rifiuti biologici.

2. Analisi con analizzatore ematologico

1. Configurazione dell'autoanalizzatore con il software
   1. Scarica e installa i componenti del server FileZilla (127.0.0.1) sul laptop.
      Nota: disabilita il firewall di Windows o qualsiasi firewall di terze parti.
   2. Installare il software personalizzato sul laptop e copiare il percorso del percorso del file dell'American Society for Testing and Materials (ASTM) (C/programfiles x86/intended folder/ Web/wb/astmfiles)
   3. Nell'applicazione server FileZilla, creare l'utente e la password e mappare la posizione del file astm.
   4. Nel computer dell'analizzatore automatico, configurare la stessa serie IP (nelle impostazioni principali).
   5. Nell'analizzatore automatico, modificare l'opzione di sincronizzazione astm in FTP e fornire l'IP e le credenziali configurate sul laptop (ad esempio, 192.168.1.1 e nome utente e password FileZilla configurati).
   6. Riavviare l'analizzatore automatico e testare il processo di sincronizzazione dei file una volta pronto.
2. Analisi dei campioni di sangue mediante autoanalizzatore
   1. Utilizzare un analizzatore ematologico completamente automatizzato e portatile in modo che possa essere utilizzato con l'impostazione POC per fornire una misurazione istantanea dell'Hb e di altri indici dei globuli rossi (volume corpuscolare medio [MCV], emoglobina corpuscolare media [MCH], concentrazione media di emoglobina corpuscolare [MCHC] e larghezza di distribuzione dei globuli rossi [RDW]).
   2. Controllare i livelli di solventi (almeno 1/^{4 del} flacone di reagente è pieno) e verificare se sono presenti in quantità sufficienti.
      NOTA: I solventi sono costituiti da soluzione enzimatica, soluzione lisante e soluzione isotonica tamponata (Tabella dei materiali).
   3. Accendere lo strumento facendo clic sull'interruttore ON/OFF sulla macchina. Assicurarsi che lo strumento sia collegato a un laptop tramite un cavo FTP (Twined Pair).
   4. Controllare lo schermo del display a cristalli liquidi (LCD) per capire se la temperatura esterna è suscettibile di avviare l'analisi o meno. Una temperatura >35 °C non è consigliabile. Collocare la macchina in un ambiente in cui la temperatura ambiente sia di <35 °C.
   5. Una volta completata l'inizializzazione, consentire all'analizzatore di eseguire automaticamente un ciclo di avvio (la funzione di avvio automatico è attivata di default).
   6. Dopo il ciclo di avvio, controllare il display dello strumento per il conteggio dei pezzi grezzi di riferimento. Assicurarsi che il numero di pezzi grezzi di riferimento non superi i seguenti limiti di parametro: Hb < 0,3 g/dL e WBC < 0,3 x 10³/mm³, RBC < 0,02 x 10⁶/mm³; HCT 0% e PLT < 10 x 10³/mm³. Quindi, premere il pulsante √ per convalidare i risultati vuoti.
   7. Se l'analizzatore non esegue automaticamente un ciclo di avvio al termine della fase di inizializzazione, premere il tasto START-UP sul pannello frontale dello strumento per avviare il ciclo.
   8. A questo punto, l'analizzatore mostrerà una pagina di accesso. Immettere il nome utente e la password predefiniti. Premere il pulsante √ per procedere ulteriormente.
   9. Prima dell'analisi del campione, eseguire tre livelli di controlli (basso, normale e alto) per verificare la precisione dell'analizzatore. Conservare il controllo a 2-8 °C e portarlo a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso. Mescolare delicatamente i controlli più volte prima dell'uso.
      NOTA: I controlli vengono acquistati come reagenti pronti all'uso dal produttore e caricati così come sono. I flaconcini vengono conservati a 4 °C. La normale durata di conservazione è di 15 giorni. I controlli dovrebbero essere monitorati regolarmente utilizzando la trama di Levey Jenning. Se il valore di controllo scende al di sopra o al di sotto di 3 SD, eseguire una pulizia concentrata utilizzando la soluzione di lavaggio fornita dal fornitore.
   10. Una volta conclusa con successo la fase di controllo qualità, prepararsi per l'analisi del campione.
   11. Scansionare il codice a barre attaccato al contenitore del campione con lo scanner collegato all'analizzatore e premere il segno X .
   12. Menziona il sesso del soggetto (maschio o femmina) e premi il pulsante √ per procedere ulteriormente.
   13. Lo strumento mostrerà i dettagli del soggetto insieme a un codice. Premere X se i dati inseriti sono errati.
   14. Prima di caricare il campione di sangue nella macchina, mescolare delicatamente e accuratamente il campione di sangue.
   15. Rimuovere il tappo con cautela per non consentire la fuoriuscita di sangue.
   16. Posizionare la provetta sotto l'ago di campionamento e muovere la provetta verso l'alto fino a quando l'ago di campionamento non entra nel sangue.
   17. Premere l'interruttore di avvio . L'ago di campionamento aspira 10 μL di sangue. Il ciclo di analisi durerà circa 60 s. Al termine del ciclo, il risultato verrà visualizzato sul pannello LED.
   18. Stampa i risultati facendo clic sull'icona Stampante .
   19. Fare clic sulla freccia indietro per procedere con il secondo campione.
   20. Una volta terminata l'analisi, carica i risultati del test di laboratorio.
3. Caricare i dati dall'analizzatore al server.
   1. Collegare il sistema a qualsiasi provider di servizi Internet che fornisca una velocità minima di 20 mbps.
   2. Fare doppio clic sull'icona per aprire l'icona del software applicativo, che appare sul desktop dopo l'installazione. Immettere le credenziali autorizzate nella pagina di accesso.
      NOTA: La home page dell'applicazione è costituita da schede per il caricamento dei risultati di laboratorio, la stampa di codici a barre, i rapporti QC e il rapporto ematologico finale. La pagina di caricamento dei risultati dei test di laboratorio mostra i test completati. Il nome del file è costituito dall'ID della macchina e dalla data dell'analisi in formato .astm.
   3. Fare clic sul pulsante Carica risultati . Una volta che i risultati sono stati caricati correttamente, nel server, i file .astm vengono convertiti in .csv formato e i file convertiti appariranno nel referto ematologico. Scaricare i file in formato .astm per i record.
      NOTA: La pagina visualizzerà che i file popup sono stati caricati correttamente. Se sono presenti file duplicati, verranno identificati.
   4. Per i partecipanti per i quali vengono caricati i file ASTM, la decisione sullo stato dell'anemia (basata sulla Tabella 1 e sulla Tabella 2) verrà generata come report nell'applicazione web. Per visualizzare la decisione sull'anemia, accedere all'applicazione Web, fare clic su Rapporti, quindi fare clic su EDSS. Un report sarà visibile come tabella per tutti i partecipanti.
   5. Per visualizzare i risultati dei singoli test e le decisioni sullo stato dell'anemia, nonché il regime di trattamento, accedere all'applicazione di follow-up, cercare il partecipante utilizzando l'ID o il nome, fare clic sul pulsante EDSS e visualizzare i risultati.

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Risultati

Testare la validità del metodo
La validità di questo metodo è stata stabilita confrontandolo con il gold standard, che era il metodo basato sull'autoanalizzatore del sangue venoso. Lo studio di convalida è stato descritto in dettaglio altrove⁸. In breve, 748 volontari apparentemente sani hanno fornito un campione venoso e un campione capillare consecutivamente lo stesso giorno. Le analisi sono state condotte presso il POC. I partecipanti avevano un'ampia gamma di valori di ...

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Discussione

Il presente documento descrive un metodo point-of-care che utilizza un campione di sangue capillare aggregato e un analizzatore automatico. Il metodo è stato integrato con un software personalizzato, in grado di caricare automaticamente i risultati dell'analizzatore sul server e generare decisioni sull'anemia. Inoltre, potrebbe fornire le dosi di trattamento di IFA secondo il protocollo del programma nazionale².

Il software personalizzato è stato progettato per integr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABX Miniclean	Horiba Ltd, Japan	23-450-004	Enzymatic solution
ABX Minidil LMG	Horiba Ltd, Japan	23-450-008	Buffered isotonic solution for RBC/PLT dilution, sleeving and cleaning
ABX Minilyse	Horiba Ltd, Japan	23-450-006	Hb measurement; lysing solution
ABX Minocal	Horiba Ltd, Japan	2032002	Calibrator
ABX Minoclair	Horiba Ltd, Japan	23-450-003	Cleaning reagent
ABX Minotrol 16 - 2H	Horiba Ltd, Japan	2042209	Blood control
ABX Minotrol 16 - 2L	Horiba Ltd, Japan	2042208	Blood control
ABX Minotrol 16 - 2N	Horiba Ltd, Japan	2042202	Blood control
Autoanalyzer	Horiba Ltd, Japan	ABX Micros ES 60	The FTP port should be functional
Barcode printer	Technology service corporation, USA	TSC Model TE 244	400 Mhz 32 bit RISC processor with 16 MB SDRAM, 8 MB Flash memory
Barcode Scanner	Retsol	LS-450	Any company which can provide a scanner with the following specifications: 32 bit CPU fast decode ability, IP 54 rated, Light source – visible laser diode 650 nm, Single scan pattern with scan rate of 100scans/second, Scan width of 200 mm & precision of 4 mil, Scan angle – YAW 65 Deg, Rotation 30 Deg & Pitch 55 Deg, Scan indication – buzzer, light indicator, Scan mode both manual & continue scanning
BD needles holder	Becton, Dickinson and company Ltd, Dublin, Ireland	364879
Contact activated lancet	Becton, Dickinson and company Ltd, Dublin, Ireland	366594, 366593	For children below 1 year, venous blood sample has been collected.
Custom software	Kavin Corporation, Bangalore	N/A
K2-EDTA Microtainer-5 mL	Becton, Dickinson and company Ltd, Dublin, Ireland	363706	EDTA tube for blood profile analysis with 1.0 mg K2 EDTA, dimensions 13 x 75 mm
Labels	G-Technologies, Secunderabad, telangana	N/A
Laptop	Any	N/A	Intel Core I3-1005G1,  8GB DDR4, 1TB HDD, 15.6 FHD LED, WIN 11 HOME  and MS OFFICE H&S