Costruzione di un olfattometro per studi sul comportamento olfattivo dei roditori

Riepilogo

Questo protocollo descrive la costruzione di un olfattometro per esperimenti di comportamento olfattivo go/no-go. Vengono fornite istruzioni dettagliate, insieme alle immagini, per garantire il successo della costruzione dell'olfattometro. Sono incluse anche informazioni per la risoluzione dei problemi riscontrati durante il processo.

Abstract

L'uso di olfattometri per studiare il comportamento dei roditori e l'attività cerebrale durante le attività olfattive è fondamentale per comprendere i circuiti cerebrali. Questi sofisticati dispositivi consentono ai ricercatori di controllare e fornire con precisione gli stimoli olfattivi, consentendo lo studio di complessi processi olfattivi nei roditori. Sebbene gli olfattometri disponibili in commercio siano convenienti, presentano sfide quando sorgono problemi tecnici, spesso richiedendo un'assistenza costosa e potenzialmente interrompendo le tempistiche di ricerca. Questo articolo descrive in dettaglio la costruzione di un olfattometro personalizzato specificamente progettato per esperimenti sul comportamento olfattivo del topo, fornendo un elenco completo di parti e istruzioni dettagliate. L'olfattometro è controllato tramite MATLAB, che offre un'interfaccia user-friendly per i ricercatori. È importante sottolineare che il codice open source consente agli utenti di modificare e adattare il sistema, adattando le attività comportamentali per soddisfare specifiche esigenze sperimentali. La creazione di un olfattometro personalizzato offre agli utenti le conoscenze e le capacità di eseguire la progettazione sperimentale personalizzata e la risoluzione dei problemi in modo indipendente, risparmiando tempo e risorse. Questo approccio non solo migliora la flessibilità della ricerca, ma favorisce anche una comprensione più profonda della funzionalità dell'apparecchiatura, portando in ultima analisi a studi olfattivi più robusti e affidabili nei roditori.

Introduzione

Gli intricati meccanismi alla base del processo decisionale olfattivo offrono spunti affascinanti sulla notevole complessità del sistema di elaborazione sensoriale del cervello ^1,2,3. All'interno del bulbo olfattivo dei topi, una vasta gamma di neuroni sensoriali olfattivi converge su circa 2.200 glomeruli, ciascuno innervato da neuroni che esprimono lo stesso recettore olfattivo⁴. Sorprendentemente, anche singoli odori sintetici possono stimolare una parte sostanziale dei circa 1.100 recettori olfattivi nei topi ^5,6. Tuttavia, la sfida va oltre il rilevamento iniziale degli odori. Le dinamiche temporali dell'arrivo dell'odore, influenzate dall'atto ritmico di annusare, arricchiscono ulteriormente il paesaggio sensoriale, aggiungendo strati di informazioni che il cervello può decifrare. Aggravato dalla complessità degli stimoli naturali, come l'urina conspecifica, che contiene centinaia di odoranti, il sistema olfattivo affronta il formidabile compito di districare gli intricati schemi di attivazione glomerulare per differenziare tra i vari profumi ^7,8.

Per affrontare questa sfida, il cervello orchestra l'attività neurale in più regioni, tra cui la corteccia piriforme, la corteccia entorinale laterale, l'ippocampo, il tubercolo olfattivo, la corteccia prefrontale e persino il cervelletto 9,10,11,12,13,14. All'interno di questi circuiti, le cellule piramidali nella corteccia piriforme integrano e modulano le informazioni trasmesse dalle cellule mitrali, mentre altre aree cerebrali contribuiscono a un ruolo unico nel plasmare la percezione olfattiva 15,16,17. Inoltre, l'elaborazione degli stimoli olfattivi da parte del cervello è influenzata dinamicamente da fattori contestuali, sottolineando l'adattabilità e la sofisticazione del processo decisionale olfattivo.

Questo articolo descrive la costruzione di un olfattometro personalizzato che consente la valutazione controllata da computer delle prestazioni comportamentali di topi che si muovono liberamente impegnati in un compito go/no-go. In questo compito di apprendimento associativo, il topo privato dell'acqua inizia una prova leccando un beccuccio di erogazione dell'acqua situato all'interno di un cono di erogazione dell'odore. Uno dei due odoranti viene erogato 1-1,5 secondi dopo che l'animale ha iniziato la prova. Se l'odorante è l'odorante ricompensato (S+), il topo riceve una ricompensa in acqua se lecca almeno una volta in ciascuna delle quattro finestre temporali di 0,5 s (un colpo). In caso contrario, il mouse non riceve alcuna ricompensa (Miss). Se l'animale riceve l'odorante non ricompensato (S-), non viene consegnata alcuna ricompensa e se il topo lecca in ciascuna delle quattro finestre temporali (Falso allarme, FA), viene imposto un ritardo prima dell'inizio della prova successiva. Se l'animale non riesce a leccare in una delle finestre temporali, la prova viene conteggiata come un rifiuto corretto (CR) e non viene applicato alcun ritardo. La percentuale di prestazioni corrette è calcolata come la percentuale di prove in cui il mouse ottiene un Hit o un CR in una finestra di venti prove:

Percentuale corretta = 100 ((Hit + CR) / 20)

Ci sono due questioni chiave per garantire il corretto funzionamento degli olfattometri progettati per valutare il comportamento olfattivo go/no-go. In primo luogo, l'olfattometro deve monitorare le risposte del topo in tempo reale per fornire di conseguenza ricompense odorizzanti e acquatiche. Questo olfattometro si ottiene monitorando le leccate misurando la resistenza tra la tromba d'acqua e il pavimento della camera o rilevando la capacità¹⁸. Un programma MATLAB utilizza quindi queste informazioni per prendere decisioni sull'erogazione di odorizzanti e sulla ricompensa dell'acqua. Il secondo problema è la necessità di un'erogazione affidabile e riproducibile di odorizzanti. Questo olfattometro si ottiene azionando valvole che bilanciano l'aria satura di odori con l'aria vettore, che viene poi erogata a un cono anteriore. L'aria viene bilanciata con l'odorizzante facendolo gorgogliare attraverso una soluzione odorizzante diluita con olio minerale. La concentrazione dell'odorizzante viene misurata con un rivelatore a fotoionizzazione e può essere calcolata in base alla pressione di vapore e al coefficiente di attività, seguendo le procedure descritte da Williams e Dewan^18,19.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus. Gli animali utilizzati in questo studio erano topi maschi CaMKIIα WT, di età pari a due mesi al momento dell'impianto del tetrodo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Scheda e saldatura di pulsanti momentanei unipolari a corsa singola (SPST)

1. Procurarsi il battiscopa bianco su misura con fori per fissare i rack per valvole per odori, flussometri, scheda SSR48 e altri componenti mostrati nella Figura 1A.
   NOTA: Il battiscopa bianco utilizzato in questo studio è stato prodotto dall'officina meccanica del Neurotechnology Center presso il CU Anschutz Medical Campus (Figura 1A). I file di disegno sono disponibili all'indirizzo
2. Aggiungere viti da 1 pollice e distanziatori da 3/4 di pollice per il posizionamento dell'SSR48-RACK. Le viti si trovano in alto a destra sul retro della lavagna (Figura 1A).
3. Montare l'SSR48-RACK. L'SSR48-RACK sarà posizionato sul lato superiore sinistro del retro della lavagna (Figura 1C).
4. Praticare dei fori (0,4 cm) per posizionare i blocchi morsettiera a vite sul retro della lavagna. Le morsettiere a vite si trovano al centro a destra del retro della lavagna (Figura 1D).
5. Dall'alto verso il basso: la prima morsettiera a 4 viti verrà utilizzata per collegare i cavi per 24 V. La prossima morsettiera a vite verrà utilizzata per i cavi da 5 V. Lasciare vuota una morsettiera a vite e le ultime 4 morsettiere a vite verranno utilizzate per collegare i fili di terra.
6. Praticare dei fori (0,8 cm) nella scatola di controllo per il posizionamento degli interruttori a pulsante momentanei SPST. La scatola di controllo si troverà nella parte inferiore anteriore della lavagna (Figura 1E).
7. Impostare gli interruttori a pulsante momentanei SPST. Saldare due fili all'interruttore a pulsante momentaneo SPST. È preferibile utilizzare due colori diversi, come il rosso e il nero o il verde (Figura 1F).
8. Collegare l'interruttore a pulsante momentaneo SPST alla scatola di controllo. I pulsanti sono dotati di un dado che viene utilizzato per essere fissato alla scatola nera di controllo (Figura 1G).
9. Fissare i fili attorcigliandoli o fissandoli con del nastro adesivo per tenerli insieme e organizzati.
   NOTA: L'alimentazione a 24 V viene utilizzata per alimentare le valvole a manicotto e le valvole per gli odori, mentre l'alimentazione a 5 V viene utilizzata per il circuito di leccatura.
10. Posizionare le valvole degli odori nelle fessure del rack delle valvole degli odori situato al centro della lavagna (Figura 2A).
    1. Staccare i fili che escono dalle valvole e saldare un filo da ciascuna valvola su un filo più spesso. Posizionare un filo a terra sulle morsettiere a vite sul retro della lavagna e un secondo filo nel pin corrispondente nell'SSR48-RACK. Ad esempio, la valvola degli odori 1 va al pin 1, la valvola degli odori 2 va al pin 2, ecc. (Figura 2B).
    2. Collegare i pin da 1 a 8 dell'SSR48-RACK a due valvole a manicotto ciascuna (valvole di ingresso e di uscita per le fiale di equilibratura dell'olio minerale). Per ogni valvola, collegare un filo da un pulsante all'alimentazione a 24 V e l'altro filo al pin dell'SSR48-RACK che è collegato alla valvola. L'altro filo va dalla valvola a terra. Fare riferimento alla Figura 2B, C per posizionare i fili al loro posto.
    3. Posizionare la valvola dell'acqua e la valvola finale nelle fessure corrispondenti della piastra della valvola. Lo slot si trova al centro della lavagna. Vedere la piastra delle valvole nella Figura 1 e il posizionamento delle valvole nella Figura 3A.
    4. Collegare la valvola dell'acqua e la valvola finale a terra e ai pin 17 e 18, rispettivamente, nell'SSR48-RACK. Collegare i pulsanti a 24 V e ai pin 17 e 18 (Figura 2B).

2. Alimentazione

1. Acquista un alimentatore e una prolunga. Le informazioni relative al tipo specifico di alimentazione sono disponibili nella tabella dei materiali. L'alimentatore fornirà uscite a 24 V (V3) e 5 V (V1) e messa a terra all'olfattometro.
2. Tagliare la spina del cavo di alimentazione per l'alimentatore. In particolare, la parte femmina della prolunga. Una volta tagliato, si possono vedere tre fili. Il filo verde è collegato a G (massa) sull'alimentatore e gli altri due fili (bianco e nero) sono collegati rispettivamente a L e N dell'ingresso a 120 V CA all'alimentatore (Figura 3B).
   ATTENZIONE: I cavi di alimentazione a 120 V sono esposti e sussiste il rischio di lesioni dovute a scosse elettriche. È meglio coprirlo con un isolante.
3. Tagliare un'estremità del cavo che alimenta l'SSR48-RACK. Collegare uno dei fili alla vite G dell'alimentatore e il secondo al V1 dell'alimentatore (Figura 3C).
4. Sull'alimentatore, collegare un filo da G2 a terra sulle morsettiere a vite (Figura 2C).
5. Sull'alimentatore, collegare un filo da V1 alle morsettiere a vite da 5 V (Figura 2C).
6. Sull'alimentatore, collegare un filo da V3 alle morsettiere a vite da 24 V (Figura 2C).

3. Scheda sensore Lick

1. Procuratevi una breadboard da 400 punti di collegamento e fate passare un filo che si colleghi dai punti di collegamento B7 a B15 (Figura 3D).
2. Collegare un'estremità di un filo al punto di legatura 6+ e l'altra estremità al punto di legatura C22 della breadboard (Figura 3D).
3. Collegare un'estremità a D16 e la seconda estremità a G22 della breadboard (Figura 3D).
4. Collegare un'estremità di un cavo allo slot I22 e la seconda estremità al 29- della breadboard (Figura 3D).
5. Collegare un'estremità di un cavo allo slot 20A e la seconda estremità a 29A della breadboard (Figura 3D).
6. Collegare un'estremità di un cavo a 21B e la seconda estremità a 28B della breadboard (Figura 3D).
7. Collegare un'estremità di un filo allo slot 1+ della breadboard e la seconda estremità ai 5 V delle morsettiere a vite (Figura 3D).
8. Collegare un'estremità di un cavo alla fessura 1- della breadboard e la seconda estremità alla massa delle morsettiere a vite (Figura 3D).
9. Collegare un'estremità di un cavo allo slot C7 della breadboard e la seconda estremità al pin 27 dell'SSR-48RACK (Figura 3D).
10. Collegare un'estremità di un filo allo slot 28C della breadboard e la seconda estremità avrà una clip a coccodrillo attaccata che si collegherà alla parte metallica della tromba d'acqua (Figura 3D).
11. Collegare un'estremità di un cavo allo slot 20B della breadboard e l'altra estremità al terminale centrale del potenziometro (Figura 3D). I due terminali collegati agli elementi di resistenza del potenziometro sono collegati a massa e a 5 V. Il terminale centrale è collegato alla breadboard.
12. Ottenere resistori da 21 mΩ. Per il primo, collegare un'estremità a 19A e la seconda estremità a 20D. Per il secondo, collegare un'estremità a 22C e l'altra estremità a 21D. Collegare al potenziometro (Figura 3D).
13. Ottenere un resistore da un kΩ. Collegare un'estremità a 14C e la seconda estremità a 19C. Collegare al potenziometro (Figura 3D).
14. Procurarsi una resistenza da 120 Ω. Collegare un'estremità a 7D e la seconda estremità a 7H (Figura 3D).
15. Procurati una luce LED. Il colore non ha importanza. Collegare un cavo LED a 7J e il secondo filo a 6- (Figura 3D).
16. Procurati due amplificatori operazionali (amplificatori operazionali). I collegamenti per il primo sono da E10 a E16, F10-F16 (Figura 3D).

4. Approvvigionamento di aria e acqua

1. Posizionare due flussometri (uno da 2 L/min e uno da 50 cc/min) nei supporti dei flussometri. La Figura 4A mostra il sistema di flusso d'aria complessivo e la Figura 4B mostra la vista ingrandita dei misuratori di portata.
2. Procurarsi una pompa per acquario per fornire un flusso d'aria di 2 L/min. Il modello di pompa per acquari qui utilizzato ha due uscite (vedi Tabella dei materiali). Collegare un piccolo pezzo di tubo da ciascuna delle due uscite della pompa dell'acquario ai due ingressi di un connettore a T (Figura 4B).
3. Collegare un pezzo di tubo dall'uscita del connettore a T all'ingresso di un filtro a carboni attivi (Figura 4B).
4. Collegare il tubo dall'uscita del filtro a carbone a un connettore a T e collegare le due uscite del connettore a una valvola a sfera per regolare la portata d'aria (Figura 4C).
5. Collegare l'uscita di ciascuna valvola a sfera all'ingresso dei misuratori di portata (Figura 4D).
6. Collegare l'uscita del flussometro da 50 cm/min al collettore superiore, fornendo aria alle fiale di equilibrazione degli odori da 40 mL con odoranti diluiti in olio minerale (Figura 4E).
7. Collegare l'uscita di ciascuna fiala di odore all'ingresso corrispondente nel collettore inferiore.
8. I tubi che collegano le fiale degli odori ai collettori sono tubi con valvola a manicotto che vengono aperti dalle due valvole a manicotto separate. Posizionare il tubo nelle valvole a manicotto.
9. Collegare l'uscita del flussometro da 2 L/min all'ingresso dell'ingresso laterale del collettore inferiore.
10. Collegare l'uscita del collettore inferiore all'ingresso della valvola finale (deviatrice) (Figura 4F).
    1. Collegare l'uscita di default della valvola finale al tubo di erogazione degli odori nella camera passa/non passa. Collegare l'uscita di spegnimento predefinita della valvola finale a un tubo di scarico (Figura 4G). Ciò si traduce in un flusso d'aria continuo non odorizzato di 2 L/min quando la valvola finale è spenta.
    2. Per ogni prova, assicurati che la valvola finale si apra quando l'animale lecca, portando l'aria allo scarico, e contemporaneamente si accenda la valvola degli odori. Ciò si traduce nell'equilibrio dell'odore nel flusso d'aria di fondo.
    3. Dopo 1-1,5 s, assicurarsi che la valvola finale si spenga, deviando l'aria nella camera. Ciò si traduce in un forte aumento della concentrazione di odorizzanti. Dopo 2,5 s, la valvola degli odori si spegne e la concentrazione degli odori torna a 0.
    4. Collegare un ago da 18 G alla punta della siringa da 5 ml che verrà utilizzata per erogare la ricompensa in acqua (Figura 4H).
    5. Collegare un tubo (2 mm di diametro) alla punta dell'ago (Figura 4H).
    6. Collegare l'altra estremità del tubo all'ingresso della valvola dell'acqua. Potrebbe essere necessario tagliare un tubo di diametro diverso per adattarsi all'ingresso della valvola dell'acqua (Figura 4I).
    7. Collegare il tubo dall'uscita della valvola dell'acqua al beccuccio (Figura 5A).

5. Collegamento dell'olfattometro al computer e installazione del software

1. Collegare l'SSR48-RACK al DIO96H/50 con un connettore femmina-femmina a 100 pin. Collegare il cavo USB dal DIO96/H50 al computer (Figura 5B).
2. Scarica l'ultima versione del software e dei driver mccdaq e InstaCal.
   NOTA: InstaCal è il programma che verifica la comunicazione tra il computer e DIO96/H50. Scarica il software e i driver più recenti qui: https://www.mccdaq.com/software-downloads.aspx.
3. Esegui InstaCal. Assicurati che l'"Universal Serial Bus" indichi la scheda # come numero corretto, di solito #1 = scheda #1 USB-DIO96H/50.
4. Scarica MATLAB.
5. Scarica i programmi MATLAB per eseguire l'olfattometro da https://github.com/restrepd/dropc.
6. Apri MATLAB come amministratore e imposta il percorso in modo che MATLAB riconosca i programmi. Nella scheda Home dell'ambiente MATLAB, fare clic su Imposta percorso nella sezione Ambiente. Si apre una finestra di dialogo in cui è possibile aggiungere cartelle nel percorso di ricerca.
7. Eseguire daqregister('mcc'). Modificare il numero della scheda in dropcInitializePortsNow.m.
   NOTA: handles.dio = digitalio('mcc',1); %(1 o 0 a seconda del computer).
8. Testare dropcspm.m eseguendo una prova a secco in cui l'utente "risponde" ad ogni prova collegando il circuito elettrico tra il beccuccio da leccare e il pavimento metallico della camera che è collegata a terra.
   NOTA: L'olfattometro è ora pronto per l'uso. Informazioni su come addestrare il topo si trovano in Nicole Arevalo et ^al.20.

6. Esperimenti sugli animali

1. Preparare con cura i soggetti animali per iniziare il processo sperimentale. Pesare ogni topo individualmente utilizzando una bilancia calibrata e registrare il peso in un registro di laboratorio. Monitora questi dati cruciali durante lo studio per monitorare la salute degli animali e affrontare tempestivamente eventuali variazioni di peso.
2. Posizionare delicatamente i mouse nella camera del mouse appositamente progettata dopo la pesatura. Attivare i sensori e i sistemi di erogazione degli stimoli per l'attività di discriminazione olfattiva. Assicurarsi che la camera riduca al minimo lo stress sugli animali, mantenendo un controllo preciso delle condizioni sperimentali.
3. Assicurarsi che l'animale sia a suo agio nella camera. Avviare il programma MATLAB per controllare i parametri sperimentali come l'erogazione di stimoli olfattivi (2,5 s), l'erogazione di acqua e la registrazione delle risposte. Analizza i dati in tempo reale per ottenere un feedback immediato sulle prestazioni dell'animale.
4. Monitora e analizza continuamente le prestazioni dell'animale. Guarda il punteggio di competenza calcolato in base alla percentuale di risposte corrette. Cerca di fare in modo che ogni animale raggiunga un punteggio di prestazione di 80 o superiore, che segna la soglia per la competenza nel compito.
5. Inizia la nuova fase dell'esperimento una volta che l'animale raggiunge costantemente un punteggio di competenza di 80 o superiore, indicando la padronanza della discriminazione iniziale della coppia di odori. Inverti la coppia di odori, lasciando il profumo precedentemente premiato e viceversa.
   1. Testare la flessibilità cognitiva dell'animale e la capacità di disimparare e riapprendere le associazioni, ottenendo così preziose informazioni sulla plasticità dell'apprendimento olfattivo nei topi.

Risultati

Seguendo il protocollo qui descritto, è possibile impostare un olfattometro per testare il comportamento go/no-go dei topi differenziando tra gli odori. La Figura 6A mostra il comportamento di un topo durante il primo giorno di addestramento nell'attività go/no-go, utilizzando l'acetato di etile come odorante S+ e una combinazione di acetato di etile e acetato di propile come S-. La percentuale di correttezza è calcolata come la percentuale di prove in cui il topo ottiene un successo o un rifiuto corretto. Inizialmente, il topo ha iniziato al 50% corretto perché leccava in risposta a entrambi gli odori. Tuttavia, dopo diverse prove, ha imparato a leccare solo per l'S+ e ha smesso di leccare per l'S-. La Figura 6B mostra la percentuale corretta per l'ultimo giorno dell'attività go/no-go nella direzione in avanti, dove l'animale ha raggiunto la competenza con prestazioni pari o superiori all'80%. A questo punto, gli odorizzanti sono stati invertiti (REV), con l'acetato di etile come odorante S- e la combinazione di acetato di etile e acetato di propile come S+. La Figura 6C mostra la percentuale corretta il primo giorno dell'attività go/no-go nella direzione inversa, dove le prestazioni del mouse sono scese al 10%. F mostra le prestazioni del mouse nell'ultimo giorno di inversione, dove ha nuovamente raggiunto la competenza.

Figura 1: Lato anteriore della lavagna bianca dell'olfattometro e del cablaggio. (A) Le dimensioni dell'olfattometro sono 22" L x 16" A x 8,5" P, mostrate senza cablaggio o schede di interfaccia/lick, come consegnate dall'officina meccanica. I fori sono preforati per valvole per odori, termometri, valvole dell'acqua e finali, siringa dell'acqua, rastrelliera per bottiglie di odori, rastrelliera per valvole di odori e camera del mouse. (B) L'olfattometro preparato con gli 8 bulloni necessari per montare l'SSR48-RACK sul lato posteriore sinistro. (C) Olfattometro con SSR48-RACK montato, compresi i relè collegati. (D) Morsettiere a vite aggiunte all'olfattometro, con sezioni designate per 12 V, 5 V e terra. (E) Scatola nera di controllo con fori praticati per interruttori a pulsante momentanei SPST, con nastro adesivo che etichetta ciascun pulsante tramite il controllo della valvola. (F) Interruttore a pulsante momentaneo SPST con due fili termoretraibili con codice colore saldati per proteggere le aree esposte. (G) Interruttore a pulsante momentaneo SPST montato sulla scatola nera di controllo e fissato con il dado esagonale incluso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Valvole e schemi degli odori. (A) Valvole degli odori montate saldamente nelle fessure e fissate con viti. (B) Schema del cablaggio della valvola degli odori all'SSR48-RACK e alle morsettiere a vite. (C) Schema di cablaggio della scatola nera di controllo, dell'alimentatore, dell'SSR48-RACK e delle morsettiere a vite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Impostazione dell'acqua e della valvola finale con alimentazione. (A) Valvole dell'acqua e finali aggiunte alle apposite fessure dell'olfattometro e fissate con viti. (B) Cablaggio di alimentazione collegato per alimentare l'olfattometro. (C) Cablaggio di alimentazione per SSR48-RACK. (D) Sensore lick con i componenti collegati, inclusi resistori, cavi, LED e amplificatore operazionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sistema di alimentazione dell'aria con flussometri e tubi. (A) Flussometri fissati alla cremagliera con viti. (B) Pompa dell'acquario collegata a un tubo, unita con un giunto a T. (C) Un filtro a carbone con tubo collegato all'uscita, con collegamenti ai singoli regolatori. (D) Tubi dai regolatori collegati agli ingressi del flussometro. (E) Tubo collegato alle uscite del flussometro. (F) Tubo dal collettore all'ingresso finale della valvola. (G) Valvola finale con tubo collegato alla porta dell'odore dell'olfattometro. (H) Siringa da 5 ml riempita d'acqua, tubo collegato a un ago da 18 G. (I) Tubo collegato all'ingresso della valvola dell'acqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Collegamenti finali delle valvole dell'acqua e panoramica del sistema. (A) Tubo dall'uscita della valvola dell'acqua al litimetro nell'olfattometro. (B) Collegamento dell'olfattometro al DIO96H/50 utilizzando un cavo femmina-femmina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Esempio di prestazioni comportamentali in un'attività go/no go per un mouse. Le percentuali di risposte corrette in ogni sessione vengono visualizzate per: (A) Il primo giorno di condizionamento in avanti (S+: 1% acetato di isoamile, S-: olio minerale). (B) L'ultimo giorno di condizionamento in avanti. (C) Il primo giorno dopo l'inversione (S+: olio minerale, S-: 1% di acetato di isoamile). (D) L'ultimo giorno di condizionamento inverso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Andamento del tempo di concentrazione dell'acetato di isoamile nella porta dell'odore. Concentrazione misurata del 10% di acetato di isoamile (diluito in olio minerale) nella porta dell'odore, utilizzando un dispositivo di fotoionizzazione (PID). Le linee verticali indicano l'inizio e la fine dell'erogazione degli odori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In letteratura è disponibile una guida completa passo passo per la costruzione di un olfattometro progettato per compiti di associazione degli odori. I ricercatori possono incontrare varie sfide durante l'assemblaggio e il funzionamento del dispositivo, ma fortunatamente esistono metodi di risoluzione dei problemi consolidati per risolvere questi problemi. Una volta costruito e calibrato correttamente, l'olfattometro funge da strumento inestimabile per gli scienziati che conducono esperimenti relativi all'olfatto, consentendo un controllo e un'erogazione precisi degli stimoli olfattivi.

Passaggi critici
La versione di MATLAB scaricata dovrebbe essere la 2015, poiché il codice scritto è compatibile con questa versione e l'utilizzo di qualsiasi altra versione potrebbe causare problemi. È importante verificare che la scheda corretta sia selezionata in instacall. L'installazione di mcc.dill può essere eseguita eseguendo daqregister('mcc') mentre si è connessi come amministratore MATLAB.

Risoluzione dei problemi
All'inizio di ogni settimana di formazione, eseguire il software di calibrazione (InstaCal) per assicurarsi che il PC e l'olfattometro si interfaccino correttamente. Apri questo programma, fai clic sulla scheda e fai clic su Calibrazione digitale. La portata d'aria deve essere controllata. Il flusso d'aria di fondo deve essere di 2 L/min e il flusso alle fiale di equilibratura degli odori deve essere di 50 mL/min. È estremamente importante controllare regolarmente la portata d'aria all'uscita dell'olfattometro.

Prima di posizionare un mouse, è importante assicurarsi che vengano testati i seguenti parametri: (1) Valvole degli odori: le valvole degli odori devono essere cliccate quando si preme il pulsante sulla scatola nera. Il tubo dell'aria deve bollire nell'olio minerale, senza olio minerale intrappolato nel tubo. (2) Tubo degli odori: se gli odori non producono bolle, il tubo potrebbe essere ostruito nel punto in cui in genere pizzica vicino alla valvola. Potrebbe essere necessaria la sostituzione del tubo. (3) Valvola finale e valvola dell'acqua: la valvola finale deve aprirsi correttamente, con il tubo controllato per il corretto funzionamento. Per la valvola dell'acqua, l'aria che blocca il flusso d'acqua deve essere eliminata, consentendo all'acqua di fluire nel litorale. (4) Flusso d'aria: i misuratori di portata devono apparire calibrati e posizionati in modo appropriato. (5) Luci relè: assicurarsi che le "luci" sui relè si attivino correttamente durante l'esperimento. (6) Relè di ricompensa dell'acqua: Quando viene erogata una ricompensa in acqua, il relè sopra l'acqua dovrebbe lampeggiare mentre eroga la ricompensa. (7) Relè di ricompensa per odori e acqua: quando un odore è abbinato a una ricompensa per l'acqua, il relè rosso sopra il numero di valvola corrispondente dovrebbe lampeggiare in rosso durante la ricompensa.

Limitazioni
L'attività go/no-go verifica la capacità del mouse di testare 2 odori. Per eseguire l'attività, l'animale deve essere sottoposto a diverse sessioni. Questa non è una tecnica ad alto rendimento per testare la discriminazione degli odori. L'olfattometro è progettato per testare gli stimoli olfattivi. Non è un apparecchio di test multisensoriale. Tuttavia, è possibile apportare modifiche per testare altri input sensoriali.

Questo articolo descrive un olfattometro a diluizione liquida in cui l'aria che gorgoglia attraverso l'odorizzante diluito in olio minerale a una velocità di 50 mL/min è pre-bilanciata con il flusso d'aria di fondo a 2 L/min. Per questo design di erogazione dell'odore, la cinetica di diluizione dell'odore nel flusso d'aria del vettore determina la velocità dell'aumento della concentrazione dell'odore nel flusso d'aria di fondo. Come mostrato nella Figura 7, mentre la concentrazione aumenta entro 200 ms fino alla metà della concentrazione finale, la velocità di variazione della concentrazione rallenta oltre il mezzo secondo. Sebbene questa configurazione non produca una variazione a passo quadrato nella concentrazione dell'odore, è stata utilizzata con successo per studiare la discriminazione e il rilevamento degli odori²¹. Se il protocollo sperimentale richiede un cambiamento graduale nella concentrazione dell'odore, il progetto per l'erogazione dell'odorizzante deve essere modificato in tre canali di flusso d'aria di fondo continui da 2 L/min in cui gli odorizzanti vengono erogati continuamente nel flusso d'aria di fondo di due dei canali del flusso d'aria di fondo. Il terzo canale di mandata fornirebbe aria bilanciata con olio minerale. In questo caso, le valvole deviatrici verrebbero utilizzate per deviare uno dei due odorizzanti o l'aria priva di odori nella porta degli odori. Ciò comporterebbe un aumento graduale della concentrazione di odorizzante alla porta dell'odore (anche rapporti precedenti^19,22). Indipendentemente da ciò, è fondamentale documentare il corso temporale per la variazione della concentrazione di odore utilizzando un rivelatore a fotoionizzazione.

L'olfattometro qui descritto è progettato per esperimenti comportamentali sui topi, tuttavia questo design è stato utilizzato in passato per i ratti. La differenza principale è che è necessario aumentare le dimensioni della camera per gli studi con i ratti²³. Infine, questo olfattometro valuta il comportamento olfattivo di un singolo topo. È stato descritto un olfattometro automatizzato ad alta produttività per testare più topi²⁴.

Significato
Questo protocollo descrive un olfattometro su misura, che riduce i costi rispetto ad altri metodi disponibili.

Applicazioni future
L'olfattometro è progettato specificamente per l'uso con i topi e richiede modifiche per l'uso con altri animali, come i ratti. È possibile incorporare anche funzionalità aggiuntive, come un sistema di registrazione multi-elettrodo (ad esempio, una scheda di registrazione multi-elettrodo), una scheda Arduino Uno o una fotocamera.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 1/8’’ modular ic breadboard socket	found on: amazon.com	ASIN ‏: B004MCSOQY	Powers the lights and lick censor
500 piece assorted carbon film resistors 1/4 watt	Found on amazon.com Brand:bojack		Resisters will go on the BreadBoard socket
50k-ohm linear taper potentiometer	Brand:TWTADE Found on: Amazon.com		Allows to the components of the olfactometer Power supply: Ac 220v-6A Shift diameter: 6mm/0.2” Shaft length: 15mm/0.59” mounting thread. Knob size 15/17mm/0.6 x 0.67”(d*H) the adjustment of power
5mm red LED	Found on: Amazon.com Brand:EDGELEC		Pre-wired with built in Resistor; 5mm round top bulb and wired LED's-Easy Connection with 3-6V DC Drive it, 7.9 inch long wires. Wattage: 1 Watts
6 position dual row brrier strip	Found on: Digikey.com	Base Product Number 1546306	Used for power and ground depending on how it is connected Voltage rating:300v Current rating (amps):20A Wire gauge:12-22 AWG
96 high current 50 pin connector female to female	Found on: Amazon.com Brand: ‎IIVVERR	Part Number:‎f5c953ee65a980d	Weight: 109G Pitch:2.54mm Total size: 50x6.4cm/2x2.5 inch
Aquarium pump -AAPA7.8L 125 GPH, 2 OUTLETS 3W	Found on:Amazon.com Brand: Hydrofarm store		This will connect to the double open end cold water housing and will be used to power the air on the machine
Barbed Tee connector polyethylene 1/4”	Found on: Uplastic.com	Item number:62200	Connects different air hoses to each other
Barbed Tee connector polyethylene 3/16”	Found on: Uplastic.com	Item number:62063	Connects different air hoses to each other
BD general use precision glide hypodermic needle 18 G ½	Found on: Medneedles.com	Item number: BD 305195	Used for the water system
Black box/manual control box	Brand:Otdorpatio Found on: Amazon	n/a	Used as the control box Dimensions: 3.94x2.68x1.97
Cable, pc power supply internal connections 10ft	Found on: Amazon.com		Connects to the power supply 40 watts
Cflex tubing, white ¼” id x 3/8” OD	Found on:uplastic.com	Item number:54033	Tubing used in the air system
custom-made white base board with holes to fasten the racks for odor valves, flow meters, SSR48 board	The Machine Shop of the Neurotechnology Center in the CU Anschutz Medical Campus
Diverter valve—miniature inert liquid valve, 3 way	Found on:Radwell.com	Part number:003-0258-900	1/8th BARB 24VDC UP TO 1500 SCCM 4.2W
Double open end cold water housing with blue sump	Found on:GRAINGER.COM BrandPENTAIR/PENTEK	Compatible Mfr. Model Number150295; 150578; 151117; 151118; 151120; 155003; 244043; 244686; 244687
Fisherbrand glass EPA vials	Found on: fishersci.com	Catalog no. 02-912-379	Used for odors
Fitting reducer 1/4” x 1/8”	Found on: uplastic.com	Item number: 64370	Adapter used in the air system hoses.
Hard Tubing, intramedic polyethylene,  0.045 (ID) 1 x 100
High infrared LED	Found on amazon.com Brand: gikfun		Memory clock speed 1mhz
Ic opamp gp 4 circuit 14dip	Found on: Amazon.com Brand:BOJACK		Operating Voltage 50 Volts Maximum Voltage 50 Volts
Jumper wire kit	Found on: Amazon.com Brand:Elegoo		Item Dimensions LxWxH: 0.04 x 8.27 x 0.04 inches
Mini spst momentary switch	Brand:Radioshack Found on: Amazon.com	B000TLWZM6	Used for the odor valves Operating volage: 250V Current rating:1 Amps
Multimeter	Found on Amazon.com Brand:AstroAl		Accurately measures AC/DC Current, AC/DC Voltage, Capacitance, Frequency, Duty Cycle, Resistance, Diode, Continuity and Temperature
Needle nose	Found on:amazon.com Brand:WorkPro		Will be used to bend wires
Odor valves	Found on:Radwell.com	SKU: 192833415 Part number:225T031	Pumps odors from odor vials. 30 PSIG 12 VDC
Phototransistor	Found on: Amazon.com Brand:HILETGO		Voltage: 1.3-1.5V Receive Range: (NM) 400-1000 Head Size: 5mm x 5mm / 0.2" x 0.2"(D*L)
Phototransistor and LED as pair
Pipe adapter 3/4” x 1/4”	Found on: uplastic.com	Item number: 64807	Adapter used in the air system hoses.
Pipe adapter for water housing pump- m ¾ x1/4”	Usplastic.com	Item number: 64807	Temperature range -50f to 275F Maximum pressure: 150psi Weoght 0.0015 lbs
Power supply 12v 30A 360W	Found on: Amazon.com Brand:ALITOVE		the main power source of the machine.  Input Voltage: 220 Volts Output: DC 12V 30A max.
PTFE Tubing	Found on Amazon.com
RITEFLOW FLOWMETERS WITH PLAIN ENDS (UNMOUNTED)	Found on:Globalindustrial.com Model number:t9FB3075514	Item number: H40407-0075	Monitors air flow in the olfactometer 150mm Scale, Size 2 Manufacturers Part Number:H40407-0075
Screw driver	Found on: Amazon.com Brand:Sharden		Used for screws on olfactometer
Shrimk wrap/tubing(various sizes to fir 18-22 gauge wire	Found on: Amazon.com Brand:eventronic		Material:Made of Polyolefin, Shrinkage Ratio:2:1 (will shrink to 1/2 its supplied diameter)
Silicone Tubing 0.030 x 0.065	Found on:Amazon.com Brand:Scientific commodities		Tubing for the odor vials
Solder- with lead	Found on:Uline.com	S-25294	Will be used with the soldering iron
Soldering iron	Found on:Uline.com	Model NO. H-10799	Will be used to solder the Bottons on the control box and other connections
Solid State Relay Module Quad Output – Red	Found on: https://www.sealevel.com/	Part: OB5Q   Model: DC Output QSSR Module	Capacitance: 8 pF Dimensions: 2.4" (L) x 1.1" (W) x 3.1" (H) # of I/O : 4 Outputs Max Line Voltage: 60 VDC Max On-State Current: 3A Minimum Line Voltage: 3 VDC Operating Temperature :-30°C to 80°C (-22°F to 176°F) Output Isolation: 4000 Vrms Storage Temperature: -40°C to 100°C (-40°F to 212°F)
SPST pushbutton switch	Brand:Apiele Found on: Amazon.com	n/a	Used inside of the control box control water valve and final valve. Operating voltage 250v Current rating: 1 Amps, 3 Amps
Ssr-rack 48	Found on:Radwell.com	SKU: 83105002	Processes all the connections of the olfactometer and works with quad-type sooid state relays.
Stainless steel feeding tubes
Tip tinner and cleaner	Found on: Amazon.com Brand:Thermaltronics	Model number: FBA-TMT-TC-2
Valve Ball PVC 1/4” barb buna	Found on: uplastic.com	Item number:62281
water valve	Found on: Ph.parker.com	Part #: 003-0257-900	Pumps water into the chamber Maximum Flow Rate: 1500 sccm Voltage (VDC): 24 Maximum Operating Pressure:50 psi, 3.44 bar
Wire 22awg	Brand:tuofeng Found on: Amazon.com	N/a	Used to wire different components of the olfactometer Material:copper Gauge 30.0
Wire snips	Found on:Amazon.com Brand:Billbotk		Will be used to snip wires
	As Brand: PTFE	Part #036663601452	Use for delivering odorants.
https://medschool.cuanschutz.edu/neurotechnologycenter/Cores/machine-shop