<p class="jove_content"> Whitehead Institute Fellows Fondi </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: ARNA etichettatura: accoppiamento allilico amino dei coloranti </p><ol><li> Aggiungere 1μg dei campioni ARNA in provette da microcentrifuga 1,5 ml. </li><li> Vuoto a secco i campioni a fuoco basso o nullo fino a quando non sono completamente asciutti. Cap ciascun tubo non appena è asciutto - <strong>non asciugare eccessivamente!</strong> </li><li> Aggiungi 9μl buffer di accoppiamento a ciascuna provetta e la ARNA delicatamente su vortex per 1 minuto. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo, e poi lasciare che il campione sedersi sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 22μl di DMSO di alta qualità per ogni tubo di Cy3 o Cy5 colorante. Un tubo di colorante è sufficiente per 2 campioni. Il colorante è Cy3 per etichettare i campioni di riferimento, e il colorante Cy5 è per etichettare i campioni di prova. </li><li> Vortex le tinture per mescolare completamente. Mantenere i coloranti al buio fino al momento dell&#39;uso. Non preparare colorante prima di 1 ora prima dell&#39;uso. Assicurarsi che l&#39;acqua non arriva in tinta / DMSO mix in qualsiasi momento. </li><li> Aggiungere 11μl del preparato DMSO / Cy colorante per ogni campione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza. </li><li> Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 4.5μl hydroxlyamine ad ogni campione di spegnere la reazione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza. </li><li> Incubare per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 2: Labeled ARNA clean-up </p><ol><li> Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente. <strong>(Tabella 1)</strong> </li><li> Mescolare bene nel vortex. </li><li> Aliquote Buffer ARNA eluizione in una provetta 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti. </li><li> Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolante per ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. Il sopranatante deve essere un rosa brillante o un blu brillante a questo punto a causa della molecole di colorante senza personalità giuridica. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 <sup>°</sup> con la soluzione di 100μl Wash ARNA. </li><li> Dopo il 2 <sup>°</sup> lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni! </li><li> Eluire la ARNA dalle perle con l&#39;aggiunta di 20μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra l&#39;agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene il pulito, campioni ARNA etichettati, e dovrebbe essere un rosa pallido o di un azzurro pallido. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop utilizzando il modulo Microarray. </li><li> Immediatamente ibridare l&#39;ARNA etichetta su una piattaforma microarray di vostra scelta, o, in alternativa, è possibile memorizzare l&#39;ARNA etichettati a -80 ° C fino a quando si è pronti per l&#39;ibridazione. </li></ol><p class="jove_step"> Tabella 1 ARNA Mix Binding </p><table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> Perline RNA Binding * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Bead Resuspension * Soluzione </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% isopropanolo ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ARNA Concentrato Binding Buffer </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Mescolare le perline RNA legame con latallone soluzione risospensione prima <br /> ** Aggiungere l&#39;isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA. </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title"> Passaggi critici </p><p class="jove_content"> Quando si esegue l&#39;accoppiamento allilico aminoacidi, è fondamentale per risospendere il colorante in DMSO poco (meno di 1 ora) prima dell&#39;accoppiamento e garantire l&#39;acqua non entra nella tintura / DMSO mix, come si reagisce con il gruppo attivo sul colorante. Non asciugare eccessivamente l&#39;RNA (può essere asciugati fino a 1-2uL piuttosto che completamente asciutto), e risospendere bene nel buffer di accoppiamento. Durante la reazione di accoppiamento, tener...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Contains both Cy3 and Cy5 dyes</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 3

<p class="jove_content">La famiglia<em&gt; Poxviridae</em&gt; È costituito da grandi DNA a doppia elica che contiene virus che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri del<em&gt; Orthopox</em&gt; Genere includono vaiolo, l&#39;agente eziologico del vaiolo umano, vaiolo delle scimmie, e vaccinico (VAC), il membro prototipo della famiglia di virus. All&#39;interno del relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, tre classi di geni sono codificati: precoce, intermedio e in ritardo. Anche se tutte e tre le classi sono trascritte dai virale codifica RNA polimerasi, ogni classe svolge una funzione diversa nel ciclo di vita del virus. Poxvirus utilizzano strategie multiple di modulare l&#39;ambiente host cellulare durante l&#39;infezione. Per capire regolamentazione sia di accoglienza e di espressione genica del virus, abbiamo utilizzato tutto il genoma approcci per analizzare abbondanza trascrizione sia da virus e cellule ospiti. In questo studio dimostriamo infezioni corso a tempo di cellule HeLa con il virus vaccinico e RNA di campionamento in diversi momenti dopo l&#39;infezione. Sia host e virale RNA totale è isolato e amplificato per l&#39;ibridazione di microarray per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica.</p>

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

<p class="jove_content">Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l&#39;espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.</p>

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.