<p class="jove_content"> Whitehead Institute Fellows Funds </p>

<p class="jove_title"> Teil 1: aRNA Etikettierung: Aminosäuren Allyl-Kupplung der Farbstoffe </p><ol><li> Add 1 g der Proben in 1,5 ml aRNA Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Vacuum trocknen die Proben auf geringe oder gar keine Hitze, bis sie vollständig trocken sind. Cap jedes Rohr, sobald es trocken ist - <strong>nicht übertrocknen!</strong> </li><li> Add 9μl Kupplungspuffer zu und die Dynabeads der aRNA durch vorsichtiges Vortexen für 1 Minute. Kurz zentrifugieren, um die Probe in den Boden des Röhrchens zu sammeln, und dann lassen Sie die Probe auf Eis zu sitzen. </li><li> Add 22μl hochwertige DMSO in jedes Röhrchen von Cy3 oder Cy5-Farbstoff. Ein Rohr von Farbstoff ist genug für 2 Proben. Der Cy3-Farbstoff wird zur Kennzeichnung Ihrer Referenzproben und die Cy5 Farbstoff zur Kennzeichnung Ihrer Proben. </li><li> Vortex die Farbstoffe zu durchmischen. Halten Sie die Farbstoffe in der Dunkelheit bis zur Verwendung. Bereiten Sie nicht Farbstoff früher als 1 Stunde vor dem Gebrauch. Achten Sie darauf, kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Fügen Sie 11μl der vorbereiteten DMSO / Cy Farbstoff zu jeder Probe. Gut mischen durch Vortexen sanft. </li><li> Inkubieren für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben mit Alufolie oder halten sie in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu minimieren. </li><li> Nach der Inkubationszeit, fügen 4.5μl hydroxlyamine zu jeder Probe, um die Reaktion zu stillen. Gut mischen durch Vortexen sanft. </li><li> Inkubieren für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben mit Alufolie oder halten sie in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu minimieren. </li></ol><p class="jove_title"> Teil 2: Labeled aRNA clean-up </p><ol><li> Vortex die RNA-Bindung Perlen kurz, um eine gleichmäßige Mischung vor Gebrauch zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie die aRNA Binding Mix bei Raumtemperatur. <strong>(Tabelle 1)</strong> </li><li> Gut mischen durch Vortexen. </li><li> Aliquot die aRNA Elutionspuffer in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten. </li><li> Fügen Sie 70μl der aRNA verbindliche Mix zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal. </li><li> Übertragen Sie die Proben aus der PCR-Platte, eine 96-Well-Rundboden-Platte. </li><li> Add 50 ul 100% Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal. </li><li> Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten gründlich mischen der Proben. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Sie die Platte auf dem Stand, bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. Der Überstand sollte entweder ein helles rosa oder hellblau an dieser Stelle aufgrund der Personengesellschaft Farbstoffmoleküle werden. </li><li> Die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Add 100 &amp;mgr; aRNA Waschlösung in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen können nicht vollständig in diesem Schritt zu zerstreuen. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche ein <sup>2.</sup> Mal mit 100 &amp;mgr; aRNA Waschlösung. </li><li> Nach dem <sup>2.</sup> waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen Proben! </li><li> Eluieren aRNA von den Perlen, indem 20 &amp;mgr; l vorgewärmten aRNA Elutionspuffer zu jeder Probe. </li><li> Kräftig schütteln, die Platte auf dem Schüttler für 3 Minuten, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern. </li><li> Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Der Überstand enthält die aufgeräumt, etikettiert aRNA Proben, und sollte entweder ein hellrosa oder hellblaue werden. </li><li> Sorgfältig Übertragung der eluierten aRNA einen neuen PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen). </li><li> (Optionaler Schritt) Überprüfen Sie die RNA-Konzentration und der Menge an Farbstoff in den Proben durch die Messung 1.5μl auf einem NanoDrop Spektralphotometer mit der Microarray-Modul. </li><li> Unmittelbar hybridisieren die markierten aRNA auf einem Mikroarray-Plattform Ihrer Wahl, oder alternativ können Sie die markierten aRNA bei -80 ° C lagern, bis Sie bereit für die Hybridisierung sind. </li></ol><p class="jove_step"> Tabelle 1 aRNA Binding Mix </p><table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Betrag für 1-Reaktion </td></tr><tr><td> RNA Binding Perlen * </td><td> 10 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> Bead Resuspension Solution * </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% Isopropanol ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> aRNA Binding Buffer Concentrate </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Mix der RNA-Bindung Perlen mit dembead Resuspension Lösung zunächst <br /> ** Fügen Sie das Isopropanol und gut mischen, bevor Sie die aRNA Bindungspuffer konzentrieren. </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title"> Kritische Schritte </p><p class="jove_content"> Bei der Durchführung der Amino-Allyl-Kupplung, ist es entscheidend, um den Farbstoff in DMSO kurz (weniger als 1 Stunde) vor der Kupplung resuspendieren und sicher kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix, wie es mit der aktiven Gruppe auf den Farbstoff reagieren wird. Nicht übertrocknen RNA (kann bis auf 1-2UL anstatt völlig trocken getrocknet werden), und resuspendieren und in dem Bindungspuffer. Während der Kupplungsreaktion, halten Sie die Reaktion in der Dunkelheit, ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Contains both Cy3 and Cy5 dyes</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 3

<p class="jove_content">Die Familie<em&gt; Poxviridae</em&gt; Besteht aus großen doppelsträngigen DNA-Viren enthalten, die ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zellen replizieren. Die Mitglieder des<em&gt; Orthopox</em&gt; Gattung gehören Variola, dem Erreger der menschlichen Pocken, Affenpocken und Vaccinia (VAC), der prototypische Mitglied der Virus-Familie. Innerhalb der relativ groß (~ 200 kb) Vaccinia-Genom gibt drei Klassen von Genen kodiert: frühe, mittlere und spät. Während alle drei Klassen von viral-kodierten RNA-Polymerasen transkribiert werden, dient jede Klasse eine andere Funktion im Lebenszyklus des Virus. Pockenviren nutzen mehrere Strategien zur Modulation der zellulären Umgebung Host während der Infektion. Um Regulierung der Wirt und Virus Genexpression verstehen, müssen wir genomweite Ansätze genutzt werden, um Transkript Fülle von beiden Viren und Wirtszellen zu analysieren. Hier zeigen wir, zeitlicher Verlauf Infektionen von HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus und Sampling-RNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Beide Gastgeber und virale RNA isoliert und verstärkt für die Hybridisierung an Microarrays zur Analyse der Genexpression.</p>

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

<p class="jove_content">Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.</p>

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Aufrufe.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.