Oggi dimostreremo un metodo per lo screening di una libreria peptidica, contro un recettore master scoperto di recente, che è il recettore X2 della proteina G correlato a Mas, noto anche come recettore MRGPRX2. I mastociti sono parte integrante del sistema immunitario e svolgono un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie sia innate che adattative. I mastociti sono attivati dal recettore Fc epsilon R1 legato all'antigene o dal recettore X2 recentemente scoperto.
L'attivazione del recettore X2 legato alla superficie, è stata collegata a diverse malattie immunologiche e infiammate e, quindi, è importante comprendere il meccanismo di legame di questo recettore ai suoi ligandi. Per fare ciò, abbiamo sviluppato una libreria di piccole molecole peptidiche e le abbiamo sottoposte a screening contro i recettori X2 sovra-espressi sull'exis. Nello studio, è stata costruita una libreria di peptidi utilizzando tecniche semplici e versatili di scansione dell'alanina e troncamenti di amminoacidi.
Heck293 dice, esprimendo i recettori X2 quando attivati con i peptidi e l'exis di tipo largo sono stati usati come controllo. Nel troncamento il rilascio all'attivazione è stato monitorato per studiare l'attivazione basata su X2. Sperimentalmente, Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye è eccitato a 340 e 380 nanometri, mentre l'emissione è registrata a 510 nanometri.
Al legame con il calcio, l'intensità di fluorescenza a 340 aumenta, mentre quella di 380 nanometri diminuisce. Il colorante viene quindi depositato al rapporto tra l'intensità di fluorescenza a 340, a quella di 380 nanometri. Il 340 di un rapporto 380, è proporzionale al calcio intracellulare, il valore di esso, può essere calcolato, dall'equazione di Grynkiewicz.
Viene rilevato il rapporto di tabulazione di due intensità di fluorescenza, l'effetto di fattori sperimentali come la diluizione, il fotosciviazione, la perdita di colorante e le densità del profumo. Quindi, senza ulteriori ritardi, iniziamo l'esperimento. Identificare i ligandi del recettore MRGPR X2 dei mastociti, generatore N-troncato, C-troncato e N + C-troncato peptide libreria, troncando gli amminoacidi N-terminale, C-terminale e N + C-terminale della misproctivity pam-12.
Utilizzare la sintesi peptidica in fase solida per sintetizzare i peptidi. Modificare il terminale finale in un gruppo di marea impostato e il terminale C in un gruppo ammide. Generare e alanine può libreria peptidica, sostituendo i rispettivi aminoacidi di pam-12 con Alanina, uno alla volta.
Modificate il terminale finale in un gruppo setide e C-terminale in gruppo ammide. Preparare il terreno di coltura integrando DMEM ad alto contenuto di glucosio, con siero bovino fetale al 10%, due L-Glutammina millimolare, cento unità per ml di penicillina e cento microgrammi, per ml di streptomicina. Oltre alle cellule in tee sue culture traite, 375 palloni di coltura a 37 gradi Celsius, 5% DI CO2, fino a quando non sono dal 75 all'80% confluenti.
Una volta confluente al 75%, lavare le cellule e aggiungere da due a tre ml di Proof-C, per staccare le cellule. Una volta che le cellule si sono staccate, raccogli le cellule in Proof-C. Aggiungere da sei a nove ml di mezzo fresco.
Centrifugare le cellule a 1620g per tre-cinque minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante per raccogliere il pellet. Risuspendare le cellule in terreno di coltura fresco.
Diluire le cellule, secondo la concentrazione desiderata. A 200 microlitri della sospensione cellulare con la concentrazione di 200.000 cellule, versare l'ambon in ogni pozzedo per cercare 40.000 cellule per pozzedo. Custodire le celle per 24 ore nell'incubatore a 37 gradi Celsius, 5% CO2.
Usa il colorante Fura-2 AM per l'esperimento. Aggiungere 50 microlitri DMSO in 50 microgrammi Fura-2 AM, per preparare una soluzione millimolare di colorante Fura-2 AM. Aggiungere un microlitro di un colorante Millimolare Fura-2 AM per ml di mezzo fresco per preparare il mezzo diluente di una concentrazione di colorante micromolare.
Rimuovere la piastra a 96 pozzi dall'incubatore e scartare il mezzo. Sostituire il mezzo con un mezzo diluinte fresco. Aggiungere 200 microlitri di terreno diluinte in ogni pozzo.
Incubare le cellule per 30-40 minuti in 37 gradi Celsius, 5% CO2 incubatore. Mentre le cellule vengono incubate, impostare il lettore di piastre. Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius.
Nelle impostazioni, selezionare Flex. Impostare la modalità di lettura su Fluorescenza e Lettura inferiore. In Lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda su due.
Impostare l'eccitazione su 340 nanometri e 380 nanometri. Impostare l'emissione su 510 nanometri. Lasciare la sensibilità su Predefinito.
In Temporizzazione impostare l'intervallo su 3,9 secondi. Imposta il tempo di esecuzione su 94 secondi per ottenere 25 numeri di letture. Quindi, selezionare il tipo di piastra di analisi.
Quindi, seleziona Wells da leggere. In Trasferimento composto impostare i trasferimenti su uno e Volume iniziale su cento microlitri. Impostare Altezza pipetta su cento microlitri, Volume su 50 microlitri e Punto temporale su 36 secondi per aggiungere il composto e per curare la lettura.
Quindi, selezionare il tipo di piastra Sorgente composta. Lasciare Triturate a non usato. Selezionate il layout Punte e punte pipetta.
Per le colonne composte e punta, il composto verrà trasferito nella colonna uno della piastra composta. Impostate colonna punta su una e colonna composta su una. Lasciare AutoCalibrate su On.Fare clic su OK. Dopo 40 minuti di incubazione, rimuovere il mezzo.
Lavare le celle con il buffer XDB. Aggiungere centinaia di microlitri di buffer XDB per la lettura della fluorescenza. Prendi la piastra per la lettura della fluorescenza.
Quando pritchett ha raggiunto i 37 gradi Celsius, premere la camera di lettura per inserire la piastra di dosaggio nel lettore di piastre di fluorescenza. Premere la sorgente per inserire la piastra composta. Preparare la piastra composta aggiungendo 200 microlitri di peptidi rispettati ionomisina ed EGTA per trasformare le soluzioni X.
Premere il pratt della punta per mettere la casella della punta. Utilizzare la punta nera per evitare l'autofluorescenza della punta. Una volta che le piastre sono state conservate, e se si utilizzano le impostazioni del software e premere Leggi.
Determinare la concentrazione di calcio dal rapporto di fluorescenza mediante l'equazione di Grynkiewicz. Vengono mostrati i dati di fluorescenza del peptide pam good. Come si può vedere, dopo l'aggiunta di peptidi a 36 secondi, la fluorescenza a 340 nanometri che è più tiepida aumenta di quella di 380 nanometri record diminuisce.
I dati sono rappresentati come il rapporto di 340, a quello del segnale 380. Mostrano dei segnali aumenta dopo l'aggiunta di peptidi. Questa cifra è il dato rappresentativo per un peptide attivante.
La Figura A mostra i segnali di fluorescenza per un peptide attivante. I dati rappresentativi corrispondono a cram12 Il peptide è stato aggiunto dopo aver creato una linea di base per i cicli di gara, come mostrato dall'ado. La figura B mostra il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo l'eccitazione a 340 nanometri, a quella dell'emissione di fluorescenza dopo l'eccitazione a 380 nanometri.
Questa cifra è il dato rappresentativo per lo spazio vuoto. La figura A mostra i segnali di fluorescenza per il bianco. L'HTB è stato aggiunto dopo aver diluito una linea di base per 10 cicli di alimentazione, come mostrato dall'ado.
La figura B mostra la razione dell'emissione di fluorescenza dopo l'eccitazione a 340 nanometri a quella dell'emissione di florescenza dopo l'eccitazione a 380 nanometri. Questa cifra è il dato rappresentativo per gli standard per la calibrazione del colorante. La figura A mostra che la ionomicina è stata aggiunta alla 10a lettura, come mostrato dall'ado per ottenere la massima fluorescenza nello stato legato al cashem.
EGPA Triton X cento è stato aggiunto dopo 20 letture come mostrato dall'ado che ottiene il segnale minimo. La figura B mostra il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo l'eccitazione a 340 nanometri e quella dell'emissione di fluorescenza dopo l'eccitazione a 380 nanometri. Questi valori vengono ulteriormente inseriti nell'equazione di Grynkiewicz per ottenere la cache intracellulare della concentrazione.
Questa figura mostra la caratterizzazione di un peptide rappresentativo per confermare la sequenza e la purezza. La figura A mostra che la massa verticale della sequenza peptidica rappresentativa WNK WAL è stata 857,90 diradamento del colorante. Che è mostrato dal rapporto N su Zed nella spettroscopia di massa.
La figura B mostra una purezza peptidica del 99% come confermato dall'HPLC. Questo peptide appartiene alla libreria peptidica N+C-troncata. In conclusione, il metodo qui descritto è un metodo facile e versatile che può essere efficiente e luminoso per l'ultimo screening a base di calcio in scala.
Tuttavia, ci sono diversi fattori che determinano la qualità dei dati e, quindi, la composizione deve essere ottimizzata per un determinato sistema di strumenti cellulari. Grazie.
