Ringraziamo il Dott. Nicola Wiethölter per la preparazione e colorazione di 1-D gel. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e sostenuto da una borsa di ricerca dal Manchot Jürgen Stiftung di ND.

Parte 1: bidimensionale (2-D), elettroforesi su gel con coppa di carico <ol><li> IPG-strip reidratazione e concentrandosi isoelettrico (IEF) <ul><li> Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) in 125 microlitri soluzione di reidratazione [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] usa il cassetto Immobiline DryStrip Reswelling per almeno 10 ore. </li><li> Sciogliere campione precipitato proteine ​​in un tampone campione IEF [7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] corrispondente a 60-100 mg di proteine ​​per 100 l . </li><li> Dopo solubilizzazione (almeno 30 minuti a temperatura ambiente), si applicano campione di proteine ​​tramite anodica coppa carico con coppe campioni. Il volume della tazza è 100 l (tazze Collettore permette fino a 150 microlitri). Nota: è possibile caricare quantità di campione più grande se si inserisce una bassa tensione passo all&#39;inizio del protocollo di messa a fuoco e riempire le tazze mentre c&#39;è ancora un film liquido nella tazza! </li><li> Eseguire isoelettrofocusing per 11,1 KVH in modalità gradiente nell&#39;Unità Multiphor elettroforesi II. </li></ul></li><li> Equilibrazione e SDS-PAGE <ul><li> Dopo IEF, le strisce IPG sono stati sottoposti a riduzione e alchilazione, ogni volta 15 minuti su uno shaker, con l&#39;1% e al 2,5% ditiotreitolo Iodoacetamide rispettivamente in soluzione di equilibrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M urea, 30% glicerolo e il 2% SDS]. </li><li> Lavare le strisce equilibrata con H 2 O e asciugare su carta Whatman loro di rimuovere il tampone in eccesso equilibrio. Successivamente immergere le strisce in SDS-running buffer (1X). </li><li> Seconda dimensione è effettuata mediante SDS-PAGE su sistemi di elettroforesi verticale con una concentrazione di acrilamide totale di 12%. Le strisce IPG equilibrati sono stati collocati sulla parte superiore del gel di separazione e fissato con una soluzione calda agarosio [0,5% di agarosio nella gestione di tampone contenente bromofenolo blu]. </li><li> Le proteine ​​sono state separate per 2,5 ore, a partire da 80 V per 15 minuti seguito da 120 V fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo della cassetta gel. </li></ul></li></ol> Parte 2: colorazione Coomassie Colloidale con CBB G-250 1. Soluzioni coloranti Nota: per la preparazione delle soluzioni colorazione, usare prodotti chimici di alta qualità come puri per analisi (pa) e di acqua di elevata purezza, come si ottiene da sistemi Millipore (Milli-Q acqua). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie soluzione: </td><td> AD 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> solfato di alluminio (14-18)-idrato </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanolo (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> Acido ortofosforico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Nota: per la preparazione della soluzione colorante, l&#39;aggiunta sequenziale dei componenti nel seguente ordine deve essere mantenuta: <ol><li> prima sciogliere solfato di alluminio in acqua Milli-Q </li><li> successivamente aggiungere etanolo, omogeneizzare e miscelare CBB G-250 alla soluzione </li><li> di recente, la soluzione è completamente sciolto, aggiungere l&#39;acido fosforico (l&#39;incorporazione dell&#39;acido ai media alcolica lascia le molecole si aggregano in Coomassie loro stato colloidale) </li><li> infine si riempiono di acqua Milli-Q </li></ol> Nota: la soluzione finale ha una colorazione verde scuro-bluastro aspetto ed è piena di particelle di nuoto in giro: <ul><li> Non filtrato questa soluzione! </li><li> Se hai cambiato l&#39;ordine di preparazione, si otterrebbe una soluzione più violetto-bluastro che è meno sensibile. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Decolorazione soluzione: </td><td> AD 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanolo (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> Acido ortofosforico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Procedura di colorazione <ul><li> Dopo la separazione seconda dimensione, rimuovere con attenzione i gel dalle lastre di vetro e trasferirli in un piatto colorazione piena di acqua Milli-Q. </li><li> Lavare il gel tre volte con acqua Milli-Q per 10 minuti su un agitatore orizzontale (lavaggio insufficiente provoca scarsa sensibilità perché il restante SDS sul gel disturba la delimitazione del colorante alle proteine). </li><li> Agitare la soluzione di Coomassie prima dell&#39;uso per disperdere le particelle colloidali in modo uniforme. </li><li> Incubare il gel ben coperto con la soluzione di Coomassie di agitazione su un agitatore per 2-12 ore. Questo genera colorazione di fondo marginali in modo da poter osservare i progressi colorazione in mezzo. Nota: dopo 10 minuti si possono vedere macchie di proteine ​​prima apparizione, entro 2 ore di incubazione di circa l&#39;80% colorazione ad essolivello massimo s è stato completato. Per quasi 100 colorazione%, notte di incubazione è raccomandato. In alcuni casi, quando la quantità di proteine ​​ad essere macchiato è enorme e la soluzione si trasforma in un azzurro brillante, un aggiornamento della soluzione di colorazione è necessario. </li><li> Dopo la procedura di colorazione Coomassie rimuovere la soluzione e sciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q. Nota: è possibile riutilizzare la soluzione colorante fino a quando le particelle sono ancora presenti, altrimenti scartare (tenere a mente che il vostro laboratorio può avere norme speciali per lo smaltimento dei rifiuti). </li><li> Rimuovere attaccare le particelle del colorante dal piatto colorazione con un panno privo di tovagliolo di carta e Decolorare per 10 - 60 minuti. Nota: è anche possibile lavare il gel solo con acqua Milli-Q, ma questo si consiglia solo per preparativa gel perché durerà un irregolare, debole film di Coomassie il gel che si presentano durante la procedura di scansione. </li><li> Infine risciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q: il gel raggiungeranno il loro spessore originale (l&#39;alcool-acido multimediali rende la contrazione gel) e neutralizzazione in acqua aumenta ulteriormente l&#39;intensità del colore di Coomassie. </li></ul> Parte 3: I risultati rappresentativi Se si segue il protocollo sopra descritto si ottengono sul 2-D gel distintivi risolto e ben colorati macchie scure proteina blu. Anche rispetto ad un 2-D gel colorato con l&#39;argento secondo Shevchenko et al. 5, un protocollo sostenendo buona sensibilità e la compatibilità con la spettrometria di massa, otteniamo risultati della colorazione uguale. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: risultato finale della sperimentazione di cui sopra. Kang Coomassie protocollo (A) esegue con forza come la colorazione argento secondo Shevchenko et al. (B) a individuare le proteine ​​dopo 2-D elettroforesi su gel. Parte 4: Suggerimenti <ul><li> Eseguire alcune colorazioni di prova prima di elaborare i propri campioni. Per motivi inspiegabili abbiamo riportato qualche volta che una proteina di interesse non è stato possibile rilevare con successo anche quando milligrammi sono state applicate. In questo caso si consiglia di preparare alcune serie di diluizioni per testare la sensibilità. </li><li> Se avete a basso contenuto di gel di rilevazione della proteina (s) in generale, il trasferimento senza successo dal accatastamento al gel di separazione durante la SDS-PAGE sarà eventualmente il motivo. È possibile verificare tali proteine ​​adesive dalla colorazione il gel compresa l&#39;area di sovrapposizione. </li><li> Per una rapida verifica dei risultati isoelettrofocusing, è possibile direttamente macchiare la IPG-strip senza alcun ulteriore separazione seconda dimensione. </li><li> Di tanto in tanto girare il gel durante la procedura di colorazione in modo che siano macchiati uniformemente da entrambi i lati (se si mantiene il gel immobile, il colorante si lega solo per una parte del gel). </li><li> Abbiamo sperimentato che lo stoccaggio della soluzione colorante in una bottiglia scura aumenta la sua durata (in bottiglia trasparente fino a 4 mesi). </li><li> Dopo la colorazione e la documentazione è possibile mantenere il gel in frigorifero per diversi anni (se si aggiunge soluzione acida di evitare contaminazioni da funghi). </li><li> Decolorazione di spine gel per un trittico digerire può essere accelerata dal riscaldamento in un riscaldatore blocco. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Innovativi o solo un altro protocollo Coomassie? Al momento esistono diversi protocolli per le procedure di colorazione con Coomassie Brilliant Blue. La maggior parte di loro il risultato di modifiche minori o maggiori di uno dei protocolli più comunemente utilizzati dai Neuhoff e colleghi 2. Anche il protocollo di Kang basato sulla formula di Neuhoff. Ma è davvero un&#39;alternativa metodo di colorazione Coomassie per la ricerca proteomica? Noi immagine due questioni principali...

<table border="1" ><tr><td> Nome del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Catalogo No. </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Per IEF e SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip gel </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Può essere utilizzato anche 2 anni dopo la data di scadenza. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling Vassoio </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Non pulire con solventi organici. Progettato per 7-18 centimetri IPG-strisce. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Include un vassoio di elettrodi, portaelettrodi, anodo e catodo, allineatore e coppa campioni bar e coppe campioni. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL Alimentazione </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Forniture di tensione fino a 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II elettroforesi Unità </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Elettrodi mobili consentono IEF in strisce IPG di ogni lunghezza (7-24 centimetri IPG strisce) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel sistema Doppia S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel formato. Gel da camera comprende un sistema di raffreddamento. </td></tr><tr><td> Per colloidale Coomassie G-250 colorazione: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> colorazione piatti con coperchi </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Adatto per mini-gel. Sovrapposte a shaker. </td></tr><tr><td> solfato di alluminio-18-idrato </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Abbiamo fatto migliore esperienza con Merck. Appena disponibile in 5 pacchetti kg. </td></tr><tr><td> ortofosforico </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Venduto in bottiglie di vetro. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine ​​separate mediante SDS-PAGE, offrendo una procedura semplice colorazione e quantificazione alto. Inoltre, è completamente compatibile con l&#39;identificazione delle proteine ​​spettrometria di massa. Ma nonostante questi vantaggi, CBB è considerato essere meno sensibile di colorazioni argento o fluorescenza e quindi raramente utilizzato per la rilevazione di proteine ​​in gel analitici approcci basati sulla proteomica. Diversi miglioramenti del protocollo originale Coomassie 1 sono stati fatti per aumentare la sensibilità della CBB. Due importanti modifiche sono state introdotte per migliorare la rilevazione di proteine ​​a bassa abbondanza convertendo le molecole di colorante in particelle colloidali: Nel 1988, Neuhoff e colleghi hanno applicato il 20% metanolo e concentrazioni più elevate di solfato di ammonio nel G-250 CBB soluzione colorante a base 2, e nel 2004 Candiano et al. stabilito Blue Silver con CBB G-250 con acido fosforico in presenza di solfato di ammonio e metanolo 3. Tuttavia, tutte queste modifiche solo permettono una rilevazione di circa 10 proteine ​​ng. Un protocollo ampiamente fameless per la colorazione Coomassie colloidale è stato pubblicato da Kang et al. Nel 2002 dove si è modificato Neuhoff colloidale protocollo di colorazione CBB per quanto riguarda le sostanze complessanti. Invece di solfato di ammonio hanno usato solfato di alluminio e il metanolo è stato sostituito dal 4 etanolo meno tossici. Il romanzo a base di alluminio colorazione in studio Kang ha dimostrato una sensibilità superiore che rileva fino a 1 ng / banda (fosforilasi b) con variazione scarsa sensibilità in funzione delle proteine. In questo studio dimostriamo applicazione del protocollo di Kang per una rapida e sensibile colorazione Coomassie colloidale di proteine ​​per scopi di analisi. Ci illustrerà il protocollo veloce e semplice utilizzando bidimensionali gel eseguita di routine nel nostro gruppo di lavoro.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Per la rilevazione di media 4 ng proteine ​​in gel. La colorazione è completata entro 2 ore e senza alcuno sforzo. Noi abitualmente utilizzano il protocollo di Kang per scopi di analisi in gel a base di proteomica.

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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40.0K Views.  University Duesseldorf. Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang Et al. Per la rilevazione di media 4 ng proteine ​​in gel. La colorazione è completata entro 2 ore e senza alcuno sforzo. Noi abitualmente utilizzano il protocollo di Kang per scopi di analisi in gel a base di proteomica.

Video: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Colorazione proteine ​​in gel

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Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Sviluppo di una striscia reattiva Immunocromatografico oro colloidale-based per il rilevamento di Cetacei mioglobina

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

Rilevazione di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione dell'argento

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine in gel di poliacrilammide