Questo lavoro è stato supportato dal NIH e PKD fondazione a ZS. Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte in base a Yale Animal Resources Center (Yarc) e cura degli animali istituzionali e Usa Committee (IACUC) le linee guida.

Parte 1: Preparazione di micropipette, e piatti da camera microiniezione <ol><li> Fabbricare micropipette da riscaldamento e tirando tubi in vetro borosilicato capillari (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) in un dispositivo estrattore micropipetta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Conservare in una capsula di Petri in cima alla piccola quantità di argilla o di nastro adesivo. </li><li> Versare 1,5% agarosio (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) a 1x piatti medio E3 stampato con depressioni a forma di cuneo che servirà come un metodo semplice per tenere gli embrioni durante l&#39;iniezione (come descritto in &#39;Il libro Zebrafish &quot;) 1. Lasciate piastre di agar camera di solidificare prima dell&#39;uso e conservare a 4 ° C. </li></ol> Parte 2: Preparazione di RNA Un approccio potente per gli studi la funzione del gene è quello di microinject in vitro l&#39;RNA trascritto ricoperto in embrioni di zebrafish. Capped RNA si comporta in modo simile a mRNA eucariotici presenti in vivo per la presenza della analogico PAC. Zebrafish ricercatori utilizzano abitualmente questo metodo per iperespressione o misexpress loro gene di interesse. In questa dimostrazione, ci sarà uno microinject EGFP-tagged trascrizione e l&#39;uso dal vivo tutto-embrione GFP-espressione come una lettura visibile per una iniezione di successo. <ol><li> Eseguire un reazione in vitro la trascrizione dell&#39;RNA PAC sul tuo trascrizione di interesse. Nel nostro laboratorio, abbiamo routine inserire un cDNA di interesse in un vettore pCS2 + ed eseguire un reazione di sintesi in vitro di grandi quantità di RNA ricoperto utilizzando la mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purificare il campione di RNA mediante l&#39;esecuzione attraverso il kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc., 74104) o fenolo: estrazione con cloroformio e precipitazione isopropanolo. </li><li> Accuratamente determinare la concentrazione del preparato RNA e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. </li><li> Il giorno della iniezione, scongelare il campione di RNA, vortice leggermente e spin down brevemente. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro con acqua sterile e una concentrazione finale di 0,025-0,050% rosso fenolo (Sigma-Aldrich, P0290). Rosso fenolo serve come marcatore visibile per l&#39;iniezione della soluzione in embrione. In questo articolo, si prepara una soluzione di lavoro di 100 ng / uL mRNA EGFP con il 0,050% rosso fenolo. </li><li> Tenere campione lavorando su ghiaccio e rendimenti azionari RNA a -80 ° C. </li><li> Procedere alla parte 4 quando è pronto per iniettare questo esempio. </li></ol> Parte 3: Preparazione del morfolino Morfolino oligonucleotidi antisenso sono ampiamente utilizzati per modificare l&#39;espressione genica, bloccando la traduzione di una proteina bersaglio o modificando pre-mRNA splicing 2,3. Morpholinos nel zebrafish servire come un potente strumento di genetica inversa abbattendo la funzione del gene. In questo articolo, ci sarà uno microinject oligo morfolino mirato al sito di inizio traslazionale di PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Sulla base di lavoro stabiliti in precedenza, ci aspettiamo che gli embrioni iniettati per imitare fenotipicamente PKD2 4 mutanti di pesce. <ol><li> Noi di routine per 300 nmol di un oligo morfolino specificamente progettato per un gene di interesse da Strumenti Gene, LLC (Philomath, OR). </li><li> Aggiungere 100 uL di acqua sterile per ottenere un 3 soluzione madre mM. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. </li><li> Il giorno della iniezione, riscaldare la soluzione morfolino a 65 ° C per 5 minuti. Scatto raffreddare su ghiaccio immediatamente e spin brevemente. Questo passo denatura le strutture secondarie nella oligo e assicura che la soluzione è completamente solubilizzato. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro diluendo la soluzione morfolino in acqua sterile e una concentrazione finale di 0,025-0,050% rosso fenolo. In questa dimostrazione, ci prepareremo una soluzione di lavoro di 0,50 mm PKD2 morfolino con il 0,050% rosso fenolo. </li><li> Continuare a lavorare soluzione a temperatura ambiente. </li><li> Procedere alla parte 4 quando è pronto per iniettare il campione .---- </li></ol> Parte 4: Riempimento della micropipetta con la soluzione di lavoro <ol><li> Tagliare la punta distale di una micropipetta con una pinza o una lametta chirurgico per creare un&#39;apertura che è appena visibile sotto un microscopio da dissezione (Nikon Instruments, Inc., SM2645) con ingrandimento 50X. </li><li> Posto 2 uL della soluzione di lavoro come una goccia su un vetrino. </li><li> Fissare il retro di una micropipetta di una siringa da 5 ml dotato di tubi su un ago ipodermico e leggermente immergere la punta distale del micropipetta nella tua goccia di soluzione di lavoro. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta. </li><li> Sifone la soluzione di lavoro attraverso l&#39;estremità distale del micropipetta tirando lo stantuffo della siringa. </li></ol> Parte 5: Calibrazione del volume di iniezione micropipetta <ol><li> Mettere una goccia di olio minerale (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) su un vetrino micrometrico (FiSher, 12-561-SM1). </li><li> Accendere e alimentazione di aria alla pressione pulsata micro-apparato iniettore (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Fissare la micropipetta al titolare micropipetta dell&#39;apparato micro iniettore. L&#39;iniettore è micro pressione regolata e scarichi vengono attivate premendo il pedale. </li><li> Sotto il microscopio dissezione, verificare il volume di iniezione utilizzando l&#39;iniettore micro posto una goccia di soluzione di lavoro sul petrolio micrometro. Misurare il diametro della goccia in quanto galleggia come una sfera sulla parte superiore del petrolio. </li><li> Regolare la durata e la pressione di iniezione di calibrare con attenzione il volume di iniezione. Questa fase aiuta la riproducibilità dell&#39;esperimento microiniezione. In questa dimostrazione, tutte le microiniezioni sarà fatto con un diametro calo di 0,15 mm (circa 1,76 nL in volume). </li><li> Una volta che il volume di iniezione è stata calibrata, utilizzare la manopola &quot;Hold&quot; sulla micro iniettore per prevenire il riempimento e la fuoriuscita della micropipetta. </li></ol> Parte 6: Preparazione di embrioni di zebrafish fecondate per microiniezione <ol><li> Zebrafish in modo casuale compagno nelle prime ore di ogni mattina. Raccogliere embrioni a 1-cellula stadio e metterli in 1x medio E3. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento 3 ml (Becton Dickinson mediche di laboratorio, 357.524), organizzare gli embrioni lungo le depressioni a forma di cuneo in lastre camera di microiniezione. </li><li> Rimuovere il supporto in modo che gli embrioni sono superficialmente sommerse e non allagata. Questa fase aiuta a risolvere gli embrioni al fondo del depressioni così come nella penetrazione del corion dalla micropipetta. </li></ol> Parte 7: Microiniezione attraverso il corion <ol><li> Manipolare gli embrioni con la micropipetta in modo che il citoplasma della cellula embrionale 1-fase è visibile sotto il microscopio da dissezione. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta. </li><li> Penetrare il corion e poi il tuorlo con la micropipetta per iniettare l&#39;embrione. In questa dimostrazione, ci sarà la prima microinjecting nel tuorlo direttamente sotto la cella, e permettono il flusso citoplasmatico e diffusione di portare la soluzione di lavoro all&#39;interno della cellula. Questo flusso è visibile a causa del rosso fenolo aggiunto alla soluzione di lavoro. </li><li> Ci sarà anche dimostrare l&#39;iniezione diretta nel citoplasma cellulare. Microiniezione diretta nella cella è più robusto, ma in termini di tempo l&#39;orientamento corretto embrione e la tecnica microiniezione è richiesto. Come la membrana cellulare è più rigoroso rispetto della membrana tuorlo, è spesso più veloce per entrare nel micropipetta attraverso il tuorlo per raggiungere il citoplasma della cellula. Orientando il polo animale verso il fondo della vasca e di lavoro con mano ferma può aiutare in questo metodo di iniezione. </li><li> Dopo la microiniezione, luogo gli embrioni in una capsula di Petri con media E3 e incubare loro a 28,5 ° C per il normale sviluppo. </li><li> Nelle prossime ore e giorni diversi dello sviluppo embrionale, osservare gli embrioni per la fenotipi di interesse. </li></ol> Parte 8: I risultati rappresentativi EGFP mRNA iperespressione: Per verificare il successo della microiniezione, che monitorerà l&#39;espressione della GFP in embrioni di sviluppo a partire fase scudo (~ 6 HPF) dal vivo in tutto-embrione microscopia a fluorescenza (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Espressione del costrutto è più forte durante gli eventi precoci dello sviluppo embrionale e spesso diminuiscono nel corso dello sviluppo come l&#39;iniezione di RNA è ricoperto a poco a poco degradato e dipende dalla stabilità della proteina espressa. PKD2 traslazionale-blocking morfolino: Sulla base dei risultati precedentemente pubblicato, ci aspettiamo che il PKD2 morphants per imitare la curvatura dorsale asse del corpo come si trova nel PKD2 zebrafish mutanti e cisti renali presenti a circa 2-3 dpf 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: i risultati Rappresentante microiniezione di mRNA EGFP e PKD2 agosto morfolino. (A) gli embrioni sono stati TAB microiniettati a 1-cellula palco con 0,17 ng di mRNA EGFP e visualizzati a 1 dpf per l&#39;espressione in vivo GFP. (B, c) gli embrioni sono stati TAB microiniettati a 1-cellula palco con ~ 1.7 nl di un PKD2 traslazionale morfolino blocco a 0,50 mm e ha segnato per la curvatura dorsale del corpo a 4 dpf.

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	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Microiniezione in embrioni di zebrafish è una tecnica consolidata e robusta per esplorare il ruolo di un particolare gene nello sviluppo. Le applicazioni includono l&#39;iperespressione, misexpression e saggi knockdown del gene di interesse così come l&#39;analisi epistatico fra più geni. Microiniezione in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per la generazione di animali transgenici, e mappatura destino delle cellule ai primi embrioni blastula 5,6,7,8,9. Inoltre, l&#39;applicazione di questa tecnica s...

Tutti gli altri materiali sono elencati nel protocollo.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Uno strumento essenziale per indagare il ruolo di un gene durante lo sviluppo è la capacità di eseguire knockdown gene, l&#39;iperespressione, e gli studi misexpression. In zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), La microiniezione di RNA, DNA, proteine, oligonucleotidi antisenso e di altre piccole molecole in sviluppo dell&#39;embrione fornisce ai ricercatori un test rapido e affidabile per esplorare la funzione del gene<em&gt; In vivo</em&gt;. In questo video-articolo, mostreremo come preparare e microinject<em&gt; In vitro</em&gt; Sintetizzato EGFP mRNA e una traslazione di blocco morfolino oligo contro<em&gt; PKD2</em&gt;, Un gene associato a malattia autosomica dominante del rene policistico (ADPKD), in 1 a cellule di embrioni fase zebrafish. Ci sarà quindi analizzare il successo del mRNA e microiniezioni morfolino verificando espressione GFP e analisi fenotipo. Vaste applicazioni di questa tecnica sono la generazione degli animali transgenici e la linea germinale chimere, cellule destino mappatura e lo screening del gene. Qui descriviamo un protocollo per la sovraespressione di EGFP e knockdown di<em&gt; PKD2</em&gt; Di mRNA e l&#39;iniezione oligonucleotide morfolino.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l&#39;introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l&#39;esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K Views.  Yale University School of Medicine. Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Video: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.