Parte 1: Estrazione di RNA totale usando il reagente TRIzol Quando si lavora con l&#39;RNA è molto importante lavorare in un ambiente che sia privo di RNasi. Semplici precauzioni come avere pipette riservati per l&#39;utilizzo solo con le procedure di RNA e spruzzare l&#39;area di lavoro con un reagente decontaminante (ad esempio, RNAse Away) prima di iniziare la procedura sono molto utili. <ol><li> Per ottenere una sufficiente quantità di RNA piscina 50 embrioni di pesce zebra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere l&#39;acqua il più possibile con una pipetta. </li><li> Immediatamente si aggiungano 250 microlitri di reagente TRIzol 1 alla provetta da microcentrifuga contenente gli embrioni. Reagente TRIzol contiene fenolo e dovrebbe essere usato solo sotto una cappa aspirante. </li><li> Lyse e omogeneizzare gli embrioni con un pestello di pellet (circa 20 colpi) fino a quando il tessuto è sufficientemente perturbato. </li><li> Quando le cellule sono sufficientemente omogeneo, aggiungere 750 microlitri di reagente TRIzol pari a un volume totale di 1 ml. </li><li> Per consentire completa dissociazione dei complessi nucleoproteina, incubare campioni omogeneizzati per 5 minuti a temperatura ambiente. In questa fase, il campione può essere istantaneamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C o il protocollo può essere continuato. </li><li> Per continuare ad aggiungere 0,2 ml di cloroformio e rock il tubo per 15 secondi per mescolare. </li><li> Incubare il campione per 2 minuti a temperatura ambiente e poi centrifugare a 12000 xg per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> La miscela si separa in basso un rosso fenolo-cloroformio fase, un interfase, e una fase superiore acquosa incolore. La fase superiore acquosa contenente l&#39;RNA. Lo strato superiore dovrebbe comprendere di circa il 60% del volume iniziale di TRIzol (circa 0,6 ml). Trasferire lo strato superiore acquoso in una provetta per microcentrifuga con una nuova pipetta da 1 ml, facendo attenzione a non trasferire dello strato di interfase. </li><li> Per precipitare l&#39;RNA aggiungere 0,5 ml di isopropanolo. </li><li> Lasciare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi si centrifuga il campione a 12.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. L&#39;RNA si forma un gel simile a pellet sul fondo della provetta. </li><li> Senza disturbare il pellet, rimuovere il surnatante con una pipetta e lavare il pellet in 1 ml di etanolo al 75%. Mescolare il campione capovolgendo delicatamente e centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere l&#39;etanolo con una pipetta e lasciare campione asciutto mentre invertita per 10 minuti. </li><li> Risospendere il pellet aggiungendo 100 ml di acqua senza RNasi e incubare il campione a 55 ° C per 10 minuti. Si raccomanda di dito vortice di frequente durante l&#39;incubazione per aiutare nella reidratazione RNA. Opzionalmente, è possibile verificare la qualità e la quantità del campione utilizzando un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro o direttamente passare alla fase successiva. </li></ol> Parte 2: RNA di pulizia con il Qiagen RNeasy Mini Kit Il Qiagen RNeasy Mini Kit 2 è utile nella rimozione di contaminanti e le impurità da un campione di RNA isolato da altri metodi. Per questa procedura, β-mercaptoetanolo, etanolo ed acqua priva di nucleasi sono necessari in aggiunta ai componenti inclusi nel kit. Un trattamento opzionale DNAsi è consigliato durante questa procedura. <ol><li> Al primo utilizzo del kit, Buffer RPE dovranno essere preparati con l&#39;aggiunta di 4 volumi di etanolo 100% per 1 volume di Buffer RPE. </li><li> Il giorno della procedura, buffer RLT dovrà essere preparato fresco. Calcolare la quantità totale di RLT tampone che saranno necessarie. Un volume di 350 microlitri è necessaria per campione. Per preparare RLT tampone, aggiungere 10 ml di β-mercaptoetanolo per ogni 1 ml di tampone. Questo dovrebbe essere fatto sotto la cappa. </li><li> Per ogni campione aggiungere 350 ml di RLT tampone e 250 ml di etanolo al 100%. Mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Trasferire il campione, che dovrebbe essere di circa 700 microlitri, in una colonna RNeasy che è posto in un tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 8000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Dopo centrifugazione, scartare il flusso attraverso e aggiungere 700 ml di tampone RW1 a una colonna di spin RNeasy. </li><li> Centrifugare il campione a 8000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente e poi scarta il flusso attraverso. </li><li> Trattamento con DNAsi Qiagen RNasi-free DNAse Kit: DNAsi trattamento è facoltativo, ma è altamente consigliato per i campioni di più alta qualità. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> La prima volta che riceve il kit di trattamento DNAsi, è necessario preparare il brodo DNAsi I soluzione con l&#39;aggiunta di 550 microlitri acqua priva di nucleasi alla DNAsi. Mescolare delicatamente per inversione e non vortice. Aliquota in fiale monouso contenenti 10 ml di soluzione di riserva. È possibile memorizzare soluzione di riserva a -20 ° C per un massimo di 9 mesi. Le aliquote scongelato può essere conservato a 4 ° C per 6 settimane, se necessario, ma non ricongelare le aliquote dopo lo scongelamento. </li><li> Per preparare l&#39;incubazione DNAsi impasto aggiungere 70 microlitri Buffer RDD a 10 microlitri DNAsi I ssoluzione tac per campione. Mescolare delicatamente per inversione e provetta leggermente per raccogliere il residuo forma liquida i lati del tubo. Aggiungere 80 microlitri DNAsi mix di incubazione io direttamente alla colonna di spin RNeasy. Incubare il trattamento DNAsi per 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Dopo il trattamento DNAsi aggiungere 350 microlitri RW1 Buffer alla colonna di girare e centrifugare a 8000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione eliminare il flusso attraverso e aggiungere 500 microlitri RPE Buffer alla colonna. Incubare campione per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare campione a 8000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il flusso attraverso. </li><li> Dopo la centrifugazione aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% alla colonna di spin. </li><li> Ripetere centrifugazione a 8.000 xg, ma per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione eliminare il flusso attraverso la colonna e permettere ad asciugare per 5 minuti. </li><li> Immediatamente centrifugare a 8.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente di togliere qualunque sinistra su tracce di etanolo. </li><li> Dopo la centrifugazione è il trasferimento completo della colonna girare in un nuovo tubo di 1,5 ml di raccolta e aggiungere 10 microlitri acqua priva di nucleasi. Incubare per 1 minuto, quindi si centrifuga a 10.000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. L&#39;RNA sarà il flusso attraverso. </li><li> Aggiungere un altro 10 microlitri di acqua priva di nucleasi alla colonna di spin e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Centrifugare campione a 10.000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione rimuovere ed eliminare la colonna. L&#39;RNA sarà il flusso attraverso. </li><li> Controllare la quantità e la qualità del RNA utilizzando un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Inoltre, eseguire un gel denaturante o utilizzare un Agilent 2100 Bioanalyzer per verificare l&#39;integrità del RNA. </li><li> I campioni devono essere conservati a -80 ° C fino a quando la sintesi del DNA può essere eseguita. </li></ol> Parte 3: Sintesi cDNA utilizzando il Invitrogen SuperScript First-Strand sistema RNA è facilmente soggetta a scissione da RNasi che porta al degrado. Di conseguenza molti protocolli di espressione genica sono stati sviluppati per utilizzare un prodotto più stabile del DNA che è stato sintetizzato direttamente dal RNA. Qui la sintesi dettaglio del primo filamento di cDNA utilizzando il Invitrogen SuperScript First-Strand sistema di sintesi 3. Ogni reazione di sintesi del DNA in grado di ospitare fino a 5 mg di RNA. <ol><li> Prima di iniziare la procedura di mix e centrifugare brevemente ciascun componente. </li><li> Preparare RNA / Primer miscela in una provetta sterile 0,5 ml microcentrifuga come indicato nella Tabella 1. </li><li> Incubare il campione a 65 ° C per 5 minuti. </li><li> Immediatamente il trasferimento del campione di liquami ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Mentre il campione è di raffreddamento preparare un master mix con i componenti descritti nella tabella 2. I volumi sono elencati per 1 reazione. Regolare i volumi di conseguenza per il numero totale di reazioni. </li><li> Dopo il raffreddamento, aggiungere 9 ml di master mix preparato al passaggio 5 per ogni RNA / miscela primer. Mescolare delicatamente e raccogliere per centrifugazione breve. Il volume totale di ogni campione dovrebbe essere 19 microlitri. </li><li> Incubare campione a 42 ° C per 2 minuti in un termociclatore. </li><li> Aggiungere 1 ml (50 unità) di SuperScript II RT di ogni tubo, mixare e incubare a 42 ° C per 60 minuti in un termociclatore. </li><li> Terminare la reazione a 70 ° C per 15 minuti e poi campione freddo a 4 ° C. Un termociclatore può essere programmato per i punti 8 e 9. </li><li> Dopo che il campione ha raggiunto 4 ° C, trasferire la reazione di un bagno di ghiaccio. </li><li> Sul ghiaccio aggiungere 1 ml di RNAsi H a ciascuna provetta ed incubare per 20 minuti a 37 ° C. Il volume totale è ora di 21 microlitri. L&#39;aggiunta di RNAsi H per il campione si degradano il modello di RNA e lasciare solo il prodotto singolo filamento cDNA. </li></ol> Parte 4: Isolamento cDNA e precipitazioni <ol><li> Una fase da 1,5 ml tubo blocco di gel sarà utilizzato per l&#39;isolamento del prodotto cDNA. Preparare una fase da 1,5 ml tubo blocco di gel per centrifugazione a 12.000 xg per 2 minuti. Il gel dovrebbe essere tutti sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungi 81,5 fenolo microlitri (Tris-saturi, tamponata a pH 8,0), 81,5 ml di alcool isoamilico 24:1 cloroformio, e il campione (21 microlitri) nel tubo gel fase di blocco. Mescolare più volte per inversione dolce. </li><li> Centrifugare il campione a 12.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Il cDNA deve essere nella fase superiore acquosa. Trasferire la fase superiore in una provetta da microcentrifuga pulita 1,5 ml. Il volume totale dovrebbe essere di circa 20 l. </li><li> Aggiungi 1X volume di 3 M NaOAc, pH 5.2 e mescolare delicatamente. Per esempio, se il volume della fase acquosa superiore era pari a 20 l, è necessario aggiungere 2 l di 3 M NaOAc, pH 5.2. </li><li> Aggiungere 7 ml di 5 mg / ml di glicogeno e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungi 1X volume di isopropanolo e mescolare delicatamente. Generalmente si tratta di circa 30 ml di isopropanolo. </li><li> Lasciare campione incubare a Temperatura ambientee per 10 minuti e poi centrifugare a 12000 xg per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Un piccolo pellet cDNA deve formare sul fondo della provetta. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 70% e mescolare per inversione. </li><li> Centrifugare il campione a 12.000 xg per 5 minuti. </li><li> Dopo la centrifugazione eliminare il surnatante con una pipetta e ripetere il lavaggio etanolo al 70% e centrifugazione (punti 10 e 11). </li><li> Dopo la centrifugazione eliminare il surnatante con una pipetta. Se vi è il liquido restante ai lati del tubo, può essere raccolto con una breve rotazione del tubo. Rimuovere il liquido in eccesso e lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 20 ml di acqua priva di nucleasi per reidratare il pellet. Mettere il campione a 55 ° C per 5 minuti per la reidratazione del pellet. </li><li> La quantità e la qualità del prodotto cDNA viene poi controllato con un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro seguendo le istruzioni del produttore. Il cDNA possono essere conservati a -20 ° C. </li></ol> Rappresentante Risultati Dopo la pulizia RNA, circa 15 mg di RNA totale di alta qualità si può aspettare da 50 embrioni di zebrafish. Per valutare la qualità totale RNA, uno spettrofotometro, elettroforesi su gel, e un Agilent 2100 Bioanalyzer può essere utilizzato. Un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro può essere usato per valutare l&#39;assorbanza a 260 nm rispetto al assorbanza a 280 nm (Figura 1). La A 260 / A 280 rapporto può rivelare la presenza di contaminanti e dare evidenza di possibile degrado. Un A 260 / A 280 rapporto di 1,9-2,0 è considerato accettabile. Inoltre, è altamente raccomandato che un gel di denaturazione RNA da eseguire per valutare l&#39;integrità dell&#39;RNA. Filamenti di RNA separerà sulla base delle loro dimensioni, con i più piccoli filamenti di migrazione più in basso il gel. Un campione non degradati apparirà come uno striscio con due fasce forti. Lo striscio è il risultato di una popolazione di diversi filoni mRNA dimensioni e le bande corrispondono a 28S e 18S rRNA. La band 28S dovrebbe essere circa due volte più intenso come la band 18S (Figura 2). In alternativa, totale integrità dell&#39;RNA può essere valutata utilizzando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Due picchi distinti che rappresenta il rRNA 28S e 18S è previsto (Figura 3). Il picco 28S dovrebbe essere maggiore del 18S picco con l&#39;area sotto i picchi di circa 2:1, rispettivamente. Due picchi distinti non saranno osservati nei campioni degradati. Campioni di RNA espone degrado non deve essere effettuata attraverso successive procedure sperimentali. Analisi spettrofotometriche possono essere usati per valutare la qualità del prodotto cDNA (Figura 4). La A 260 / A 280 dovrebbe essere intorno a 1,8. Reazioni cDNA con un ingresso di 5 mg di RNA totale di routine resa mcg 1-2 di cDNA prodotto nel nostro laboratorio. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Uno spettro NanoDrop di campioni di RNA. Dopo la pulizia RNA, la quantità di RNA e la qualità può essere valutata utilizzando un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro. Circa 15 mg di RNA di alta qualità totale è di routine dato da 50 embrioni di zebrafish con un A 260 / 280 Un rapporto intorno 1,9-2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un gel denaturazione dell&#39;RNA. Per valutare l&#39;integrità del totale isolamento di RNA, un gel denaturazione RNA può essere eseguito. Un striscio con due bande luminose corrispondenti a 28S e 18S rRNA è previsto. La band 28S dovrebbe essere di circa due volte più intenso come la band 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Una traccia di un campione di RNA da un Bioanalyzer. Per valutare l&#39;integrità del totale isolamento dell&#39;RNA, i campioni possono anche essere analizzati su un Agilent 2100 Bioanalyzer. Due cime aguzze, corrispondente al rRNA 28S e 18S, dovrebbe essere visibile. Il picco 28S dovrebbe essere maggiore del 18S picco con l&#39;area sotto i picchi di circa 2:1, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Uno spettro NanoDrop di un campione di cDNA. Analisi spettrofotometrica con un NanoDrop ND-1000 può essere utilizzato per valutare la quantità e la qualità del prodotto cDNA. La A 260 / A 280 rapporto dovrebbe essere intorno a 1,8. Reazioni cDNA con un ingresso di 5 ug di RNA totale di routine resa 1-2 ug di cDNA nel nostro laboratorio. Tabella 1. Componenti da aggiungere per RNA / miscele di fondo al punto 2 della sintesi del DNA. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> RNA totale (fino a 5 mg) </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 mg / mL) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC trattati con acqua </td><td> n microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 10 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Miscela di reazione per il punto 5 della sintesi del DNA. I volumi indicati si intendono per reazione. Aumentare i volumi di ogni componente per il numero totale di reazioni. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> RT buffer 10X </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La fragilità della molecola di RNA è la considerazione più importante che dovrebbe essere ricordato in tutto questo protocollo. Materiale sterile che viene RNasi-free deve essere sempre utilizzato in un RNAse zona libera del laboratorio. È utile riservare una parte del laboratorio da utilizzare per le procedure di RNA solo. Questa zona deve essere frequentemente spruzzato con un prodotto RNAse rimozione, come RNAse Lontano. I campioni di RNA devono essere sempre trattati con i guanti e tenuta in ghiaccio per evitare...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Molte procedure di laboratorio importanti e complesse richiedono un input di alta qualità, l&#39;RNA intatto. Un campione degradato o la presenza di impurità può portare a risultati disastrosi in valle applicazioni sperimentali. E &#39;quindi, di estrema importanza di utilizzare tecniche solido con numerose garanzie e controlli di qualità per assicurare un campione superiore. Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per isolare RNA totale da embrioni di zebrafish tutto utilizzando una sostanza chimica denaturante disponibile in commercio e successiva pulizia per rimuovere le tracce di DNA e le impurità con un kit di isolamento commerciale RNA. Poiché l&#39;RNA è relativamente instabile e facilmente soggetta a scissione da RNasi, più saggio di protocolli di espressione genica utilizzando un prodotto che è direttamente cDNA sintetizzato da un modello di RNA. Noi dettaglio una procedura per convertire l&#39;RNA nel prodotto più stabile cDNA utilizzando un kit disponibile in commercio. In tutto queste procedure ci sono numerosi controlli di qualità per garantire che il campione non è degradato o contaminato. Il prodotto finale di questi protocolli è cDNA che è adatto per l&#39;analisi microarray, RT-PCR o conservazione a lungo termine.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

L&#39;isolamento di alta qualità, intatto RNA è un passo essenziale in molti protocolli di laboratorio. In questo studio dimostriamo estrazione di RNA da embrioni di zebrafish tutto e sintesi del DNA per la successiva applicazione in diverse procedure sperimentali inclusa l&#39;analisi microarray di espressione genica.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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Research

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37.7K Views.  Purdue University. L'isolamento di alta qualità, intatto RNA è un passo essenziale in molti protocolli di laboratorio. In questo studio dimostriamo estrazione di RNA da embrioni di zebrafish tutto e sintesi del DNA per la successiva applicazione in diverse procedure sperimentali inclusa l'analisi microarray di espressione genica.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

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Biologia

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

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Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...