Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la ricerca austriaco (FWF, concedere N211-NAN per DS) e l&#39;Agenzia austriaca per la promozione della ricerca (FFG, concedere N200 a DS). Gli autori ringraziano URL Claudia per un&#39;eccellente assistenza tecnica e Monica Farrell per la modifica linguistica.

1. Materiale di partenza Inizia con plasma ricco di piastrine (PRP) unità preparata da cytapheresis o derivati ​​da buffy cappotti. 2. Sterilità controllo Per verificare la sterilità prendere un campione di 20 mL da ciascuna unità PRP, trasferendo il volume ad un sacchetto collegato piccolo (Baxter). Scollegare questa borsa mediante saldatura. 3. Congelamento delle unità di PRP Immediatamente dopo la preparazione, congelare le unità PRP fino ad almeno -20 ° C nel sacchetto originale senza ulteriori manipolazioni. 4. Scongelamento delle unità di HPL Quando i test batterici sono negativi, disgelo umano unità di lisato piastrinico, ora si chiama unità di HPL a 37 ° C (bagno d&#39;acqua) fino a quando i grumi di ghiaccio scompaiono. Non riscaldare il HPL. 5. Messa in comune delle unità di HPL Prendere almeno 10-15 unità scongelati HPL per un pool di lisato piastrinico per preparare un prodotto standardizzato. Collegare le sacche HPL consecutivamente per la borsa pooling doppio (MacoPharma) e trasferire la HPL in questi due sacchi. Scollegare le borse vuote HPL mediante saldatura. Ottenere un volume finale di 3 a 4 L di pool di lisato piastrinico umano (pHPL) mescolando il contenuto delle due borse. Collegare un piccolo sacchetto (Baxter) e prendere un campione di 20 mL pHPL per controllare la sterilità del prodotto in pool. Scollegare questa borsa mediante saldatura. 6. Porzionatura dei pHPL Parte il pHPL per ottenere aliquote adatto per ulteriori elaborazioni. Collegare sacchetti di piccole dimensioni (Baxter) per la borsa pooling doppio (Macopharma) e il trasferimento di volumi fino a 250 ml per le borse di storage di piccole dimensioni (Baxter). Scollegare i sacchi pieni di saldatura. 7. Re-congelamento delle aliquote pHPL Aumentare il tasso di frammentazione delle piastrine e la quantità di fattori di crescita rilasciati da un ulteriore gelo / disgelo passo. Congelare i sacchetti di pHPL porzionato di nuovo almeno -20 ° C. 8. Re-scongelamento e porzionatura del aliquote pHPL Scongelare le borse pHPL a 37 ° C (bagno d&#39;acqua). Trasferire il contenuto in flaconcini da 50 ml (Falcons BD) tagliando il tubo del sacchetto con le forbici sterili e versare il pHPL in fiale. Eseguire questo passaggio in un banco a flusso laminare per evitare contaminazioni batteriche o fungine. 9. Rimozione di frammenti di piastrine Come frammenti di piastrine tendono ad aggregarsi e possono indurre alloimmunizzazione, rimuoverli dalla pHPL. Centrifugare le provette pHPL quindi a 4.000 g (15 minuti, 4 ° C). In una pipetta da banco a flusso laminare il plasma surnatante in fiale stoccaggio finale (Falchi BD) e scartare il pellet di piastrine per evitare di frammenti in coltura cellulare. 10. Conservazione dei pHPL Congelamento aliquote di 50 ml fiale pHPL ancora almeno-20 ° C e conservarle per uso sperimentale. 11. L&#39;uso di pHPL in coltura cellulare Inizialmente aggiungere eparina senza conservanti al mezzo per evitare la formazione di gel. Scongelare un&#39;aliquota pHPL a 37 ° C e integrare il terreno di coltura con l&#39;aggiunta di 8 - 10%. Mezzi MSC-media: Utilizzare 500 ml di a-MEM, aggiungere 56 ml di scongelato pHPL (vedi anche riferimento 1 per ulteriori dettagli) e 2 IU / mL (= ml di soluzione madre 224) senza conservanti di eparina (evita la coagulazione del mezzo attraverso aggregazione di il fibrinogeno nel plasma) per raggiungere una concentrazione finale del 10% pHPL. Inoltre aggiungere penicillina (100U/mL) / streptomicina (100μg/mL) soluzione e 2mM di L-Glutamin (entrambi Sigma). Filtrare il medium attraverso un poro 20 micron filtro dimensioni del vuoto (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data). ECFC-media: Utilizzare una bottiglia (500 ml) di EBM, aggiungere il citochine aliquote, 56 ml di pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl di soluzione madre) di conservanti eparina, penicillina (100U/mL) / Streptomicina (100 g / mL) e 2mM soluzione di L-Glutamin al mezzo basale e il filtro con 20 l poro vuoto dimensione del filtro (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data). <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Preparazione del plasma ricco di piastrine da una donazione di sangue intero da una banca del sangue locale o qualsiasi altro provider autorizzati. Dopo la centrifugazione del sangue può essere separato in plasma, buffy coat e globuli rossi. Quattro unità buffy coat, gruppo sanguigno O e un gruppo sanguigno AB plasma può essere raggruppati prima centrifugazione per separare il plasma ricco di piastrine. A regolare la qualità ricco di piastrine unità di plasma di circa 300mL dovrebbe contenere 1x10 9 piastrine per ml o 3x10 11 platelets totale. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="Figura 2" /><img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="Figura 3" />

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In alcune regioni plasma ricco di piastrine (PRP) possono essere ottenuti da buffy-coat altrimenti essendo un prodotto di scarto della confezionato produzione di globuli rossi da donazioni di sangue testato (Figura 1). In modo ottimale, PRP viene utilizzata immediatamente per l&#39;ulteriore preparazione di pHPL, come in piastrine superata concentra la disponibilità di fattori di crescita può essere ridotta a causa di lesioni di stoccaggio delle piastrine e la degradazione 20. Si raccomanda inoltre di produ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Double bag (2 x 3.5L)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MacoPharma</td>
<td>VDL 8000XQ</td>
<td>originally for ascites puncture</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL Falcon tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon BD</td>
<td>2098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL Stripettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>4501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma bags (600mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>R4R2021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile tubing welder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Terumo</td>
<td>TSCD-II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Welding equipment </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fresenius Kabi</td>
<td>Compo Seal</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clamps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of pooled human platelet lysate (phpl) as an efficient supplement for animal serum-free human stem cell cultures

Fattori di crescita derivato dalle piastrine hanno dimostrato di stimolare la proliferazione cellulare in modo efficiente<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 1,2</sup&gt; E<em&gt; In vitro</em&gt;. Questo effetto è stato segnalato per le cellule stromali mesenchimali (MSCs), fibroblasti e endoteliali che formano colonie cellule con piastrine attivate da parte della trombina<sup&gt; 3-5</sup&gt; O lisate da cicli gelo / disgelo<sup&gt; 6-14</sup&gt; Prima del releasate piastrinica è aggiunto al mezzo di coltura cellulare. L&#39;effetto trofico dei fattori di crescita derivato dalle piastrine è già stato testato in studi diversi per l&#39;ingegneria dei tessuti e la terapia rigenerativa.<sup&gt; 1,15-17</supEfficienza&gt; Variando è considerato, almeno in parte a causa di concentrazioni singolarmente divergenti dei fattori di crescita<sup&gt; 18,19</sup&gt; E la mancanza attuale di protocolli standardizzati per la preparazione delle piastrine.<sup&gt; 15,16</sup&gt; Questo protocollo rappresenta una procedura praticabile per generare un pool di risorse umane lisato piastrinico (pHPL) derivati ​​da plasma regolarmente prodotto ricco di piastrine (PRP) del 40-50 donazioni di sangue singolo. Da diversi cicli gelo / disgelo le membrane delle piastrine sono danneggiati e fattori di crescita sono efficacemente rilasciati nel plasma. Infine, i frammenti delle piastrine vengono rimossi mediante centrifugazione per evitare la formazione di ampi aggregati e impoveriscono gli antigeni potenziale. L&#39;attuazione di pHPL in protocolli standard di cultura rappresenta uno strumento promettente per l&#39;ulteriore sviluppo di terapie cellulari propagato in un animale privo di proteine ​​del sistema.

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Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.

Preparazione del pool lisato piastrinico umani (pHPL) come supplemento efficiente per animali siero-Free Culture sulle cellule staminali umane

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

preparation-pooled-human-platelet-lysate-phpl-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

25.1K Views.  Medical University of Graz, Austria. Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.