Questa metogenetica grande quantità di epatosfere 3D di cellule staminali pluripotenti umane utilizzando i materiali fini e le cellule di assemblaggio. Il principale progresso di questa tecnica è che consente di controllare le dimensioni delle sfere epatiche 3D, limitando la formazione di centri necrotici e la perdita di fenotipo. A dimostrare la procedura con me sarà Yu Wang, un post-dottorato nel nostro laboratorio.
Prepararsi a presentare stampi di agarosio sciogliendo due grammi di agarosio a bassa temperatura di fusione in 100 millilitri di acqua distillata sterilizzata. Riscaldare con cura la miscela nel microonde con l'intervallo che trema per sciogliere completamente l'agarosio. Aggiungere 520 microlitri dell'agarosio fuso a uno stampo ben formato 256 e consentirne la solidificazione.
Quindi, trasferire ogni micro piatto di agarosio in un unico pozzo di una piastra da 12 porri. Aggiungere 1,5 millilitri di DPBS con calcio e magnesio ad ogni pozzo e pipettare su e giù per rimuovere le bolle. Per preparare la sospensione cellulare, iniziare aspirando il mezzo da una coltura indifferenziata di cellule staminali pluripotenti umane, o HPSC.
Risciacquare le cellule aggiungendo cinque millilitri di DPBS a temperatura ambiente, senza calcio o magnesio e quindi rimuovere il tampone. Aggiungere cinque millilitri di reagente di dissociazione cellulare alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per sei-otto minuti. Osservare il distacco cellulare al microscopio ed estendere l'incubazione per uno o due minuti in più, se necessario.
Fermare la reazione rimuovendo il reagente di dissociazione cellulare e aggiungendo cinque millilitri di MT fresco servire un mezzo integrato con 10 inibitori della roccia micromolare, Y27632. Pipetta su e giù più volte per dissociare le cellule. Contare le cellule vitali con l'emocitometro e la colorazione blu tripano per calcolare il numero totale di cellule necessarie.
Trasferire il numero desiderato di cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 o 50 millilitri e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti per pellettare le cellule. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in MT servire un mezzo con 10 inibitori della roccia micromolare per una concentrazione finale di 2,1 milioni di cellule per millilitro. Successivamente, salvare le cellule aggiungendo 190 microlitri di sospensione cellulare preparata per micro pozzo di agarosio e incubando le micro piastre di agarosio a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque% per due ore.
Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di un mezzo fresco, caldo, T-serve un mezzo con inibitore della roccia ad ogni bene. Restituire le piastre all'incubatrice e lasciarle lì per 24 ore. Il giorno dopo, esamina la sfera della formazione.
Preparare pozzatti rivestiti di poli-due idrossietile metacrilato o poliema sciogliendo due grammi di poliema in 100 millilitri di etanolo al 95% e mescolando la soluzione durante la notte su una piastra calda di 55 gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere 250 microlitri della soluzione ad ogni pozzo di una piastra da 24 po 'e asciugare la piastra durante la notte in un forno a 60 gradi Celsius. Inizia la differenziazione degli epatociti rimuovendo attentamente l'MT per servire un mezzo dalle cellule precedentemente seminate e sostituendolo con un millilitro di mezzo di differenziazione dell'endoderma fresco.
Per le cellule staminali embrionali umane, aggiornare il mezzo ogni 24 ore per tre giorni. È importante iniziare la differenziazione degli epatociti 24 ore dopo la semina per evitare la differenziazione cellulare spontanea. Dopo l'induzione definitiva dell'endoderma, passare il mezzo al mezzo di differenziazione dell'epatoblasto per cinque giorni.
Sostituire il mezzo ogni due giorni, eseguendo l'ultima modifica l'ultimo giorno di specifica dell'epatoblasto. Per trasferire le epatosfere nei pozzi rivestiti in poliema preparati, lavare le cellule con mezzo di maturazione epatocita e quindi aggiungere un millilitro del mezzo integrato con 10 nanogrammi per millilitro HGF e 20 nanogrammi per millilitro OSM. Pipettare la soluzione su e giù più volte per sollevare le epatosfere dalla micro piastra di agarosio e trasferirle in un pozzo rivestito in poli-ema.
Lavare la microstra di agarosio con un millilitro del mezzo di maturazione epatocita integrato e trasferire il mezzo al pozzo rivestito in poliema. Utilizzando una pipetta P-100, aspirare con cura il mezzo in eccesso senza rimuovere le epatosfere fino a quando non rimane circa un millilitro di mezzo nel pozzo. Rinfrescare il mezzo ogni 48 ore per 12 giorni.
Se si lavora con cellule staminali embrionali, passare dal mezzo al mezzo di mantenimento degli epatociti al giorno 20 rimuovendo il mezzo di maturazione, lavando le cellule con mezzo di mantenimento e quindi aggiungendo un millilitro di mezzo di mantenimento integrato. Dopo questo, aggiornare il mezzo ogni 48 ore. I cambiamenti immediati devono essere eseguiti con attenzione per evitare gravi stress e distorsioni di questa struttura sferica.
La colorazione degli epatociti nei marcatori mesenchimali rivela che le epatosfere formate usando questa tecnica sono composte da cellule simili a epatociti che circondano un nucleo di cellule mesenchimali. Altre proteine tipicamente espresse in epatociti si trovano anche sullo strato esterno delle sfere. L'analisi funzionale degli enzimi citocromi P450 o CYP nelle colture di epatosfera di 30 giorni ha mostrato che le sfere 3D mostrano livelli rispettabili di attività cyp rispetto agli epatociti primari umani.
Inoltre, si può dimostrare che le epatosfere secernono proteine epatiche come l'albumina e l'alfa-fetoproteina. La cosa più importante da ricordare per questo protocollo è pipettare delicatamente su e giù per la soluzione contenente epatosfere 3D quando le trasferiscono nella piastra rivestita in poli-ema. Questo aiuta a evitare di danneggiarli.
Una volta padroneggiata, questa metodologia consente la generazione di sfere epatiche 3D che rimangono funzionali per oltre un anno in vitro con molteplici applicazioni nella modellazione e nello screening dei farmaci deceduti. Guardando al futuro, questa tecnologia potrebbe essere utilizzata come piattaforma per sviluppare ulteriori tessuti entodermi e mesenchimali con architetture complesse.
