Diese Arbeit wurde von der Austrian Research Foundation (FWF, gewähren N211-NAN DS) und die Österreichische Forschungsförderungsgesellschaft mbH (FFG, gewähren N200 zum DS) unterstützt worden. Die Autoren danken Claudia URL für hervorragende technische Unterstützung und Monica Farrell für die sprachliche Bearbeitung.

1. Ausgangsmaterial Beginnen Sie mit Thrombozyten-reichem Plasma (PRP) Einheiten durch Zytopherese oder aus Buffy Coats. 2. Sterilität zu überprüfen Für die Sterilität zu überprüfen eine Probe von 20 ml aus jedem PRP-Einheit durch die Übertragung der Lautstärke auf einem angeschlossenen kleinen Beutel (Baxter). Trennen Sie diese Tasche durch Schweißen. 3. Einfrieren von PRP-Einheiten Unmittelbar nach der Herstellung, frieren die PRP-Einheiten bis mindestens -20 ° C in der ursprünglichen Aufbewahrungstasche ohne weitere Manipulation. 4. Auftauen von HPL-Einheiten Wenn bakteriellen Tests negativ sind, Tauwetter menschlichen Thrombozyten-Lysat Einheiten, die heute als HPL-Einheiten bei 37 ° C (Wasserbad), bis das Eis Blutgerinnsel verschwinden. Nicht erwärmen die HPL. 5. Pooling von HPL-Einheiten Nehmen Sie sich mindestens 10 bis 15 aufgetaut HPL-Einheiten für eine Thrombozyten-Lysat-Pool, ein standardisiertes Produkt vorbereiten. Schließen Sie das HPL Beutel nacheinander auf die Zusammenlegung doppelten Beutel (MacoPharma) und übertragen Sie die HPL in diese beiden Taschen. Trennen Sie die leere HPL Beutel verschweißt. Holen Sie sich ein Gesamtvolumen von 3 bis 4 L von gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) durch Mischen der Inhalt der beiden Tüten. Schließen Sie eine kleine Tasche (Baxter) und nehmen Sie eine Probe von 20 mL PHPL für Sterilität Überprüfung der gepoolten Produkt. Trennen Sie diese Tasche durch Schweißen. 6. Portionieren der PHPL Portion der PHPL geeignete Aliquots für die weitere Verarbeitung zu bekommen. Connect kleine Beutel (Baxter), um die Bündelung doppelten Beutel (Macopharma) und Transfer Volumen von bis zu 250 mL der kleinen Säcken zur Lagerung (Baxter). Trennen Sie die gefüllten Säcke durch Schweißen. 7. Re-Einfrieren der PHPL Aliquots Erhöhung des Anteils der Thrombozyten-Fragmentierung und die Menge des freigesetzten Wachstumsfaktoren durch einen weiteren Frost / Tau-Schritt. Frieren Sie den kleinen Beutel portioniert PHPL wieder bei mindestens -20 ° C. 8. Re-Auftau-und Portionierung des PHPL Aliquots Auftauen PHPL Beutel bei 37 ° C (Wasserbad). Übertragen Sie die Inhalte in 50 ml-Fläschchen (Falcons BD), indem das Rohr des Beutels mit einer sterilen Schere und Gießen der PHPL in das Fläschchen. Führen Sie diesen Schritt in einer laminaren Strömung Bank, um bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination zu vermeiden. 9. Entfernen von Thrombozyten-Fragmente Da Thrombozyten-Fragmente zur Aggregation neigen und kann Alloimmunisierung induzieren, entfernen Sie sie aus dem PHPL. Zentrifugieren Sie die PHPL Fläschchen daher bei 4.000 g (15 Minuten, 4 ° C). In einer laminaren Strömung Bank Pipette der Überstand Plasma in die Endlagerung Fläschchen (Falcons BD) und entsorgen Sie die Thrombozyten-Pellets zu vermeiden Fragmente in der Zellkultur. 10. Speicherung von PHPL Freeze-Aliquots von 50 ml Fläschchen PHPL wieder mindestens-20 ° C und lagern Sie sie zu Versuchszwecken verwendet. 11. Verwendung von PHPL in der Zellkultur Zunächst fügen Sie frei von Konservierungsmitteln Heparin auf die mittel-bis Gelbildung zu vermeiden. Tauwetter ein PHPL Aliquot bei 37 ° C und ergänzen das Kulturmedium durch Zugabe von 8 bis 10%. Medien MSC-Medium: Verwenden Sie 500 ml a-MEM, fügen Sie 56 ml des aufgetauten PHPL (siehe auch Hinweis 1 für weitere Details) und 2 IU / mL (= 224 ul der Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin (verhindert Koagulation des Mediums durch Verklumpung der das Fibrinogen im Plasma), um eine endgültige Konzentration von 10% PHPL. Zusätzlich fügen Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100μg/mL)-Lösung und 2 mM L-Glutamin (beide Sigma). Filter das Medium, durch ein 20 um-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum). ECFC-Medium: Verwenden Sie eine Flasche (500 ml) von EBM, fügen Sie die Zytokin-Aliquots, 56 ml PHPL, 10 IU / ml (= 1120μl Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin, Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100 g / ml)-Lösung und 2 mM L-Glutamin, die Basalmedium und Filter mit 20 ul-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum). <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Herstellung von Plättchen-reiches Plasma aus einer Vollblutspende von einem lokalen Blutbank oder anderen zugelassenen Anbieter. Nach Zentrifugation kann das Blut in Plasma, Buffy Coat und Erythrozyten getrennt werden. Vier Buffy-Coat-Einheiten, Blutgruppe O und eine Blutgruppe AB Plasma kann gebündelt vor der Zentrifugation der Blutplättchen reiches Plasma getrennt zu sein. Eine regelmäßige Qualitätskontrollen Plättchen-reiches Plasma-Einheit von etwa 300 ml enthalten sollte 1x10 9 Thrombozyten pro ml oder 3x10 11 platelets insgesamt. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /><img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="Abbildung 3" />

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In einigen Regionen platelet rich plasma (PRP) kann von Buffy-Coats sonst, ein Abfallprodukt der gepackten roten Blutkörperchen aus getestet Blutspenden (Abbildung 1) erreicht werden. Optimal ist PRP sofort für die weitere Bearbeitung von PHPL verwendet, wie in veralteten Thrombozytenkonzentraten die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren können durch Thrombozyten-Lagerung Läsionen und Abbau 20 reduziert werden. Es wird ferner empfohlen, PRP durch Anpassung Thrombozyten der Blutgruppe O mit Plasma der Blutg...

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		<div>
		<table border="1">
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Double bag (2 x 3.5L)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MacoPharma</td>
<td>VDL 8000XQ</td>
<td>originally for ascites puncture</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL Falcon tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon BD</td>
<td>2098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL Stripettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>4501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma bags (600mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>R4R2021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile tubing welder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Terumo</td>
<td>TSCD-II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Welding equipment </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fresenius Kabi</td>
<td>Compo Seal</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clamps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of pooled human platelet lysate (phpl) as an efficient supplement for animal serum-free human stem cell cultures

Platelet derived growth Faktoren haben gezeigt, dass die Zellproliferation effizient stimulieren<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 1,2</sup&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Dieser Effekt wurde für mesenchymale Stromazellen (MSCs), Fibroblasten und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen mit Thrombozyten durch Thrombin aktiviert gemeldet<sup&gt; 3-5</sup&gt; Oder durch Frost / Tau-Zyklen lysiert<sup&gt; 6-14</sup&gt; Vor der Thrombozyten releasate ist das Zellkulturmedium aufgenommen. Die trophische Wirkung von thrombozytären Wachstumsfaktoren hat bereits in mehreren Studien für das Tissue Engineering und der regenerativen Therapie getestet.<sup&gt; 1,15-17</sup&gt; Unterschiedliche Effizienz gilt als zumindest teilweise durch individuell unterschiedliche Konzentrationen von Wachstumsfaktoren werden<sup&gt; 18,19</sup&gt; Und einem aktuellen Mangel an standardisierten Protokollen für Thrombozyten-Vorbereitung.<sup&gt; 15,16</sup&gt; Dieses Protokoll stellt ein praktikables Verfahren zu einem Pool von menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) von routinemäßig produziert platelet rich plasma (PRP) von 40 bis 50 einzelnen Blutspenden gewonnen zu generieren. Durch mehrere Frost / Tau-Zyklen der Thrombozyten-Membranen sind beschädigt und Wachstumsfaktoren sind effizient in das Plasma freigesetzt. Schließlich sind die Thrombozyten-Fragmenten durch Zentrifugation umfangreiche Aggregatbildung zu vermeiden und zum Abbau potenzieller Antigene entfernt. Die Umsetzung der PHPL in Standard-Kultur-Protokolle stellt ein viel versprechendes Instrument für die weitere Entwicklung von Zelltherapeutika propagiert in einem Tier-Protein-freies System.

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Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Menschliche Thrombozyten-Lysat ist eine reiche Quelle von Wachstumsfaktoren und eine starke Ergänzung in der Zellkultur. Dieses Protokoll stellt den Prozess der Vorbereitung einen großen Pool an menschlichen Thrombozyten-Lysat ausgehend von platelet rich plasma, Durchführung mehrerer Gefrier-Auftau-Zyklen und zum Abbau der Thrombozyten-Fragmente.

Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

25.1K Aufrufe.  Medical University of Graz, Austria. Menschliche Thrombozyten-Lysat ist eine reiche Quelle von Wachstumsfaktoren und eine starke Ergänzung in der Zellkultur. Dieses Protokoll stellt den Prozess der Vorbereitung einen großen Pool an menschlichen Thrombozyten-Lysat ausgehend von platelet rich plasma, Durchführung mehrerer Gefrier-Auftau-Zyklen und zum Abbau der Thrombozyten-Fragmente.