Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la Columbia Britannica Conoscenza di sviluppo regionale, Genome British Columbia e la British Columbia Ministero delle Foreste e Gamma per sostenere gli studi in corso di produttività del suolo forestale. SL è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.

Parte I: Estrazione del DNA Procedura 1. 8 ore sono tenuti, per l&#39;elaborazione di 6 campioni esclusi quantificazione del DNA. Prima di iniziare l&#39;estrazione, sarà necessario pre-chill mortaio, pestello e spatola in un congelatore di -20 ° C o con azoto liquido. Inoltre, pre-chill 50 ml provette contenenti 20 ml di cloroformio alcool isoamilico (24:1) su ghiaccio. Impostare il forno di ibridazione a 65 ° C per preriscaldare. Controllare soluzione CTAB, se è cristallizzato calda a 60 ° C per sciogliere i cristalli. Completa la soluzione tampone di estrazione denaturazione e aggiungendo gli ingredienti ultima poco prima di avviare l&#39;estrazione (vedi la ricetta sotto). Condurre tutte le procedure di estrazione in una cappa aspirante. 2. Preparare il tampone di denaturazione e tampone di estrazione. Nota: Per massimizzare la resa del DNA, è fondamentale per fare proprio buffer seguendo le istruzioni. 3. Mettere 2 g di suolo in un pre-raffreddata malta. Note: Terreno raccolti sul campo devono essere congelati in ghiaccio secco per il trasporto e conservati a -80 ° C. Scongelare e suolo setaccio usando un setaccio 2 millimetri prima dell&#39;estrazione del DNA. È possibile aumentare l&#39;importo iniziale di terreno fino a 10 g. 4. Aggiungere 1 ml di soluzione di denaturazione al suolo. 5. Congelare e macinare il terreno in N 2 liquido utilizzando un pestello fino a quando le particelle del terreno aspetto polveroso e omogenea. Ripetere il congelamento e macinazione due volte. Nota: Conservare il campione di terreno ghiacciato durante la rettifica, utilizzando l&#39;azoto liquido a sufficienza per coprire completamente il campione di suolo. Fusione leggero durante la macinazione è accettabile. 6. Trasferire il terreno terreno per un tubo da 50 ml coniche con un pre-raffreddata spatola. Nota: Il campione di suolo di terra possono essere conservati a -80 ° C a questo punto, se necessario. 7. Aggiungere 9 ml di tampone di estrazione. Per miscelare la soluzione e nel suolo, mescolare brevemente nel vortex a bassa velocità. Nota: Per garantire il buffer è omogenea, è calda a 60 ° C per 10-15 minuti prima dell&#39;uso. Tenere il resto del tampone a 60 ° C durante tutto l&#39;estrazione. Vortex a velocità 8 (in una scala dove 10 è il massimo). 8. Incubare per 40 minuti a 65 ° C in un fornetto. Durante l&#39;incubazione, continuamente ruotare i tubi alla minima velocità, o capovolgere delicatamente i tubi ogni 10 min. Nota: posizionare il tubo orizzontalmente in un fornetto per consentire tampone a contatto del terreno su una superficie di grandi dimensioni. La soluzione può sembrare un po &#39;viscoso durante l&#39;incubazione. 9. Centrifugare a 1800 x g per 10 minuti a 10 - 14 ° C. Trasferire il surnatante in pre-raffreddata tubo 50 ml contenente 20 ml di cloroformio-alcool isoamilico (24:1), tenere su ghiaccio. Nota: Quando si trasferisce sopranatante, fare attenzione a non disturbare lo strato organico (strato inferiore). Lascia 1-2 ml di supernatante se è necessario al fine di raccogliere solo surnatante pulito. Spesso si può vedere uno strato beige (circa 1-3 millimetri di spessore) sulla parte superiore del surnatante. Non disturbare questo strato al momento del ritiro il sopranatante. Provate a scorrere la punta lungo la parete del tubo per prevenire la rottura di questo strato beige. Se il surnatante è troppo torbida, ripetere l&#39;estrazione di cloroformio-alcool isoamilico ancora una volta sul supernatante. Non usare pipette di plastica monouso durante il trasferimento di cloroformio, il cloroformio si scioglierà la plastica. Utilizzare una pipetta di vetro, o un cilindro di vetro graduato, cloroformio o versare direttamente in provette da 50 ml. 10. Estrarre le palline terreno altri 2 volte; 10.1. Aggiungere 5 ml di tampone di estrazione del pellet suolo, mescolare delicatamente usando 1 ml di punta seguita da brevi vortex a bassa velocità. Nota: Agitare e mescolare il buffer prima dell&#39;uso. 10.2. Incubare a 65 ° C per 10 minuti in forno di ibridazione. Centrifugare a 1800 x g per 10 minuti a 10 - 14 ° C. Trasferire il surnatante al tubo al punto 9. Tenere il tubo con raccolte surnatante e cloroformio-alcool isoamilico sul ghiaccio durante l&#39;estrazione. Nota: assicurarsi di aggiungere il surnatante al tubo stesso senza croce di miscelazione tra i campioni. 10.3. Ripetere 9.1 e 9.2 ancora una volta. 11. Utilizzando una piastra rotante, molto delicatamente roccia il tubo che contiene la raccolta surnatante (14-19 ml) e cloroformio-alcool isoamilico a 1,25 rpm per 10 min. Nota: Chiudere il coperchio molto strettamente per evitare perdite. Stendere un tovagliolo di carta sul piatto oscillante prima di posizionare il tubo in modo eventuali perdite possono essere facilmente individuati. 12. Centrifugare a 1800 x g per 20 minuti a 10 - 14 ° C. 13. Trasferimento fase acquosa in una nuova provetta. Nota: Non disturbare l&#39;interfase tra la fase acquosa (strato superiore) e lo strato organico (in bassolayer) quando si trasferisce il surnatante. Lasciare circa 1,5-2 ml surnatante per assicurare la raccolta di soli surnatante pulito. 14. Recuperare il DNA con alcool isopropilico (passo 15.a - 21.a). In alternativa, utilizzare Amicon ® Ultra-15 Dispositivi centrifuga Filter (step 15b - 21.b) se ci si aspetta molto bassa quantità di biomassa nel campione, che produrrà appena visibile a pellet per precipitazione alcool isopropilico che è difficile da recuperare. 15.a. Mettere il supernatante in una ultracentrifuga tubo nuovo. 16.a. Aggiungi alcol isopropilico per il supernatante viene raccolto in un rapporto volume di 0.6:1. Invertire i tubi delicatamente un paio di volte per mescolare. 17.a Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. 18.a. Centrifugare a 16000 x g per 20 minuti a 20 - 25 ° C. Assicurare il peso di tutti i tubi sono bilanciati ben prima della fase di centrifugazione. Nota: Mark direzione della forza centrifuga sul tubo, in modo da poter rilevare il pellet di DNA più facilmente quando la resa del DNA è bassa. 19.a. Togliere l&#39;alcol isopropilico per decantazione o aspirazione a vuoto. Fare attenzione a non disturbare il pellet di DNA. Nota: Rimuovere l&#39;alcool isopropilico non appena la centrifugazione è stato completato. State molto attenti a non perdere il pellet di DNA. La dimensione del DNA pellet può variare notevolmente a seconda del tipo di terreno, da un ben visibile (~ 9 mm di diametro) a malapena visibili. Si consiglia di rimuovere i residui di alcool isopropilico, aspirando lungo la parete del tubo accuratamente in modo da non aspirazione il pellet di DNA. 20.a. Secco DNA pellet a temperatura ambiente per 5 - 20 min. Nota: non troppo secco DNA a pellet, altrimenti sarà difficile ridisciogliere il DNA. 21.a. Risospendere il pellet di DNA in 200 l TE. Mescolare picchiettando leggermente. Trasferire la soluzione di DNA in 1,5 ml di tubo. Tenere il tubo a 4 ° C per una notte in modo da sciogliere completamente il DNA. Nota: a seconda delle dimensioni del pellet, è possibile regolare il volume di TE da aggiungere. Di solito 200-400 ml di TE funziona bene. * In alternativa seguire la procedura 15b - 21.b. 15.b. Prelavaggio uno Amicon ® Ultra-15 dispositivi centrifuga filtro, aggiungere 15 ml TE al dispositivo e centrifugare a 3500 x g per 10 min. Gettare il flow-through. 16.b. Posizionare la soluzione di DNA a partire dal punto 13 al pre-lavati filtro Amicon. Centrifugare a 3500 x g fino a quando il volume del DNA è ridotto a 200 - 500 microlitri. Gettare il flow-through. 17.b. Lavare il DNA con TE due volte, aggiungere 10 ml TE ai dispositivi di filtro Amicon. Centrifugare a 3500 x g fino a quando il volume del DNA è ridotto a circa 200 l. Gettare il flow-through. Ripetere ancora una volta. 18.b. Trasferire la soluzione di DNA sul filtro a un nuovo tubo di 1,5 ml. 19.b. Aggiungere 40 microlitri TE al filtro Amicon. Lavare entrambi i lati delle membrane filtro pipettando su e giù al fine di recuperare eventuali residui di DNA sul filtro. Aggiungere a questa soluzione di lavaggio per il tubo a 18.b. passo 20.b. Se necessario, il DNA può essere ulteriormente concentrato da microcontrollore ® Ultracel YM-30 Unità di centrifuga Filtro; pre-lavare il filtro con l&#39;aggiunta di 200 ul TE e la centrifugazione a 10000 x g per 7 minuti. Aggiungere la soluzione di DNA al filtro e centrifugare a 5000 x g per 1 min. Ripetere centrifugazione fino a quando la quantità di soluzione di DNA del filtro ridotto al 50 microlitri circa. Nota: volume del campione Massimo iniziale per microcontrollore filtro è 500 microlitri. Non centrifugare a velocità superiori a 14000 x g. Non più di centrifuga fino a quando la membrana si asciuga completamente. Assicurarsi che alcuni liquidi copre ancora il filtro dopo la centrifugazione. Se avete più di centrifugati e la membrana è asciutto, poi aggiungere 15 microlitri TE, agitare delicatamente per 30 secondi, e passare al punto 21.b. 21.b. Posizionare l&#39;unità filtro a testa in giù in un tubo nuovo microcontrollore e centrifugare a 1000 xg per 3 minuti per recuperare il DNA. 22. Quantificare il DNA da TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V per 4 ore), e da spettrofotometro NanoDrop o Pico-verde di analisi e lettore di piastre. Nota: importo del DNA può essere valutato confrontando il gruppo campione alla banda marcatore con concentrazione nota (High marcatore molecolare del DNA o λHindIII) sul gel. 23. Controllare l&#39;integrità del DNA alto peso molecolare mediante elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE) con l&#39;1%, 1xTAE gel (Per maggiori dettagli consultare la Fase II, part2 a <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 da Taupp et al 2009).. Nota: è possibile l&#39;uso regolare del gel di agarosio per questo scopo QC invece di bassa fusione agarosio. In breve, le condizioni di elettroforesi sono le seguenti: 2-250 KB, 6 volt, iniziale tempo di commutazione: 5 sec, tempo finale di commutazione: 15 sec, una durata di 12 ore a 14 ° C. Oro SYBR colorazione per un&#39;ora di visualizzare il DNA sul gel. 24. Se il peso molecolare di DNA estratto sono soddisfacenti, quindi procedere alla fase successiva CsCl centrifuga gradiente. In alternativa, il DNA possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C prima della centrifuga CsCl. La dimensione media del DNA dovrebbe essere la pari o superiore a 36 Kb, se si vuole costruire una grande biblioteca metagenomica di DNA. Parte II. Purificazione del DNA mediante ultracentrifugazione gradiente di cloruro di cesio Preparazione di centrifuga: 1,5 - 2 ore Centrifugazione passo: 18 ore Rimozione di etidio bromuro (EtBr) e concentrando il DNA dopo la centrifugazione: 3 ore Procedura Per ulteriori informazioni, consultare Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Risultati rappresentante / Esito La quantità totale di DNA genomico isolato da 2 g di suolo forestale organici (O orizzonte) e orizzonti minerali (Ae, AB, e Bt orizzonti) (prelevati dal suolo produttività a lungo termine (LTSP), sito che si trova a Skulow lago, BC, Canada e gestito da BC Ministero delle Foreste e Range) variava da 10 mg a 180 mg. La dimensione media di DNA isolato era di solito tra i 40 - 60 KB (Figura 1). Il rapporto di assorbanza a 260 nm nm/280 era tra 1,3-1,6 e ci fu un picco a 230 nm, che possono indicare contaminazione acidi umici spesso osservati in campioni di suolo. La centrifugazione in gradiente di CsCl drasticamente ridotto questa contaminazione e anche aumentato il rapporto di 260/280 a 1,8-1,9 come mostrato nella Figura 2a e 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Immagini PFGE del DNA genomico estratto prima ultracentrifugazione CsCl. lane1: 1 kb marcatore 100 ng, corsia 2: λHind III, punto 100 ng, corsia 3: λHind III marcatore 250 ng, corsia 4: λHind III marcatore 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcatore 100 ng, corsia 6 e 7: genomico DNA isolato dall&#39;orizzonte terreno Ae minerali, corsia 8 e 9: DNA genomico isolato dal AB orizzonte minerale del terreno nel sito LTSP trova Skulow lago, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Chromograms Figura 2. Di DNA genomico rilevato dal spettrofotometro prima (A) e dopo ultracentrifugazione CsCl (B). Si noti la riduzione del valore di assorbanza alla lunghezza d&#39;onda 230 nm dopo ultracentrifugazione CsCl, che indica un miglioramento della qualità del DNA genomico. Si prega di <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Ricetta * Denaturazione soluzione 4 M guanidina isotiocianato 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanolo <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Soluzione di denaturazione: 10 ml in totale </td></tr><tr><td> Guanidina isotiocianato (118,16 MW) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere acqua a 9,95 ml in totale. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere 50 microlitri 2-mercaptoetanolo appena prima dell&#39;uso. (5 ml di 2-mercaptoetanolo per 1 ml Soluzione di denaturazione) Nota: Conservare la soluzione di denaturazione a 4 ° C. Non utilizzare buffer di più di una settimana. Se possibile, fare tampone fresco da usare. </td></tr></table> ** Tampone di estrazione 100 mM di tampone fosfato di sodio [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M di NaCl Bromuro di esadeciltrimetilammonio 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampone di estrazione per 1 L in totale </td></tr><tr><td> Tampone fosfato di sodio 1M [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e tenerlo a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere 200 ml, il bromuro di esadeciltrimetilammonio 5% (CTAB, autoclavato) e 100 ml, 20% SDS (autoclave) subito prima dell&#39;uso. Se CTAB è stato cristallizzato, si fondono a 60 ° C. * 1M tampone fosfato di sodio: 57,7 ml di sodio 1M fosfato monobasico (NaH 2 PO 4) e 42,3 ml, 1M Fosfato di sodio bibasico (NaH 2 PO 4). Regolare il pH a 7,0 Nota: non utilizzare il 20% SDS se è precipitazioni. E &#39;normale vedere sospensione lattiginosa quando si aggiunge SDS alla soluzione. Una volta aggiunto SDS, posizionare il tampone di estrazione a 60 ° C per assicurare SDS è ben sospeso. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Il microbioma suolo è un vasto serbatoio e relativamente inesplorato della diversità genomica e innovazione metabolici che è intimamente associato a sostanze nutritive e flusso di energia negli ecosistemi terrestri. Coltivazione indipendente genomica ambientale, noto anche come metagenomica, approcci promessa accesso senza precedenti a queste informazioni genetiche rispetto alla ricostruzione percorso di screening e funzionale a fini terapeutici ad alto valore e processi di conversione della biomassa. Tuttavia, il microbioma suolo rimane ancora una sfida in gran parte dovuta alla difficoltà di ottenere DNA di alta peso molecolare di qualità sufficiente per la produzione di grandi biblioteche inserire. Qui introduciamo un protocollo per l&#39;estrazione ad alto peso molecolare, DNA genomico comunità microbica da terreni e sedimenti. La qualità del DNA genomico isolato è ideale per la costruzione di grandi librerie di inserimento ambientale genomiche per applicazioni a valle di sequenziamento e di screening. La procedura inizia con la lisi cellulare. Pareti delle cellule e le membrane dei microbi vengono lisati da entrambe le forze meccaniche (rettifica) e chimici (β-mercaptoetanolo). Il DNA genomico viene poi isolato tramite tampone di estrazione, cloroformio-alcool isoamilico e alcool isopropilico. I tamponi utilizzati per la lisi e fasi di estrazione comprendono isotiocianato di guanidina e esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) per preservare l&#39;integrità del DNA genomico ad alto peso molecolare del peso. A seconda dell&#39;applicazione a valle, il DNA genomico isolato può essere ulteriormente purificato con cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione gradiente, che riduce le impurità tra cui gli acidi umici. Il primo procedimento, l&#39;estrazione, dura circa 8 ore, escluse le passo la quantificazione del DNA. L&#39;ultracentrifugazione gradiente di CsCl, è un processo di due giorni. Durante l&#39;intera procedura, il DNA genomico deve essere trattata con delicatezza per evitare di taglio, evitare vortex severo, duro e ripetitivo pipettaggio.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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JoVE Journal

Biology

25.5K Views.  University of British Columbia - UBC. Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Ricerca

Biologia

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomica risonanza magnetica - una risorsa pubblica per lo Studio Patterns sequenza all&#39;interno del DNA genomico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ​​ad alto peso molecolare


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

Metodi modificati per il caricamento di piastre di estrazione del DNA ad alta velocità effettiva riducono il potenziale di contaminazione

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...