Gli autori desiderano ringraziare Demêmes Danielle e Douglas Cotanche e per il loro impegno nella didattica noi i metodi per l&#39;isolamento di dell&#39;organo del Corti. Inoltre, vorremmo ringraziare Ismaele Stefanov-Wagner per la progettazione degli elettrodi elettroporatore; Sherry Lin per le sue opere d&#39;arte che contribuiscono alla animazione video, e Matteo Chana, Jason Meeker, Kendra e Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) per la produzione del video. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI supporto di base per Hearing Research) dal dell&#39;NIDCD.

Giorno 1. Sterilizzazione e rivestimento dei coprioggetto di vetro. <ol><li> Secco sterilizzare coprioggetto microscopio vetro in autoclave. </li><li> Posizionare il coprioggetto sterilizzato in due pozzetti di una pre-sterilizzati quattro ben piatto di coltura cellulare. </li><li> Rivestire il coprioggetto con 1:1 poli-L-ornitina e laminina integrato con il 20% siero fetale bovino (FBS) notte a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> 400 microlitri poli-L-ornitina (soluzione 0,01% conservati a 4 ° C) </li><li> Laminina 400 microlitri (50 mg / ml soluzione stock conservato in aliquote a -20 ° C) </li><li> FBS 200 microlitri (conservato in aliquote a -20 ° C) </li></ol></li><li> Calore sterilizzare gli strumenti dissezione durante la notte in un 150 ° C incubatore. </li><li> Fai terreno di coltura contenente 10% siero e 10 mg / ml ampicillina. <ol class="lalpha"><li> 90 mL di coltura Dulbecco modificato Aquila Media </li><li> 5 FBS mL (conservato in aliquote a -20 ° C) </li><li> 5 ml siero di cavallo (conservato in aliquote a -20 ° C) </li><li> 10 L ampicillina (10 mg / ml soluzione madre conservato a 4 ° C) </li></ol></li></ol> 2 ° giorno. Isolamento dei dell&#39;organo del Corti. <ol><li> Sterilizzare il positivo cofano dissezione flusso. <ol class="lalpha"><li> accendere la luce UV per 20 minuti </li><li> spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo e attendere 5 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Decapitare il mouse cucciolo (P4) alla base del forame magno con le forbici operativo. </li><li> Brevemente lavare la testa in 10 piatti cm contenente etanolo al 70%. </li><li> Rimuovere l&#39;epidermide con un bisturi. </li><li> Aprire il cranio lungo la sutura sagittale con una lama di bisturi e poi dividono in due la proencefalo. Conservare la proencefalo caudale per la dissezione ulteriormente. </li><li> Rimuovere l&#39;, cervelletto e tronco encefalico proencefalo con dissezione smussa. </li><li> Togliere le ossa temporali (fig. 2A), passarli brevemente in etanolo al 70%, e trasferirli in un piatto contenente 3 millimetri HBSS sterile. </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere la bulla e il tessuto circostante dalla parte petrosa dell&#39;osso temporale. </li><li> Individuare la conchiglia a forma di chiocciola (fig. 2B) e separarla dal sistema vestibolare con pinze. </li><li> A questo stadio di sviluppo, il labirinto osseo non è completamente calcificato ed è facilmente sezionato con pinze. Rimuovere il labirinto osseo della coclea per separazione attento a partire dalla fine basale e lo spostamento apicale con pinze. </li><li> Il legamento spirale e organo di Corti è collegato a spirale lungo la spirale del modiolus (fig. 2C). Rimuovere con attenzione dell&#39;organo del Corti, garantendo il legamento spirale nella regione gancio della base con pinze e lo svolgimento come ci si sposta apicalmente. </li><li> Partendo dalla base, rimuovere il legamento spirale dalla dell&#39;organo del Corti con una pinza sottile # 55 (fig. 2D). Micro-isolamento dell&#39;organo di epitelio sensoriale Corti (opzionale). </li><li> Rimuovere l&#39;organo del Corti regione gancio della base con due siringhe da insulina ½ cc con permanentemente attaccato U-100 28G ½ aghi pinze. </li><li> Partendo dal vertice, togliere la spirale limbus dalla fila di cellule ciliate interne e procedere basale (fig. 2E-F). Placcatura dell&#39;organo del Corti espianto </li><li> Rimuovere la soluzione poly-L-ornithine/laminin/FBS dai pozzetti cultura e aggiungere 130 ml di terreno di coltura. </li><li> Trasferire l&#39;organo di Corti sezionato al coprioggetto vetro rivestito nella cultura bene e orientare l&#39;espianto in modo che le ciglia delle cellule dei capelli sono verso l&#39;alto. </li><li> Rimuovere il supporto nella cultura e con una pipetta 200 microlitri. Assicurarsi che la membrana basilare entra in contatto solido con il coprioggetti vetro rivestito. </li><li> Aggiungere con cautela 130 ml di terreno di coltura per l&#39;organo di Corti con una pipetta 200 ml. Applicare due gocce sulla superficie dell&#39;organo del Corti e poi aggiungere lentamente il restante volume a lato del coprioggetto. Assicurarsi che l&#39;organo del Corti non galleggia nei terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2. </li></ol> 3 ° giorno. Elettroporazione del gene reporter in organo colta di Corti. <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura dall&#39;organo della cultura Corti. </li><li> Aggiungere 130 microlitri di H 2 O per 1 minuto e poi rimuovere con una pipetta 200 microlitri. </li><li> Aggiungere 30 ml di giornalista DsRed plasmide (2 mg / mL H 2 O conservati a -20 ° C). </li><li> Anticipo gli elettrodi del elettroporatore utilizzando un micromanipolatore in modo che l&#39;anodo unocatodo ° sono su entrambi i lati della cultura. </li><li> Generare un impulso (27V, 30 ms di durata, 10 treni di impulsi) per electroporate il gene reporter nell&#39;organo della cultura Corti espianto. <ol class="lalpha"><li> Opzionale: invertire la polarità dell&#39;impulso per garantire elettroporazione del transgene su entrambi i lati e modiolar spirale legamento del espianto. </li></ol></li><li> Attendere 5 min. </li><li> Aggiungere 130 microlitri della Fugene 6: soluzione di DNA (3 parti Fugene a 2 parti di DNA). Questa soluzione deve essere preparata prima dell&#39;inizio della procedura di elettroporazione (passo 20) con un rotondo 3 ml fondo in polistirene di prova in una cappa a flusso laminare. Per rendere questa soluzione: <ol class="lalpha"><li> Aggiungere 2,4 ml di Opti-MEM (conservato a 4 ° C) per la provetta. </li><li> Aggiungere 0,6 ml di reagente Fugene 6 (conservato a 4 ° C) per la provetta. Assicurarsi di aggiungere il Fugene direttamente al Opti-MEM ed evitare il contatto diretto con i lati della provetta. </li><li> Vortex per 1 secondo. </li><li> Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2,0 microlitri DsRed giornalista plasmide DNA a doppia elica (conservati a -20 ° C a 100 DNA mg / ml aliquote H 2 O). </li><li> Vortex per 1 secondo. </li><li> Incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 200 ml di terreno di coltura. </li><li> Vortex per 1 secondo. </li></ol></li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura alla cultura bene e incubare per 37 ° C per un massimo di 10 giorni. </li></ol> Rappresentante Risultati Vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento dell&#39;organo del Corti da un mouse perinatale. La procedura può essere utilizzata per topi giovani come il giorno embrionale 16 fino a circa 6 giorni dopo la nascita, momento in cui il labirinto osseo diventa sufficientemente calcificate a rendere la dissezione ingombrante. Una volta che l&#39;organo del Corti è sezionato, può essere placcato e colto nella sua interezza (fig. 3) o come micro-isolati epitelio sensoriale (fig. 4). Abbiamo inoltre presentato una tecnica di esprimere geni esogeni nell&#39;organo colta di Corti. La cultura organotipica è utile per molti altri tipi di studio, come l&#39;analisi di organo del Corti genica mediante RT-PCR o ibridazione in situ, organo del Corti co-coltura con cellule gangliari a spirale o cellule staminali esogene utilizzando il micro-isolare 3, o in analisi in vitro di morte delle cellule e la rigenerazione dei capelli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Sezione dell&#39;organo P4 murino di Corti. (A) Una sezione trasversale a cavallo basale di una coclea cryosectioned ottenuto da un topo P4 illustra le strutture generali della coclea murino descritto in questo protocollo. I media scala è delimitato dal legamento spirale e stria vascularis lateralmente, la membrana del Reissner s superiormente, la spirale limbus medialmente, e la membrana basilare inferiormente. La casella indicata la regione espansa in B. (B) L&#39;organo del Corti si trova sul lato superiore della membrana basilare e comprende una fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne, e le loro rispettive cellule di sostegno. Linea tratteggiata 1 indica la posizione lungo la membrana basilare che viene rimosso durante questo organo di dissezione Corti. 2 linea tratteggiata indica la posizione lungo la membrana basilare che viene rimosso durante la micro-procedura di isolamento. Verde indica l&#39;etichettatura di immunoistochimica calbindin, che le etichette le cellule del limbus interdentale spirale, le cellule ciliate cocleari, i neuroni del ganglio spirale, così come le cellule del legamento spirale e vascularis 7 stria. DAPI etichettatura dei nuclei è in blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Figura 2. Organo di dissezione Corti. Immagini dal video che accompagna l&#39;organo di evidenziare dissezione Corti A) il sistema di coclea e vestibolare situato all&#39;interno dell&#39;osso temporale isolato (rosso), B), il labirinto osseo della coclea, C) il legamento spirale e collegato organo del Corti dopo la rimozione del labirinto osseo, D) la rimozione del legamento spirale e stria vascularis (rosso) dal dell&#39;organo del Corti, E) micro-isolamento dell&#39;epitelio sensoriale dal limbo spirale (rosso), e F) il isolato spirale limbus (a sinistra) e l&#39;epitelio sensoriale (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /></a> Figura 3. Colta organo di Corti espianto. DIC immagine che mostra l&#39;organo diCorti di un Atoh1-nGFP topo P4 che è stato isolato, placcato, e colto per cinque giorni come descritto. Questo mouse è stato geneticamente modificato in modo che le cellule che esprimono la pro-capelli genica su cellule omologo Atonal 1 (aka Atoh1 Math1) mostrano una proteina verde fluorescente che è localizzato al nucleo 8. Gli organi di Corti da questi topi presentano un&#39;etichetta nucleare GFP in tutti i nuclei delle cellule dei capelli e quindi permettono una facile visualizzazione dell&#39;epitelio sensoriale utilizzando un microscopio epifluorescente. La relativamente grande spirale limbus può essere vista laterale per l&#39;epitelio sensoriale. Cellule mesenchimali che hanno avuto origine dalla dell&#39;organo del Corti sono emigrati lontano dal espianto. Blue Label nucleare è DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /></a> Figura 4. Micro-isolati epitelio sensoriale. Epifluorescente immagine ottenuto dal epitelio sensoriale che è stato isolato da un organo P4 murino di Corti come descritto e colto durante la notte. Il micro-ceppo è stato poi fissato nel 4% paraformaldeide e trattati per immunomarcatura della 7a miosina che le etichette cellule ciliate cocleari. Si noti l&#39;assenza della spirale limbus comparativamente più dalla figura 3. Blue Label nucleare è DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /></a> Figura 5. Elettroporazione del gene reporter di DsRed nell&#39;organo colta di Corti. Interi organi di Corti da P4 Atoh1-nGFP cuccioli di topo sono state isolate, placcato, e poi elettroporate con il gene reporter DsRed come descritto e quindi visualizzati sotto un microscopio epifluorescente. Cellule dell&#39;organo di espianto Corti che hanno espresso la proteina transgenica giornalista DsRed cellule mostrano una fluorescenza rossa e endogena della mostra epitelio sensoriale una fluorescenza verde nucleare. Cellule transgeniche possono essere visti in tutto il limbus a spirale ed epitelio sensoriale.

<ol>
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Ci sono molti dettagli che sono fondamentali per il successo di questa procedura. Minore è il tempo dall&#39;isolamento osso temporale per organo di incubazione Corti, maggiore è la possibilità che gli organi che attribuirà alla coprioggetto e risultato nelle culture degli organi vitali. Pertanto, è importante limitare la quantità di tempo che intercorre tra la dissezione e l&#39;immissione degli organi nell&#39;incubatrice. La scelta dell&#39;antibiotico è cruciale, dato che molti antibiotici aminoglicosidici sono ototossici e può provocare la morte delle cellule dei capelli. Anche se è preferibile rinunciare all&#39;uso di antibiotici del tutto, questo lascia aperta la possibilità di contaminazione. Pertanto, si consiglia l&#39;uso di 10 mg / ml ampicillina come regola generale per superare problemi di contaminazione potenziale. L&#39;aspetto più fastidioso di questa, e altre procedure per la coltura primaria dell&#39;organo del Corti, è la tendenza degli organi di galleggiare fuori i piatti durante l&#39;incubazione. Anche se le culture organo galleggiante possono rimanere vitali per 5-7 giorni, ci sono svantaggi di organi coltura galleggiante. Per esempio, culture d&#39;organo galleggiante spesso piega su se stessi dopo 4-5 giorni di rendering microscopia problematico. Successivamente, l&#39;integrità strutturale di un organo può diventare compromessa rispetto agli organi che sono stati apposti i coprioggetto. Abbiamo scoperto che le seguenti tecniche contribuirà ad assicurare che l&#39;organo del Corti non galleggia in terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto. In primo luogo, cappotto coprioggetto il vetro in 1:1 polyornithine / laminina integrata con 20% FBS come descritto. La notte di incubazione previsto dal presente protocollo è il tempo minimo che il piatto deve essere rivestita. Nel nostro laboratorio, abbiamo spesso strato tutti i piatti di cui abbiamo bisogno per una settimana e tenerli a 4 ° C fino al giorno prima dell&#39;uso quando li passare al incubatore per una notte di incubazione. In secondo luogo, dopo che gli organi sono trasportati al coprioggetto rivestito, orientare l&#39;espianto in modo che le ciglia delle cellule ciliate a faccia in su. Questo orientamento facilita l&#39;aderenza della membrana basilare per il piatto cultura. In terzo luogo, rimuovere il supporto all&#39;interno del pozzo di apporre l&#39;espianto al piatto rivestito. Questo garantirà il contatto tra il piatto della cultura e della membrana basilare e migliorare la capacità del espianti di aderire al vetro. Ciò contribuirà anche a mantenere l&#39;integrità strutturale del file di cellule ciliate. Infine, attenzione a goccia 2 gocce di terreno di coltura sulla superficie dell&#39;organo del Corti con una pipetta 200 microlitri capacità e poi, lentamente, riempire il pozzo da gocciolamento del volume residuo (del totale 130 mL) sul lato del coprioggetto. E &#39;importante lavorare rapidamente per assicurare l&#39;attaccamento dell&#39;organo del Corti alla coprioggetto rivestito. Dalla data di apertura della dissezione per l&#39;incubazione del espianti, che in genere dura 10 minuti per un operatore praticato per completare questa procedura di isolamento organo di Corti. In questo protocollo, si presentano anche un metodo per la micro-isolamento dell&#39;epitelio sensoriale dal limbo spirale dell&#39;organo del Corti. In questa procedura, il limbus spirale è sezionato dalla epitelio sensoriale utilizzando aghi 28G ½ insulina come strumenti di dissezione. La risultante micro-isolare costituito le file di cellule ciliate e le corrispondenti celle di supporto (fig. 3). L&#39;epitelio sensoriale isolato può essere colto come descritto in questo protocollo. Questo micro-isolamento procedura deve essere confrontata con la separazione enzimatica degli epiteli sensoriali dal tessuto circostante 4. Nei mammiferi, così come non-mammiferi specie come polli, digestione thermolysin di isolati risultati vestibolare organi nell&#39;isolamento degli epiteli sensoriali dalle cellule mesenchimali seminterrato 4. Nel ratto coclea, i risultati digestione thermolysin nella separazione della cresta epiteliale maggiore, minore cresta epiteliale e di accompagnamento epiteli sensoriali dalla membrana basale 5. Tuttavia, non è chiaro se l&#39;epitelio sensoriale cocleare possibile allegare alle piastre di rivestimento senza l&#39;accompagnamento delle cellule mesenchimali. Mentre sia la micro-meccanica e di isolamento metodo enzimatico risultato metodo della digestione, la separazione degli epiteli sensoriali dal limbo spirale, i vantaggi della micro-dissezione isolare il digestione thermolysin includere un protocollo relativamente più brevi, meno costosi reagenti, e lo stress potenzialmente meno di l&#39;espianto a causa degli effetti della digestione enzimatica. Inoltre, la membrana basale è lasciata intatta in questo approccio, che può aumentare l&#39;attaccamento dell&#39;epitelio sensoriale alla piastra di coltura. Gli svantaggi di questo metodo comprendono la necessità di sviluppare le competenze di questa delicata dissezione e potenziali danni meccanici per l&#39;epitelio sensoriale derivante dalla dissezione micro. Come esempio dell&#39;utilità di questa procedura, si presentano anche un esempio dell&#39;uso dell&#39;organo diCulture Corti, l&#39;elettroporazione di geni esogeni nella cultura espianto. La procedura sopra descritta elettroporazione si basa su precedenti metodi di elettroporazione organo del Corti. In particolare, Zheng e Gao (2000) descrivono l&#39;elettroporazione di organi isolati di ratto delle Corti dove si svolgono le espianti in vigore per l&#39;elettroporazione di una scanalatura di costruzione della agarosio e poi placcato sul collagene rivestito 8-scivolo LabTek bene in mezzo privo di siero 2. Un vantaggio di questo approccio è che gli organi sono orientate in modo che la superficie superiore del espianti faccia il catodo, che teoricamente dovrebbe portare a una distribuzione uniforme delle cellule elettroporate attraverso l&#39;espianto. Nelle nostre mani tuttavia, il metodo che descriviamo migliorato su questa procedura perché l&#39;organo del Corti è rimasto apposta sul coprioggetto durante tutta la procedura in modo da ridurre la manipolazione degli espianti dopo l&#39;elettroporazione. Inoltre, una percentuale più alta di organi di Corti rimasta unita al copri con questo metodo presentato. Il nostro metodo è tratto da Jones et al. (2006) che utilizza l&#39;aggiunta della Fugene 6 reagente per aumentare l&#39;efficienza di espressione genica dopo l&#39;elettroporazione. Nel Jones et al. (2006) il protocollo, gli organi sono elettroporate, incubate per 5 minuti con 100 ml di Fugene 6 reagenti di trasfezione, e placcato 6. Il nostro metodo si differenzia per l&#39;uso di un rapporto 3:2 di Fugene 6 reagente al DNA plasmide, che abbiamo trovato empiricamente per fornire ottimale espressione transgenici con minima tossicità d&#39;organo. Non usiamo puro Fugene 6 reagente, il che può causare tossicità per le colture. La configurazione degli elettrodi nel nostro protocollo, così come Jones et al. (2006), si traduce in espressione genica primario sia la spirale limbus o epitelio sensoriale a seconda della posizione del catodo. Anche se ci sono DsRed cellule positive sul versante della cultura distante verso il catodo, vi è una maggiore concentrazione di cellule transgeniche più vicino al catodo. Per assicurare una completa espressione del transgene in entrambi i lati dell&#39;organo del Corti espianto, la corrente può essere invertita per un treno di impulsi secondo semplicemente invertendo i cavi. I risultati presentati in protocollo l&#39;espressione del transgene robusta in tutto l&#39;organo del Corti (fig. 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

In tutti i mammiferi, l&#39;epitelio sensoriale per audizione si trova lungo l&#39;organo spirale del Corti che risiede all&#39;interno della coclea conchiglia a forma dell&#39;orecchio interno (fig. 1). Cellule ciliate della coclea sviluppo, che sono le cellule mechanosensory del sistema uditivo, sono allineate in una fila di cellule ciliate interne e tre (nella base e la metà di giri) a quattro (nel giro apicale) file di cellule ciliate esterne che abbracciano la lunghezza del dell&#39;organo del Corti. Cellule ciliate trasdurre vibrazioni meccaniche suono indotto della membrana basilare in impulsi nervosi che il cervello può interpretare. La maggior parte dei casi di sordità neurosensoriale sono causati dalla morte o la disfunzione delle cellule ciliate cocleari. Uno strumento sempre più essenziale nella ricerca uditiva è l&#39;isolamento e la coltura in vitro di espianti di organi 1,2,9. Una volta isolato, il espianti possono essere utilizzati in diversi modi per fornire informazioni riguardanti normative, anomalo, o fisiologia terapeutico. Espressione genica, la motilità stereociglia, biologia cellulare e molecolare, nonché approcci biologici per la rigenerazione delle cellule dei capelli sono esempi di applicazioni sperimentali di organo del Corti espianti. Questo protocollo descrive un metodo per l&#39;isolamento e la cultura dell&#39;organo del Corti da topi neonati. Il video che accompagna include le direzioni a tappe per l&#39;isolamento dell&#39;osso temporale da cuccioli mouse e successivo isolamento della coclea, legamento spirale, e organo di Corti. Una volta isolata, l&#39;epitelio sensoriale può essere placcato e coltivate in vitro nella sua interezza, o come un ulteriore sezionato micro-isola che manca la spirale limbo e dei neuroni del ganglio spirale. Usando questo metodo, gli espianti primari può essere mantenuta per 7-10 giorni. Come esempio dell&#39;utilità di questa procedura, organo del Corti espianti sarà elettroporate con un gene esogeno giornalista DsRed. Questo metodo fornisce un miglioramento rispetto ad altri metodi pubblicato in quanto fornisce indicazioni riproducibile, senza ambiguità e graduale per l&#39;isolamento, microdissezione, e la cultura primaria dell&#39;organo del Corti.

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Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Questa procedura descrive un metodo per l&#39;isolamento e la cultura dell&#39;organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l&#39;espressione di un gene esogeno giornalista nell&#39;organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.7K Views.  Harvard Medical School. Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.

Video: Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Elettroporazione di micobatteri

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Svelare l'artrite infiammatoria: esplorare le funzioni delle cellule sinoviali

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. It is important to understand the functions of both cell populations to reveal the mechanisms underlying pathological progression and remission in inflammatory arthritis. In general, in vitro experimental conditions should mimic the in vivo environment as much as possible. Primary tissue-derived cells have been used in experiments characterizing synovial fibroblasts in arthritis. In contrast, in experiments investigating the biological functions of macrophages in inflammatory arthritis, cell lines, bone marrow-derived macrophages, and blood monocyte-derived macrophages have been used. However, it is unclear whether such macrophages actually reflect the functions of tissue-resident macrophages. To obtain resident macrophages, previous protocols were modified to isolate and expand both primary macrophages and fibroblasts from synovial tissue in an inflammatory arthritis mouse model. These primary synovial cells may be useful for in vitro analysis of inflammatory arthritis.

Autore in primo piano: Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina  

The present study provides a modified protocol to isolate synovial macrophages and fibroblasts from murine inflammatory arthritis tissue.

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...