Tutte le procedure sono state approvate dalla University of Wisconsin commissione per cura degli animali ed erano in conformità alle direttive NIH. Ringraziamo il Dott. Katherine Kalil per l&#39;uso generoso del suo dispositivo Nucleofector. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Dent per commenti sul protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01-NS064014, Dana Foundation e Whitehall Fondazione EWD Christopher Viesselmann, Jason Ballweg e Derek lombardo contribuito in maniera uguale a questo articolo.

1. Preparazione di Coprivetrini e delle Camere <ol><li> Preparazione del coprioggetto pulito e camere è essenziale per le culture sane. Scorciatoie non dovrebbe essere presa in qualsiasi di questi passaggi. </li><li> Lavare i coprioggetti (rotondo 12 mm o 22 mm, vetro tedesco - Carolina Marca Assistant) pernottamento in acido nitrico concentrato (HNO3) in un vaso di vetro dedicato o bicchiere. </li><li> Togliere i coprioggetti dai acido nitrico e lavare ampiamente (5-7x) in acqua deionizzata. </li><li> Separare il coprioggetto ed asciugare in una cappa a flusso laminare o un armadietto biosicurezza. Una volta asciutta, li sterilizzare con raggi UV per 30 minuti. Luogo sterilizzato coprioggetto in una sterile piatti di Petri per la conservazione. Se i neuroni placcatura su vetrini coprioggetto 12 millimetri direttamente posto in un piatto sterile da 35 mm e passare alla Sezione 2. </li><li> Camere di imaging sono costruite da 15 millimetri perforazione di un foro nella parte inferiore di 35mm piastre Petri (rimuovere tutte le sbavature) e allegando il coprioggetto pulito con una miscela 03:01 di paraffina e di vaselina. </li><li> Fate sciogliere la paraffina / petrolio miscela gelatina in un tubo conico all&#39;interno di un bagno di acqua bollente. Utilizzare un pennello piccolo strato di vernice e la parte inferiore del piatto attorno al foro 15mm. Assicurarsi di mantenere mescolare la paraffina / petrolio miscela gelatinosa come si separeranno. Questo di solito si traduce in camere incollati insieme con una maggiore concentrazione di vaselina, che diventerà viscoso quando i piatti sono posti in incubatrice, con conseguente distacco coprioggetto. La paraffina rimanenti / vaselina può essere conservato a temperatura ambiente. </li><li> Collocare il piatto capovolto su un vassoio piatto e posizionare il vetrino sul foro. Calore nel forno a 80 ° C fino miscela paraffina è sciolto (~ 10 minuti). Rimuovere i piatti su una superficie piana e lasciare che la miscela di paraffina. </li><li> Girare i piatti più e sterilizzare sia l&#39;interno delle copertine e il fondo delle camere con raggi UV. </li><li> Coprioggetto cappotto o regioni bicchiere di camere con 1.0mg/mL Poly-d-lisina (30kDa) in tampone borato (borato di sodio 0,1 M, pH 8,5) per un&#39;ora. Lavare 3-5 volte con abbondante acqua deionizzata di grado coltura dei tessuti. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di tampone borato. Asciutto e utilizzare immediatamente o conservare camere / lamelle per un uso successivo. Noi di solito utilizzare coprioggetto pulito entro un mese dalla preparazione. </li></ol> 2. Preparazione dei Dissection neuronale e medie Cultura <ol><li> Preparare il supporto dissezione (DM) con l&#39;aggiunta di quantità appropriata di HBSS 10x e HEPES 100X all&#39;acqua grado coltura dei tessuti. Conservare a 4 ° C. Tenere sul ghiaccio durante la dissezione. </li><li> Il giorno prima della dissezione preparare la placcatura medio (PM) e mezzo privo di siero (SFM). PM è costituito da medie Neurobasal, B27 supplemento, 2 mM glutammina, 0,3% di glucosio, 37.5 mM NaCl e il 5% di siero fetale bovino (FBS). SFM consiste in Medio Neurobasal, B27 supplemento, 2 mM glutammina, 0,3% di glucosio e del 37,5 mM NaCl. </li><li> Fare solo sufficiente per la dissezione e conservare in una cultura dei tessuti durante la notte con il tappo incubatore leggermente socchiusa in modo che i 2 contenuti temperatura e CO della equilibra mezzo. Aggiungiamo glucosio in più e aumentare la osmolalità a circa 310mOsm con NaCl. Troviamo le culture fare meglio in una osmolalità più fisiologico (osmolalità Neurobasal è tipicamente 205-245mOsm). </li></ol> 3. Gliali strato corticale Preparazione Alimentatore per lungo termine Culture <ol><li> Se a lungo termine le culture devono essere preparati, di eseguire questa parte di due o tre settimane il protocollo prima di continuare con la dissezione corticale o dell&#39;ippocampo. </li><li> Preparare medio gliali (GM) con MEM, 0,3% di glucosio, penicillina / streptomicina e siero di cavallo 10%. </li><li> Euthanize P1-P3 cuccioli di topo da un raffreddamento in ghiaccio per 5 minuti. Rimuovere ogni cucciolo dal ghiaccio e spruzzare con il 70% di etanolo. Velocemente decapitare con le forbici. Rimuovere l&#39;intero cervello di un piatto contenente freddo DM (punto 2.1). </li><li> Rimuovere i due emisferi cerebrali e meningi. Accise la neocorteccia e trasportarlo in un nuovo piatto che contiene alcun supporto. Preparare cortecce da 4 cervelli totale. </li><li> Tritare le cortecce con un panno pulito, lama di rasoio sterile più finemente possibile e rimuovere il tessuto tagliato con una pipetta di plastica per un tubo da 50 ml conica contenente 12 ml di freddo DM. Aggiungere tripsina e DNasi a concentrazioni finali dello 0,25% (1,5 ml) e lo 0,1% (1,5 ml), rispettivamente. Incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 10 minuti, rimestando intermittente. </li><li> Rimuovere la provetta contenente il tessuto corticale e pulire accuratamente con etanolo al 70% prima di portare all&#39;interno della cappa coltura di tessuti. Pipettare tessuto corticale su e giù con una pipetta 10 ml circa 10-15 volte, o fino a quando la maggior parte pezzi di scomparire. </li><li> Ritorna il tubo a 37 ° C a bagnomaria per altri 10 minuti con intermittente vorticoso. </li><li> Pulire accuratamente il tubo con il 70% di etanolo e riportarlo alla cappa coltura dei tessuti. Pipettare il tessuto corticale su e giù con un 5 mL pipetta di circa 10-15 volte, o fino a quando i pezzi di scomparire. </li><li> Aggiungere 15 mL di caldo GM e centrifugare a 200xg (1000rpm) per 10 minuti. </li><li> Gettare il surnatante, risospendere le cellule pellet in 20 ml di fresca GM e contare con un emocitometro. Tavola 5-7.5x10 6 celle in 15 ml di GM per 75 centimetri 2 pallone. </li><li> Dopo un giorno e ogni 2-3 giorni successivi in ​​coltura, staccare le cellule allentato battendo il pallone contro la mano. Rimuovere il supporto insieme a tutte le cellule sloggiato e sostituire con 15 ml di fresca GM. </li><li> Glia può essere raccolto dopo 1-2 settimane di crescita in fiaschi, quando sono circa 70-100% confluenti. Per preparare coprioggetto singoli rivestiti con glia, posto 6 acido nitrico puliti e sterilizzati coprioggetto 25 millimetri rotonda in un piatto da 10 cm, e posto 3 punti della miscela 03:01 di paraffina / vaselina su ogni vetrino in uno schema triangolare con un pennello piccolo . Trattare piatti aperti con luce UV per 30 minuti. Rivestire il coprioggetto con 0,1 mg / mL Poly-d-lisina (30kDa) in tampone borato per un&#39;ora, poi lavare ampiamente (3-5x) con acqua sterile grado coltura tissutale deionizzata e lasciare asciugare. </li><li> Rimuovere il gliali contenenti pallone di incubatore, eliminare il medio e sciacquare con 5 ml di pre-riscaldato tripsina / EDTA soluzione. Rimuovere la tripsina / EDTA soluzione dal pallone e Pipettare 3 ml di fresca pre-riscaldato tripsina / EDTA nel pallone. Incubare il pallone per 1 minuto a 37 ° C prima di aggiungere 5 ml di GM per fermare il tripsinizzazione. </li><li> Rimuovere la glia da pallone ripetuto pipettaggio 10-15 volte, e poi trasferire i media ad un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200xg (1000rpm) per 8 minuti. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 ml di GM, le cellule conta, e la piastra di 5x10 5 cellule in 12,5 ml di GM per piatto 10 centimetri contenente i coprioggetti. </li><li> Scambiare il mezzo con fresca preriscaldata GM ogni 2-3 giorni. Il giorno prima della dissezione neurone, rimuovere il GM e sostituirlo con SFM (sezione 2.2). Utilizzare questa gliali condizionata SFM al passo 4,12, quando le inondazioni culture corticale o ippocampale. </li></ol> 4. Dissezione corticale e / o ippocampale ed elettroporazione <ol><li> Rimuovere quantità appropriata di soluzioni nucleofection (Lonza), unire e riscaldare a temperatura ambiente prima di iniziare la dissezione. Dal momento che la soluzione Nucleofection ha una durata limitata se combinati, si limita a combinare l&#39;importo necessario per ogni preparazione (100 microlitri per trasfezione). </li><li> Eutanasia di un mouse incinta E15.5 con CO 2 (giorno della spina è E0.5) e togliere l&#39;utero per una piastra di Petri di 10 cm. Rimuovere i feti e decapitare in freddo DM (paragrafo 2.1). </li><li> Rimuovere l&#39;intero cervello in un piatto separato di freddo DM e con un ago di tungsteno piegato, rimuovere entrambi neocortices. Rimuovere le meningi con microforceps e corteccia posto in nuovo piatto di freddo DM. Con una forbice piccola iris o Wecker, togliere la corteccia e ippocampo e posto in una provetta Eppendorf 1,5 ml riempito con 1,0 mL di freddo DM. Tenere questo provetta in ghiaccio. </li><li> Dopo dissezione tutti cortecce o dell&#39;ippocampo, aggiungere 110 ml di tripsina 2,5% per il tubo Eppendorf contenente il tubo del tessuto e porlo in un incubatore a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare cortecce o dell&#39;ippocampo con 1,0 mL PM (sezione 2.2) delicatamente invertendo il tubo Eppendorf. Ripetere il lavaggio due volte, lasciando 1 mL di PM nel tubo. </li><li> Triturare i pezzi 15 volte con una pipetta P1000, e rimuovere le cellule surnatante / a un nuovo tubo 15 ml contenente 4 ml di PM, lasciando tutti pezzi che rimangono in provetta Eppendorf. </li><li> Spin i 15 ml al tubo 20xg (350rpm) per 7 minuti con il freno. Scartare il surnatante e aggiungere 100 ml di premiscelati, soluzione nucleofection temperatura ambiente (Lonza) per ogni trasfezione. Triturare 5 volte con un delicato movimento su e giù della pipetta P1000. </li><li> Rimuovere 100 l di miscela nucleofection soluzione / cella ad ogni provetta Eppendorf nuovi e aggiungere la giusta quantità di DNA. A lungo termine culture generalmente usiamo 1-2μg di DNA per trasfezione. Tuttavia, questa etichetta solo una piccola percentuale &lt;10% dei neuroni nella cultura. Generalmente usiamo 5-10μg di DNA per trasfezione se vogliamo efficienza di trasfezione superiore per breve termine cultura. Abbiamo usato fino ad un totale di 40μg di DNA quando trasfezione con due plasmidi diversi. I plasmidi sono memorizzati in TE buffer 1μg / mL. </li><li> Aggiungi sospensione cellulare / DNA alla cuvetta (Lonza) e electroporate le cellule del Nucleofector (Lonza), utilizzando il programma di O-005 (SNC topo neuroni). </li><li> Lavorare velocemente, aggiungere 500 microlitri di PM pre-riscaldato ed equilibrato alla cuvetta e rimuovere soluzione / cellule ad un nuovo tubo di 1,5 ml Eppendorf. Aggiungi PM abbastanza per portare il volume di ogni trasfezione a 1,0 ml. Contare le cellule con un emocitometro e piastra a 3-5x10 3 celle / cm 2 per le culture giovani, o 5-10x10 3 celle / cm 2 di lunga durata culture. &lt;/ Li&gt; <li> Per le colture a breve termine, inondare la cultura piatti da 35 mm con 2,0 ml di riscaldato, CO 2-SFM equilibrato dopo un&#39;ora di placcatura. Se si utilizza coprioggetto, togliamo la metà del PM e sostituirlo con SFM, quindi ripetere due volte. O le inondazioni delle camere di imaging o lavare i risultati coprioggetto in un bassissimo contenuto di siero (&lt;0,5%). Colture a breve termine non hanno bisogno di essere coltivato con uno strato alimentatore gliale e non hanno bisogno di essere ri-alimentata. </li><li> A lungo termine le culture, togliamo un coprioggetto glia coperto contenente tre puntini di paraffina / vaselina e capovolgere sopra il foro 15 mm di piatto da 35 mm, un&#39;ora dopo placcatura iniziale. Due millilitri del SFM condizionato dal piatto gliali viene quindi aggiunto alla camera di imaging. Per alimentare a lungo termine le culture, togliamo un terzo del SFM ogni 2-3 giorni e sostituirlo con fresco, pre-riscaldata e CO 2-SFM equilibrato. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vivere i neuroni dell&#39;ippocampo in fasi successive di sviluppo. Immagini associati di rappresentante vivente neuroni dell&#39;ippocampo sono mostrati sia come immagine contrasto differenziale di interferenza e di un microscopio a fluorescenza corrispondente. Ognuna di queste cellule è stata transfettate con EGFP-tubulina e DsRed2 in vettori pCAX. I neuroni sono stati fotografato nei giorni seguenti in vitro (DIV): Fase 1 (1DIV), Fase 2 (1DIV), Stage 3 (2DIV), Stage 4 (11DIV) e Stage 5 (32DIV). Barra di scala è 20μm.

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	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo per la coltura embrionali di topo neuroni dell&#39;ippocampo e della corteccia è stato sviluppato come una modifica del protocollo Banker, che utilizza ratto 1,2 neuroni. Abbiamo usato questo protocollo per il mouse coltura e neuroni criceto anche 3,4,5,6,7. Questo protocollo funziona altrettanto bene per entrambi i neuroni dell&#39;ippocampo e neocorticale, è simile ad un protocollo pubblicato da Meberg e Miller 8. In generale, usiamo i neuroni dell&#39;ippocampo a lungo termine cultura, perché sono ben caratterizzati e un sistema modello più affermati. Inoltre, essi possono contenere una popolazione più omogenea di neuroni che neocorteccia. Tuttavia, i neuroni neocorticali colto utilizzando questo protocollo anche sopravvivere e differenziarsi in modo simile (dati non pubblicati). Noi abitualmente uso neuroni dell&#39;ippocampo e neocorticale per breve termine cultura. Dissezione di neocorteccia risultati anche nei neuroni sostanzialmente più (1.5x10 6 neuroni per coppia di cortecce) rispetto alla dissezione dell&#39;ippocampo (2.5x10 5 neuroni per ogni coppia di ippocampo), che lo rende una scelta migliore dei materiali per il Western blotting, per esempio. Come per ogni coltura primaria, è essenziale ridurre al minimo il tempo impiegato dalla morte dell&#39;animale per la placcatura delle cellule. Si assumerà generalmente 10-20 dissezioni per diventare sempre veloce a dissezione e placcatura. Inoltre, quando si lavora con la Nucleofector Lonza, è fondamentale per lavorare velocemente durante la procedura di elettroporazione, in quanto la vitalità dei neuroni decresce rapidamente se sono rimasti nel buffer nucleofection. Gran parte della nostra immagine è condotta con un totale di microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRFM). Questo tipo di microscopia è solo in grado di imaging diverse centinaia di nanometri al di là del coprioggetto. Pertanto, le aree dei neuroni che spesso l&#39;immagine, il cono di crescita assonale e spine dendritiche, devono essere rispettate direttamente al coprioggetto. Quindi, usiamo le culture a bassa densità che richiedono alimentazione gliali a lungo termine cultura. Abbiamo usato le culture più alta densità (&gt; 2x10 4 cellule / cm 2), senza strati alimentatore gliali, a lungo termine le culture e hanno scoperto che sopravvivono molto bene con l&#39;alimentazione poco. Tuttavia, le spine dendritiche di questi neuroni sono spesso troppo lontano dal substrato di immagine in TIRFM, anche se possono essere facilmente rilevato con grande campo microscopia o microscopia confocale. Nella maggior parte dei nostri studi abbiamo trasfezione neuroni prima della placcatura, e hanno ripreso le proteine ​​fluorescenti marcate per un massimo di tre mesi in cultura. Questo a lungo termine espressione di proteine ​​fluorescenti con etichetta ci dà fiducia che utilizzando basse concentrazioni di DNA (1-2μg) non producono artefatti sovraespressione nei neuroni. Tuttavia, questa procedura può essere utilizzata anche per studiare l&#39;iperespressione delle proteine ​​se elevate quantità di DNA siano usati (10-20μg). I plasmidi che usiamo per trasfettare neuroni di solito contengono proteine ​​di fusione EGFP o mCherry, anche se abbiamo anche l&#39;etichetta del citoplasma neuronale con DsRed2 EGFP o da soli. Questa tecnica di elettroporazione funziona bene con un certo numero di vettori. Noi preferiamo plasmidi che contengono un β-actina promotore con un potenziatore CMV e β-globina poli-Una coda (pCAGGs o pCAX plasmidi) 9, a causa dei livelli relativamente alti di espressione, e il fatto che non siano ben tollerate dai neuroni in entrambe le culture a breve e lungo termine. In generale, le proteine ​​cominciano a esprimere entro circa 4 ore di placcatura e raggiungere livelli sufficienti per l&#39;imaging in 10-24 ore 10. Abbiamo utilizzato con successo CMV-promotore-driven plasmidi culture in breve termine, ma hanno scoperto che possono causare alti livelli di iperespressione che uccidono i neuroni a lungo termine cultura. Tuttavia, abbiamo trovato che il condizionamento gliali di culture a bassa densità aiuta con la sopravvivenza dei neuroni transfettate con plasmidi CMV-promotore guidato, rispetto a maggiore densità (non alimentato gliali) culture.

* La maggior parte dei reagenti che conservare a -80 ° C possono essere conservati a -20 ° C pure. La conservazione a -80 ° C allunga la loro durata e dei risultati in culture un po &#39;più consistente.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

Neuroni dell&#39;ippocampo e della corteccia sono stati ampiamente utilizzati per studiare il sistema nervoso centrale (SNC) polarizzazione neuronale, assone / dendrite escrescenza, e formazione di sinapsi e la funzione. Un vantaggio di coltura di questi neuroni è che essi prontamente polarizzano, formando assoni e dendriti distintivo, su un substrato a due dimensioni a densità molto bassa. Questa proprietà li ha resi estremamente utile per determinare molti aspetti dello sviluppo neuronale. Inoltre, fornendo condizionata gliali di questi neuroni che continuerà a svilupparsi, formando funzionali connessioni sinaptiche e sopravvivere per diversi mesi nella cultura. In questo protocollo abbiamo delineare una tecnica per analizzare, alla cultura e trasfezione embrionali di topo neuroni dell&#39;ippocampo e della corteccia. Transfezione è compiuta electroporating DNA nei neuroni prima della placcatura via nucleofection. Questo protocollo ha il vantaggio di esprimere proteine ​​di fusione fluorescenti-tagged presto nello sviluppo (~ 4-8 ore dopo la placcatura) per studiare la dinamica e la funzione delle proteine ​​durante la polarizzazione, escrescenza assone e la ramificazione. Abbiamo anche scoperto che questo trasfezione singolo prima della placcatura mantiene fluorescenza-tagged espressione della proteina di fusione a livelli adeguati per l&#39;imaging per tutta la durata del neurone (&gt; 2 mesi in cultura). Così, questa metodologia è utile per studiare la localizzazione e funzione delle proteine ​​durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale con interruzioni poca o nessuna funzione neuronale.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell&#39;ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.2K Views.  University of Wisconsin-Madison. Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell'ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...