Siamo grati a S. Arber per i topi mGFP e ai membri del laboratorio Zervas che criticamente leggere il giornale e ha fornito assistenza tecnica. A. Brown è stato sostenuto da un premio cervello Estate Science Research Kaplan Graduate. E. Normand è stato sostenuto da un premio Scienza Brain Research Graduate Program. Questa ricerca è stata finanziata con fondi di ricerca di avvio (MZ).

Tamoxifene Preparazione e orale procedura Gavage (E8.5) <ul><li> Preparare un 20 mg / ml soluzione madre di tamoxifene sciogliendo tamoxifen in fase di pre-riscaldato l&#39;olio di mais. </li><li> Incubare la soluzione a 37 ° C per 2 ore in un vortice nutator e intermittente. </li><li> Proteggere lo stock tamoxifene dalla luce, conservare a 4 ° C, e l&#39;uso per un massimo di un mese. </li><li> Per gli esperimenti di mappatura destino, stabilire una coppia di riproduttori costituito da un Webster svizzero femminile (tipo selvatico; acquistati da Taconic) e un maschio che trasportano sia un gene specifico Creer allele T e un allele giornalista. A scopo dimostrativo, stiamo usando Wnt1-créer T; maschi mGFP (Ellisor 2009). </li><li> Controllare svizzera femmine Webster ogni mattina per la comparsa di un tappo vaginale. Designare la mattina (0900) della giornata è visto un tappo vaginale di 0,5 giorni dopo il coito e calcolare la data di somministrazione Tamoxifene sulla base di questo punto di partenza. (Per questo esperimento, il giorno embrionale 8,5 è stato utilizzato). </li><li> Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago da alimentazione degli animali (20G x 1-1/2) di elaborare 200 ul della soluzione di riserva Tamoxifene (4 mg di tamoxifene). </li><li> Trattenere saldamente il tempo incinta svizzero femminile Webster afferrando la nuca del collo e della schiena per immobilizzare la testa e girare in modo che il lato ventrale è rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Tenere la coda tra le dita libere di mantenere il corpo in linea retta. </li><li> Posizionare l&#39;ago di alimentazione in un angolo della bocca e dolcemente guidare l&#39;ago lungo il tetto della bocca. </li><li> Ruotare l&#39;ago in modo che sia parallelo al corpo, allo stesso tempo inclinando la testa all&#39;indietro per mantenere il collo dritto. </li><li> Guidare l&#39;ago giù nell&#39;esofago, verso lo stomaco. Fare attenzione a non entrare nella trachea. Se c&#39;è resistenza sul ferro, si impegna riflesso dell&#39;animale bavaglio, o se il mouse lotte, rimuovere immediatamente l&#39;ago e provare di nuovo la sonda gastrica. </li><li> Una volta che l&#39;ago di alimentazione è nello stomaco, amministrare il Tamoxifene nello stomaco e tornare la donna alla sua gabbia a casa fino alla data di dissezione. </li></ul> Craniotomia: <ul><li> Intracardially profumato il destino adulto mappati del mouse con il 4% PFA e togliere la testa con le forbici, tagliando attraverso la colonna vertebrale appena sopra le spalle. </li><li> Eseguire un bisturi lungo la linea mediana dorsale della testa (rostrale per caudale) per tagliare il cuoio capelluto e esporre il cranio. </li><li> Utilizzando il bisturi, raschiare via qualsiasi tessuto in eccesso o muscolo lungo il lato e posteriore del cranio. </li><li> Con una pinza, forare il cranio sulla linea mediana appena anteriore del bulbo olfattivo e creare un piccolo foro per accogliere la punta delle forbici. </li><li> Inserire le forbici bene in questo foro e fare un&#39;incisione mediale a laterale circa la lunghezza dei bulbi olfattivi. Questo taglio si romperà il cranio all&#39;incrocio tra l&#39;osso nasale e osso frontale e forniscono un facile accesso per le forbici. </li><li> Tagliare lungo le suture sagittale del cranio (dorsale linea mediana) evitando di mettere le punte angolate forbice di distanza dal cervello per evitare di danneggiare il tessuto sottostante. </li><li> Afferrare delicatamente il cranio con una pinza e staccarsi l&#39;osso lungo l&#39;incisione mediale per esporre il cervello. Il cranio può chip di fuori in piccoli pezzi o staccarsi in grandi sezioni. Continuare a utilizzare il forcipe per rimuovere tutti il ​​frontale, ossa parietali, interparietale e occipitale. </li><li> Rompere le ossa che stringe la paraflocculi (che si trova lungo i bordi laterali del cervello a livello del cervelletto), pizzicando le ossa sferiche su ciascun lato. Delicatamente tirare fuori le ossa. </li><li> Girare la testa in giù (lato dorsale verso il basso) e utilizzare le pinze per tagliare i nervi cranici e rilasciare il cervello dal cranio. </li></ul> Intero monte Microscopia: cervello adulto <ul><li> Valutare cervello adulto per GFP marcatura utilizzando un ambito fluorescente dissezione. </li><li> Trasferimento cervello a una piastra di Petri contenente PBS e fotografare utilizzando PictureFrame o altri software appropriato. </li></ul> Intero monte Microscopia: E12.5 embrioni <ul><li> Valutare gli embrioni montare tutto per GFP marcatura utilizzando un ambito fluorescente dissezione. </li><li> Trasferimento quelli che sono GFP positive da montare tutta una piastra di Petri contenente PBS e fotografare utilizzando PictureFrame o altri software appropriato. </li><li> Usare pinze per pizzicare fuori un piccolo pezzo di coda di ogni embrione, posto ogni pezzo in un tubo di PCR e genotipo del tessuto mediante PCR (Ellisor 2009) per entrambi gli alleli per confermare i risultati visti attraverso l&#39;analisi montare tutto. </li></ul> Micro-dissezione e preparazione espianto del mesencefalo ventrale da E12.5 embrioni <ul><li> In seguito a dissezione dalla catena uterina e identificazione del destino-mapped embrioni da tutto il montaggio a fluorescenza, il trasferimento di embrioni ghiacciata PBS sterile in un piatto di coltura cellulare. </li><li> Utilizzando le forbici fine, rimuovere la porzione testa dell&#39;embrione taglio trasversalmente, caudale a rhombomere 1. </li><li> Successivamente, rimuovere la porzione rostrale della testa con un taglio coronale attraverso il diencefalo. Questo esporrà un tubo-come la struttura in cui il quarto ventricolo attraverso il modulo di vescicola mesencefalico un condotto tra tessuti dorsale e ventrale. </li><li> Inserire con attenzione i suggerimenti forbice nel ventricolo 4, e tagliare lungo la linea mediana dorsale, caudale a rostrale, aprire completamente il tubo, creando una preparazione &quot;libro aperto&quot;. Il mesencefalo ventrale sarà ora esposto medialmente, mentre le due metà dorsale del mesencefalo risiederà lateralmente. </li><li> Rimuovere qualsiasi residuo non tessuto neurale sotto il mesencefalo ventrale in modo che il tessuto di gettare nuove categoricamente. Se necessario, fare tacche negli aspetti rostrale e caudale tale che il dorsale &quot;ali&quot; del espianto getterà piatto pure. L&#39;espianto dovrebbe assomigliare ad una &quot;farfalla, in cui il mesencefalo dorsale rappresenta le ali e la coda rhombomere 1. </li><li> Per isolare ulteriormente il mesencefalo ventrale per l&#39;analisi FACS o esperimenti di coltura cellulare, rimuovere il laterale (aspetti dorsale) del tessuto. </li></ul> Rappresentante dei risultati: In questo esperimento GIFM, Wnt1 cellule che esprimono in modo permanente e sono heritably segnato durante l&#39;embriogenesi con la somministrazione di Tamoxifene a E8.5 a Wnt1-CreERT; embrioni mGFP. Successivamente, queste cellule sono contrassegnati visualizzati tramite intero fluorescenza montare e immunoistochimica sezione per determinare come Wnt1 cellule derivate contribuiscono a strutture neurali durante lo sviluppo. Intero monte fluorescenza si basa sulla componente membrana legata GFP del reporter mGFP e quindi fornisce informazioni cellulari, nonché una visione generale di proiezioni neurali Wnt1 derivati. Per esempio, con la somministrazione di Tamoxifene E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embrioni a E12.5 fluorescenza GFP mostra principalmente nel mesencefalo, romboencefalo posteriore e del midollo spinale (Figura 1A). A forte ingrandimento, fine proiezioni neuronali sono visti innervano il mesencefalo, parete del corpo, degli arti, e della regione cranio-facciale. A questo stadio di sviluppo, l&#39;embrione è traslucido ed etichettatura GFP interno è facilmente individuabile. Tuttavia, poiché il cervello si sviluppa, la densità del tessuto maturo oscura fluorescenza GFP provenienti da strutture cerebrali interne. Pertanto, con la somministrazione di Tamoxifene E8.5, solo l&#39;etichettatura GFP minore si osserva nel collicoli superiori degli adulti da tutto il montaggio di fluorescenza (Figura 1C, nel riquadro). Inoltre, alcune proiezioni assonale sono visti scorrere lungo la superficie ventrale del cervello posteriore (non mostrato). Al contrario, quando viene somministrato tamoxifene a E9.5, etichettatura GFP sostanziale si verifica durante l&#39;intero collicoli inferiore (Figura 1B, nel riquadro). Questo aumento, in tutto fluorescenza monte può indicare che Wnt1 cellule che esprimono E9.5 a contribuire in modo più significativo alle regioni superficiali del mesencefalo dorsale o estendere più processi all&#39;interno di questa regione che Wnt1 cellule che esprimono da E8.5. Indipendentemente da ciò, questa differenza, in tutto montare fluorescenza riflette la natura dinamica di Wnt1 espressione durante lo sviluppo e dimostra come GIFM possono essere usati per seguire le distinte popolazioni cellulari dall&#39;embrione nella adulto maturo. Con l&#39;immunoistochimica, sezioni di tessuto destino mappati da Wnt1-CreERT; mGFP animali vengono analizzati a livello cellulare. Anticorpi contro GFP e β-galattosidasi (β-gal) sono usati in combinazione con una varietà di tessuti specifici biomarcatori per determinare il contributo multa scala cellulare del lignaggio Wnt1 delle strutture nervose e tipi di cellule. Con la somministrazione di Tamoxifene E8.5 e E12.5 l&#39;analisi del tessuto a doppio cellule positive (GFP + e β-gal +) sono stati osservati in tutto il mesencefalo e romboencefalo, con proiezioni che scorre attraverso il mesencefalo ventrale (Figura 1B). Nel cervello adulto, il Wnt1-lignaggio marcato E8.5 dà origine a strutture tra cui il mesencefalo collicoli superiori ed inferiori, nonché in prossimità di popolazioni di cellule dopaminergiche della tegmentale ventrale e substantia nigra (Figura 1D) (vedi Zervas anche 2004). Al contrario, la Wnt1-lignaggio marcato E9.5 dà luogo a collicoli inferiori come pure ai neuroni in prossimità di popolazioni di cellule dopaminergiche (Figura 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Risultati Rappresentante per Wnt1-destino di mappatura.: Esempi di tutto il montaggio e risultati immunocitochimica in Wnt1-CreERT; embrioni mGFP e adulti destino cervelli mappata (marcato) a E8.5 (AD)e E9.5 (EF). A. Wnt 1-Creer; embrioni a E12.5 mGFP fluorescenza GFP mostra principalmente nel mesencefalo (Mb), romboencefalo posteriore (Hb) e del midollo spinale (Sp). Cellule B. Contrassegnato visualizzati e analizzati a livello cellulare mediante immunoistochimica come mostrato in questa sezione 1-micron di spessore ottico (obiettivo 40x, z-series di acquisizione). Etichettatura degli anticorpi nucleari β-galattosidasi (nβ-gal) (rosso) e l&#39;etichettatura degli anticorpi GFP (verde) indica il destino mappato cellule mostrato nel mesencefalo ventrale. Qui, le cellule sono ricombinati doppio positivo (nβ-gal + / GFP +) a causa della natura del reporter mGFP condizionale. C. Whole-mount microscopia a fluorescenza rivela debole fluorescenza GFP nel superiore collicoli (SC) dell&#39;adulto (nel riquadro). Valutare il lignaggio Wnt1 marcato E8.5 sulle sezioni adulti con basso ingrandimento (5X) microscopia rivela che il lignaggio Wnt1 dà origine a strutture tra cui il mesencefalo superiore (SC) e inferiore (IC) collicoli (C). D. A 40x, 1 sezione mm ottico preso dal mesencefalo ventrale in prossimità dei neuroni dopaminergici con nβ-gal cellule + e un ricco GFP + assonale plesso. E. Marcatura a risultati E9.5 nell&#39;etichettatura GFP sostanziale che è prontamente osservato nel collicolo inferiore del mesencefalo da tutto il montaggio di fluorescenza (riquadro). Il lignaggio Wnt1 marcato E9.5 su sezioni adulti (β-gal +, rosso) è concentrata nel collicolo inferiore (dorsale-posteriore del mesencefalo), come si è visto a basso ingrandimento (5X) microscopia (E). F. A 40x, 1 sezione mm ottico preso dal mesencefalo ventrale in prossimità dei neuroni dopaminergici con nβ-gal cellule + e un ricco GFP + assonale plesso. Wnt1 neuroni derivati ​​segnato contro E9.5 a E8.5 sono progressivamente limitata dal contribuire al mesencefalo dorsale, mentre il lignaggio Wnt1 persiste nel contribuire al mesencefalo ventrale.

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	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

Tutti gli autori hanno ugualmente contribuito a questo lavoro e sono elencati in ordine alfabetico. Il contributo di ciascun individuo è evidente dalla sua partecipazione in questo articolo video.

Il sistema GIFM che abbiamo dimostrato può essere utilizzato per rispondere a una vasta gamma di domande in una varietà di processi cellulari. Per esempio, i topi ingegnerizzati con diversi piloti Cre può essere usata per bersagliare qualsiasi tipo di cellula, tessuto o lignaggio genetico di interesse. Inoltre, poiché tamoxifene può essere somministrato in qualsiasi punto temporale embrionale o post-natale, la ricombinazione possono essere indirizzati ad una delle fasi importanti dello sviluppo. Il controllo spazia...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

Mappe destino sono generate da marcatura e tracciabilità delle cellule in vivo per determinare come progenitori contribuire a strutture specifiche e tipi di cellule nello sviluppo e nel tessuto adulto. Un anticipo di questo concetto è G enetic ho mangiato nducible F M ANALITICI (GIFM), che collega l&#39;espressione genica, il destino della cellula, e dei comportamenti delle cellule in vivo, per creare mappe sorte sulla base di lignaggio genetico. GIFM sfrutta X-créer linee dove X è un gene o un insieme di elementi normativi gene che conferisce espressione spaziale di una proteina modificata batteriofago, Cre ricombinasi (Creer T). Creer T contiene una versione modificata e strogen r del dominio di legame eceptor che rende Creer T sequestrato nel citoplasma, in assenza del farmaco tamoxifene. Il legame di tamoxifene comunicati Creer T, che trasloca al nucleo e ricombinazione media tra sequenze di DNA affiancato da siti loxP. In GIFM, ricombinazione si verifica in genere tra un loxP affiancato stop cassetta precedente un gene reporter come la GFP. I topi sono allevati per contenere una regione o di cella tipo specifico Creer e un allele giornalista condizionale. Topi non trattati non avranno marcatura perché la cassetta Stop al reporter impedisce l&#39;ulteriore trascrizione del gene reporter. Gestiamo la tamoxifene mediante sonda gastrica per tempo le femmine gravide, che fornisce il controllo temporale di rilascio Creer T e traslocazione successive al nucleo di rimuovere la cassetta di arresto del giornalista. A seguito di ricombinazione, l&#39;allele giornalista è costitutivamente e heritably espresso. Questa serie di eventi segni cellule in modo tale che la loro storia genetica è indelebilmente registrato. Il reporter ricombinati serve così come tracciante alto lignaggio genetico fedeltà che, una volta acceso, è disaccoppiato dal genica inizialmente usato per guidare T Creer. Noi applichiamo GIFM nel topo per studiare lo sviluppo normale e verificare il contributo dei lignaggi genetici per tipi di cellule adulte e tessuti. Usiamo anche GIFM per seguire le cellule mutanti in background genetico per capire meglio fenotipi complessi che imitano le caratteristiche salienti di malattie genetiche umane. In questo articolo il video guide ricercatori attraverso metodi sperimentali per applicare con successo GIFM. Dimostriamo il metodo con il nostro ben caratterizzati Wnt1-créer T; topi mGFP con la somministrazione di tamoxifen al giorno embrionale (E) 8,5 tramite sonda gastrica seguita da dissezione a E12.5 e analisi da stereomicroscopia epifluorescenza. Abbiamo anche dimostrare come micro-sezionare domini destino mappati per la preparazione espianto o analisi FACS e sezionare adulti destino-mapped cervello per tutto l&#39;imaging montaggio fluorescente. Collettivamente, queste procedure permettono ai ricercatori di affrontare le questioni cruciali in biologia dello sviluppo e modelli di malattia.

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate mappatura genetica inducibile (GIFM) segna e cellule brani con fini di controllo spaziale e temporale<em&gt; In vivo</em&gt; E chiarisce come le cellule da un lignaggio genetico specifico contribuire a sviluppare e tessuti adulti. Dimostrato qui ci sono le tecniche richieste per il destino mappa E12.5 embrioni di topo per l&#39;analisi e epifluorescente espianto.

Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K Views.  Brown University. Fate mappatura genetica inducibile (GIFM) segna e cellule brani con fini di controllo spaziale e temporale In vivo E chiarisce come le cellule da un lignaggio genetico specifico contribuire a sviluppare e tessuti adulti. Dimostrato qui ci sono le tecniche richieste per il destino mappa E12.5 embrioni di topo per l'analisi e epifluorescente espianto.

Video: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ricerca

Biologia

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Un sistema magnetico Tether per Indagare visivo e olfattivo di controllo mediata Volo in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Una guida pratica per Phylogenetics per i non esperti

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...