Contrassegnare le cellule staminali e la loro progenie con una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione delle cellule staminali adulte nel cervello in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza. I vantaggi degli approcci di tracciamento del lignaggio transgenico includono la specificità di tracciare un particolare lignaggio cellulare, l'espressione indelebile della proteina fluorescente indipendentemente dal turnover o dalla differenziazione cellulare, la bassa tossicità della doxicilina, l'attivazione condizionata e la facilità d'uso con saggi comuni a valle su tessuti traccia di lignaggio, tra cui immunocolorazione e immunofluorescenza.
A causa dell'ampia implicazione della plasticità e della cellula nel cervello adulto, la caratterizzazione e l'analisi delle cellule staminali adulte aiuteranno a informare lo studio delle malattie neurodegenerative, degli impatti metabolici sulla plasticità cerebrale, dell'invecchiamento e di altre condizioni correlate. Per iniziare, scivola caldo a temperatura ambiente e post-fissato con acetone ghiacciato per 15 minuti. Lavare i vetrini per cinque minuti in un tampone di risciacquo 1X, agitando a 60 rotazioni al minuto a temperatura ambiente tra un passaggio e l'altro.
Permeabilizzare per stare in piedi di antigeni nucleari con 0,3% Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente. Permeabilizzare per la posizione di antigeni citoplasmatici con 0,3% Tween-20 per 10 minuti a temperatura ambiente. Eseguire il recupero dell'antigene mediante vetrini a microonde in 50-100 millilitri di 1x soluzione di recupero dell'antigene DAKO in basso per 10 minuti, due volte.
Quindi, risciacquare con tampone per cinque minuti a temperatura ambiente. incubare vetrini in 0,3% Typogen Black in etanolo al 70% per 20 minuti a temperatura ambiente e quindi lavare con tampone di risciacquo. Disegna la barriera idrofobica intorno al tessuto.
Bloccare per 20 minuti a 37 gradi Celsius con reagente bloccante. E incubare con anticorpo primario diluito in diluente anticorpale durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le diapositive per 10 minuti a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, incubare sezioni in anticorpi secondari Alexa Fluor per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le diapositive due volte nel tampone di risciacquo per 10 minuti. Coprire le sezioni cerebrali in 100 microlitri da uno a 500 anticorpi anti-GFP coniugati ad AlexaFluor 488 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius per aumentare il Fluor4 endogeno, segnando le cellule tracciate.
Il giorno successivo, lavare con tampone di risciacquo due volte. E poi lavare in acqua corrente DI per cinque minuti. Contromacchia con 100 nanogrammi per millilitro 4'6-diamidino-2-fenilindolo per cinque minuti.
Quindi lavare in acqua corrente DI per cinque minuti. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio fluorescente sicuro sopra ogni sezione di tessuto e sigillare con un coperchio di 22 millimetri per 22 millimetri. L'imaging è consigliato il giorno del montaggio per garantire un segnale ottimale.
Per iniziare la fissazione e il sezionamento dopo la perfusione transcardica post-fix cervelli in 4% PFA durante la notte a quattro gradi Celsius. E poi di nuovo per un'ora a temperatura ambiente. Lavare il cervello in 1x PBS per un'ora due volte a temperatura ambiente.
Tagliare il cervello in sezioni spesse un millimetro usando il blocco cerebrale sagittale e metterlo in cinque tubi micro centrifughi da millilitri contenenti 1x PBS. Per il pretrattamento con metanolo, iniziare lavando con 1x PBS per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare al 50% di metanolo per un'ora a temperatura ambiente.
Lavare in metanolo all'80% per un'ora a temperatura ambiente. Lavare al 100% metanolo per un'ora, due volte, a temperatura ambiente. Campioni di candeggina con perossido di idrogeno al 5% in 20% di dimetilsolfossido e metanolo a quattro gradi Celsius durante la notte.
Dopo lo sbiancamento, lavare i campioni in metanolo per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare al 20% di dimetilsolfossido e metanolo per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare in metanolo all'80% per un'ora a temperatura ambiente.
Lavare al 50% di metanolo per un'ora a temperatura ambiente. Lavare in PBS per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare in PBS 0,2% Triton X-100 per un'ora due volte a temperatura ambiente.
Per l'immunocolorazione dei cervelli di compensazione, iniziare incubando campioni in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 glicina molare, a 37 gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale. Blocco in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% siero di capra a 37 gradi Celsius per tre giorni su uno shaker orbitale. Lavare i campioni in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgrammi per millilitro di sale eparina sodica dalla mucosa suina per un'ora due volte a 37 gradi Celsius.
Successivamente, incubare in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgrammi per millilitro eparina, 5% DMSO, 3% siero di capra contenente da una a 500 concentrazioni di coniglio anti GFP AlexaFluor 488 a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale per due giorni. Lavare i campioni in 1x PBS, 0,2% Tween-20 con 10 microgrammi per millilitro di eparina per un'ora a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale tre volte e poi una volta al giorno per due giorni. Incubare i campioni durante la notte in un millilitro di 50% tetraidrofurano e acqua.
Incubare i campioni per un'ora in un millilitro di 80% THF Tetraidrofurano e acqua. Incubare i campioni due volte per un'ora in 100% tetraidrofurano. Asciugare i campioni con una salvietta sterile e incubare in diclorometano fino a quando non affondano sul fondo del flaconcino.
Non incubare per più di 60 minuti. Incubare i campioni in un millilitro di etere dibenzil fino a quando non sono chiari. Conservare i campioni in etere dibenzil a temperatura ambiente fino a quando non sono pronti per l'immagine.
Per visualizzare sezioni cerebrali immunocolorate, analizzare i vetrini tramite microscopia confocale, dove può essere confermata la co-espressione di più anticorpi. Utilizziamo un microscopio Leica Stellaris five con rivelatori ibridi HyD S. Per visualizzare i cervelli cancellati, utilizzare un microscopio confocale invertito con uno stadio automatizzato e una funzione di piastrellatura automatizzata.
Inizia posando una sezione cerebrale ripulita piatta contro un piatto di fondo di vetro in immersione nell'etere dibenzile. Una notevole differenza di intensità fluorescente tra diverse regioni del cervello e vari tipi di cellule è stata osservata dopo un periodo di inseguimento del polso nel cervello tracciato del lignaggio. Le cellule epiteliali coroidi nel plesso coroideo avevano una spessa membrana cellulare e un forte segnale fluorescente verde che indicava che derivavano da cellule Tert positive che erano facilmente distinguibili dalle cellule circostanti.
Gli altri tipi di cellule più piccole nello stroma del plesso coroideo avevano un segnale GFP più debole. Nel cervelletto, le cellule gliali di Bergmann esprimevano livelli più elevati di GFP rispetto alle cellule del cesto, e la variazione nell'espressione della GFP esisteva anche tra le singole cellule del cesto. Per gli assoni dei neuroni sensoriali di fabbrica all'interno dello strato glomerulare del bulbo olfattivo esprimevano anche alti livelli di GFP Assoni neuronali sensoriali olfattivi che riempiono lo strato glomerulare del bulbo olfattivo esprimevano alti livelli di pomodoro a membrana, o fluorescenza rossa rispetto alla maggior parte delle altre regioni del cervello anche quando gli stessi neuroni sono GFP positivi indicando che alcune cellule sembravano perdere il segnale mTomato più lentamente durante il tracciamento del lignaggio.
Al contrario, nel plesso coroideo le cellule GFP positive hanno espresso un basso mTomato. Nella maggior parte delle altre regioni del cervello, i segnali del pomodoro espressi a basso livello nella maggior parte dei tipi di cellule con cellule endoteliali che sono alcune delle uniche cellule il cui segnale fluorescente era abbastanza luminoso da distinguersi distintamente dallo sfondo fluorescente rosso del tessuto cerebrale. La cosa più importante da ricordare è che il segnale fluorescente nei cervelli cancellati svanisce più velocemente della maggior parte degli altri test immunologici.
Ricordati di fotografare i tuoi campioni il prima possibile ed entro sette giorni. A seguire, l'imaging delle fette di cervello o dei cervelli chiari, la colorazione dei marcatori con i segnali GFP e la nostra quantificazione della fluorenza possono essere intrapresi utilizzando programmi software.
