Ringraziamo J. Chen per la fornitura del gabbia fluoresceina destrano protocollo di sintesi. Questa ricerca è stata sostenuta dal marzo del premio Dimes 5-FY09-78, l&#39;American Heart Association 09BGIA2090075 premio, e il NIH / NHLBI premio HL107369 R01-01 per SS Un ringraziamento speciale a C. Closson per la sua assistenza microscopia.

1. Sintesi di gabbia fluoresceina destrano (adattato da rif. 14) <ol><li> Preparare una soluzione 0,1 M di borato di sodio diluita in DDH 2 O. </li><li> Misura 4 mg di 10 kDa aminodextran e aggiungerlo alla CMNB-gabbia tubo fluoresceina. </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione preparata borato di sodio (punto 1.1) al CMNB-gabbia tubo fluoresceina. Chiudere la provetta e vortex per 30 secondi per sciogliere il composto. </li><li> Lasciare il composto di reagire durante la notte su un nutator a temperatura ambiente. Coprire il tubo con un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione della miscela di luce ambientale. </li><li> Ottenere uno spin Zeba desalificare colonna e sviti il ​​tappo inferiore. Segna un punto sulla colonna, che saranno utilizzati per orientare la colonna quando centrifugazione. Porre la colonna in un tubo di 15 ml conica Falcon. Nota: la soluzione nella colonna è in buffer di colonna. </li><li> Allentare il tappo superiore della colonna di spin desalificare. Posizionare il tubo 15 ml conica Falcon che ospita la colonna desalificare spin in una centrifuga. Orientare la colonna con il punto segnato (passo 1,4) di fronte al centro del rotore della centrifuga. Centrifugare la provetta a 1000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere la colonna desalificare rotazione dal tubo Falcon. Gettare sia il flusso raccolti e il tubo da 15 ml. Ottenere un nuovo tubo da 15 ml conica Falcon, e posto la colonna desalificare rotazione nel tubo nuovo Falcon. Nota: Dopo centrifugazione, il letto di resina colonna dovrebbe comparire compattato. Utilizzare la colonna immediatamente. </li><li> Ottenere la miscela ha reagito (in gabbia con fluoresceina destrano) al punto 1.3. Togliere il tappo dalla colonna spin e aspirare la miscela ha reagito ed applicare lentamente al centro della colonna di spin desalificare. Dopo aver applicato la miscela ha reagito, sostituire il coperchio della colonna. </li><li> Posizionare il tubo Falcon che ospita la colonna desalificare spin in una centrifuga. Come fatto al punto 1.5, orientare la colonna con il punto segnato di fronte al centro del rotore della centrifuga. Centrifugare la provetta a 1000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, una miscela giallo (in gabbia con fluoresceina destrano) saranno raccolti (circa 400 mL) nel tubo da 15 ml Falcon. Trasferire la gabbia con fluoresceina destrano miscela in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Coprire immediatamente il tubo con un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione della miscela di luce ambientale. Liofilizzare la gabbia con fluoresceina destrano composto in una speedvac. Liofilizzazione di 350 microlitri dovrebbe durare circa 4 ore. </li><li> Dopo la liofilizzazione completo, risospendere la polvere (circa 3 mg) in DDH 2 O ad una concentrazione finale di circa l&#39;1% w / v. Mescolare brevemente vortex per sospendere la polvere. </li><li> L&#39;aliquota in gabbia fluoresceina destrano in tubi separati lamina metallica coperta, e conservarli a -20 ° C. </li></ol> 2. Raccolta di embrioni e di microiniezione in gabbia con fluoresceina destrano * Questa procedura utilizza il pesce zebra come sistema modello animale. <ol><li> Il giorno prima di iniezioni, istituito attraversa uno zebrafish 01:01 maschio-femmina o 2:1 maschio-femmina in vasche di allevamento con divisori. </li><li> La mattina dopo cambiare l&#39;acqua della vasca di allevamento e rimuovere i divisori. Immediatamente preparare un 5 microlitri 1 / 10 soluzione diluita di lavoro in gabbia fluoresceina destrano sia 1 X Danieau media (vedi Preparazione delle soluzioni) o DDH 2 O. Coprire il tubo di soluzione di lavoro con un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Pipettare il preparato in gabbia fluoresceina destrano soluzione (passo 2.2) nella ago. Prima di tagliare la punta dell&#39;ago a una dimensione appropriata al microscopio dissezione, posto un pezzo di trasparente filtro giallo davanti alla sorgente di luce bianca. Il filtro giallo impedirà uncaging spontanea della fluoresceina destrano durante le iniezioni. Quando si guarda attraverso il oculare oculare, la sorgente di luce deve apparire giallo. </li><li> Raccogliere embrioni e pipettare in un vassoio di stampo microiniezione. Impostare il tempo di microiniezione per fornire 3-4 nL di gabbia fluoresceina destrano. Sotto il microscopio a dissezione, orientare gli embrioni con una pinza e iniettare (da 3 a 4 NL) in gabbia con fluoresceina destrano nella base del blastomero cellule (blastomeri-tuorlo d&#39;interfaccia). La fase embrionale di iniezione deve essere 1 - a 2-cellule stadio. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, rimuovere gli embrioni dal vassoio di stampo microiniezione e metterli in un piatto pulito Petri contenente acqua di pesce fresco. Blu di metilene può essere aggiunto all&#39;acqua di pesce per prevenire la crescita fungina ad una concentrazione finale pari ad 0,02% w / v. Coprire la capsula di Petri con un foglio di metallo per evitare uncaging del iniettato in gabbia fluoresceina-destrano. </li><li> Alzare gli embrioni iniettati di una fase in cui le cellule di interesse devono essere fotoattivati. Per fotoattivazione, preparare una soluzione a basso 0,6% di fusione agarosio in DDH 2 O. A seconda della fase embrionale, Tricaine (MS222) possono essere aggiunti alla fusione agarosio basso. Per fare questo, diluire 0,02% Tricaine a basso punto di fusione agarosio ad una concentrazione finale del 0,0014%. </li><li> Non appena gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo appropriato, dechorionate gli embrioni in 1 X Danieau dei media con una pinza. Quando dechorionating, assicurarsi che un filtro giallo trasparente è inserito nel percorso della sorgente di luce bianca (vedi punto 2.3). </li><li> Riscaldare il 0,6% soluzione a basso fusione agarosio a 37 ° C. Pipettare 1 ml di fusione agarosio basso nel pozzo di un vetrino coprioggetti LabTek camerati. Cura il montaggio 3-4 embrioni in basso punto di fusione agarosio e orientarli con pinze con le celle da fotoattivati ​​rivolto verso il basso contro il coprioggetto in basso. </li><li> Lasciare solidificare l&#39;agarosio. Dopo la solidificazione, pipettare 1 ml di 1 X Danieau supporto sopra l&#39;agarosio. </li><li> Ripetere i passaggi 2,8-2,9 per più embrioni. </li></ol> 3. Due fotoni attivazione di gabbia fluoresceina destrano * Questa procedura presuppone che l&#39;embrione esprime GFP reporter. L&#39;embrione è visualizzato utilizzando lo ione argon (488 nm) sorgente laser collegata al microscopio LSM 510 META NLO. Una cellula GFP singolo positivo è selezionato e fotoattivati ​​utilizzando il Mai Tai laser (laser a femtosecondi) accoppiato al LSM 510. La procedura è la stessa per non fluorescente embrioni. In alternativa, la luce bianca può essere usata per trovare la cella da attivare, seguita dalla attivazione utilizzando il Mai Tai sorgente laser. <ol><li> Caricare il software LSM 510. Mettere un filtro trasparente gialla nel percorso del fascio di luce bianca. </li><li> Selezionare Scansione Nuova immagine e fare clic su Start Expert Mode. </li><li> Selezionare la scheda laser. Accendere il ioni argon (488 nm) e Mai Tai (femtosecondi) sorgenti laser. </li><li> Impostare il Mai Tai lunghezza d&#39;onda a 740 nm. </li><li> Selezionare la scheda di configurazione. Impostare la configurazione ottica di percorso per la ioni argon e Mai Tai laser. </li><li> Selezionare la scheda Scansione. Cambia l&#39;obiettivo di 20X/0.8. </li><li> Impostare la velocità massima di scansione facendo clic su Max. </li><li> Imposta modalità, Metodo e Numero di linea, media, e 1. </li><li> Sotto la scheda Canali deselezionare tutte le sorgenti laser ad eccezione del Mai Tai. </li><li> Posizionare un misuratore di potenza nel percorso ottico ottico. </li><li> Selezionare il pulsante per attivare Cont scansione continua. </li><li> Regolare la% di trasmissione fino a quando il misuratore di potenza legge un laser di potenza media di 47 mW. </li><li> Arrestare la scansione selezionando il pulsante Stop. </li><li> Sotto la scheda Canali deselezionare il Mai Tai sorgente laser e selezionare lo ione argon (488 nm). </li><li> Selezionare il pulsante rapido xy. Sotto la scheda Canali regolare il foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset e guadagno dell&#39;amplificatore per lo ione argon laser per ottenere la migliore qualità dell&#39;immagine. </li><li> Utilizzando il controller fase, trovare e mettere a fuoco la cellula da attivare. </li><li> Fare clic sul pulsante Stop. </li><li> Utilizzando lo strumento zoom, zoom sul cellulare attivato fino a quando il fattore di zoom nella scheda Modalità visualizza 50 a 70. </li><li> Arrestare la scansione selezionando il pulsante Stop. </li><li> Sotto la scheda Canali deselezionare l&#39;argon ionizzato laser (488 nm) e selezionare il Mai Tai laser. </li><li> Sotto la scheda Modalità impostare la velocità di scansione di 31,46 sec. </li><li> Selezionare il pulsante singolo per avviare la scansione di due fotoni attivazione di gabbia fluoresceina destrano della cella selezionata. </li><li> Dopo l&#39;attivazione, deselezionare il Mai Tai laser nella scheda Canali e riselezionare il laser a ioni argon (488 nm). </li><li> Impostare il fattore di zoom in modalità a 1, e cliccare sul pulsante sotto la velocità massima voce per impostare la massima velocità di scansione. </li><li> Seleziona xy veloce a leggere le fotoattivati ​​regione. Controllare che la regione non è fotoattivati ​​laser ablato. Per ulteriori informazioni su ablazione laser, si prega di consultare la sezione discussione. </li><li> Ripetere i passaggi precedenti per altri embrioni. </li></ol> 4. Immunolocalizzazione di Uncaged fluoresceina destrano (adattato da rif. 16) <ol><li> Dopo photoativation, posto un filtro trasparente giallo davanti alla sorgente di luce bianca e rimuovere manualmente ogni embrione dal basso punto di fusione di agarosio utilizzando pinze taglienti. Mettere tutti gli embrioni rimossi in un nuovo piatto di Petri contenente fresca 1 X Danieau media. Coprire la capsula di Petri con un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione degli embrioni alla luce. </li><li> Se necessario, dietro gli embrioni alla fase di sviluppo desiderato. Nel frattempo, preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% (vedi Preparazione delle soluzioni). Aliquota 1,5 mL di paraformaldeide preparato in una provetta. </li><li> Dopo gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo di interesse, pipetta gli embrioni in provetta (dal punto 4.2). Coprire il tubo con un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Nutate il tubo di una notte a 4 ° C. Per il giorno successivo preparare graduati etanolo (EtOH) soluzioni in tampone salino fosfato (PBS) e DDH 2 O, il 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, il 70% EtOH: DDH 2 O, e il 100% EtOH. </li><li> Il giorno successivo, togliere gli embrioni di 4 ° C. Rimuovere la lamina di metallo che copre il tubo e aspirare rapidamente fuori paraformaldehye (lasciarsi alle spalle un piccolo volume che è sufficiente a coprire gli embrioni). Pipettare 1,5 mL di EtOH 30%: PBS nella provetta. Ri-coprire il tubo con un foglio di metallo. Nutate il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ripetere il punto 4.5 utilizzando 50, 70 e 100% classificato soluzioni EtOH. Dopo il lavaggio 100% EtOH, lavare gli embrioni di nuovo in 100% EtOH per 10 minuti. </li><li> Dopo il lavaggio, conservare gli embrioni durante la notte a -20 ° C. Per il giorno successivo preparare un tampone fosfato Tween (PBT; vedere Preparazione delle soluzioni), 5 X tampone bloccante (vedi protocollo del produttore per la preparazione), acido maleico (protocollo per la preparazione può essere trovato nel protocollo tampone di bloccaggio), 10 mg / ml proteinasi K, e un anticorpo 10 X soluzione (anti-fluoresceina-AP, vedere Preparazione delle soluzioni). </li><li> Anche preparare il 2% di agnello nel siero (LS, vedere Preparazione delle soluzioni) diluito in PBT. Conservare l&#39;anticorpo a 4 ° C per una notte agitando su un nutator. La LS 2% può essere conservato a 4 ° C. </li><li> Il giorno dopo togliere gli embrioni da -20 ° C. Rimuovere la lamina di metallo che copre il tubo e aspirare rapidamente fuori EtOH 100%. Aggiungere 1,5 mL di EtOH 70%: DDH 2 O al tubo. Ri-coprire il tubo con un foglio di metallo. Nutate il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ripetere il passo con 4,8 50 e 30% EtOH soluzioni classificato, e il 100% PBT. Dopo il lavaggio 100% PBT, lavare gli embrioni altri 3 volte in 100% PBT per 10 minuti. </li><li> Se gli embrioni sono più vecchi di 24 ore, proteinasi K li trattano. In caso contrario, passare al punto 4.13. Per fare questo, diluire il preparato proteinasi K (punto 4.7) 1:1000 in PBT. Incubare gli embrioni in proteinasi K per 10 minuti, o più, se gli embrioni sono più vecchi. Mantenere gli embrioni ricoperto di un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Dopo il trattamento con proteinasi K, lavare gli embrioni 5 volte in PBT per 10 minuti. Dopo il lavaggio, fissare gli embrioni in paraformaldeide 4% per 30 minuti a temperatura ambiente su un nutator. In seguito, lavare immediatamente gli embrioni 5 volte in PBT per 10 minuti. Mantenere gli embrioni ricoperto di un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Fai un tampone di bloccaggio diluendo Buffer 5 X di blocco in tampone acido maleico a 1 X. Rimuovere gli embrioni da PBT e metterli in 1 tampone X di blocco. Coprire gli embrioni con un foglio di metallo e nutate a temperatura ambiente per 5 a 6 ore. </li><li> Dopo 5 o 6 ore di blocco, heat shock degli embrioni a 65 ° C per 15 a 20 minuti. </li><li> Ottenere la soluzione di anticorpi e la LS 2% preparato il giorno precedente. Centrifugare la soluzione di anticorpi a max giri. Trasferire la fase acquosa al tubo LS 2%. Capovolgere la provetta per mescolare. </li><li> Trasferire gli embrioni da tampone di bloccaggio LS-anticorpo miscela. Mantenere gli embrioni ricoperto di un foglio di metallo per evitare l&#39;esposizione alla luce. Nutate gli embrioni a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno dopo lavare gli embrioni a temperatura ambiente 6 volte per 15 minuti in PBT. Preparare AP buffer (vedi Preparazione delle soluzioni). </li><li> Lavare gli embrioni a temperatura ambiente per 2 volte per 10 minuti in tampone AP. Preparare NBT / BCIP soluzione di sviluppo (vedi Preparazione delle soluzioni). </li><li> Trasferire gli embrioni NBT / BCIP. Lasciare che la macchia di sviluppare nel buio. </li><li> Bloccare lo sviluppo lavando gli embrioni 3 volte in PBT per 5 minuti ciascuno. </li><li> Per l&#39;acquisizione di immagini montare gli embrioni in fusione di agarosio 0,6% a basso o 3% di metilcellulosa, e acquisire le immagini utilizzando un microscopio invertito o verticale. </li><li> Fotoattivati ​​campioni possono essere conservati per le analisi future (colorazione rimane stabile) da disidratazione in un lavaggio classificato EtOH. Seguire i passaggi attraverso 4,4 4,7 per la disidratazione dei campioni. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano. (A, B) Brightfield e l&#39;immagine di fluorescenza di un embrione di zebrafish vista laterale in fase di 13/14-somite prima fotoattivazione. (C, D) L&#39;embrione è stato fotoattivati ​​in fase the13/14-somite in uno dei somiti (freccia) con una lunghezza d&#39;onda di 740 nm, tempo di scansione di 31 secondi, e una potenza media del laser di 47 mW. Post-attivazione, (d) fluorescenza da Uncaged fluoresceina destrano è osservato. Orientamento: dorsale (a destra), ventrale (a sinistra). Scala bar 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Immunolocalizzazione di gabbia fluoresceina destrano. La Figura 2 mostra i immunocolorazione di Uncaged fluoresceina destrano in un embrione 18/19 HPF zebrafish. Al 10-somite scena una piccola regione di un embrione è stato attivato nel mesoderma piastra laterale utilizzando i parametri laser stesso indicato nella figura 1. Utilizzando la procedura immunolocalizzazione, la freccia identifica la regione attivati ​​con la colorazione di fondo minima. Orientamento: dorsale (in alto), ventrale (in basso). Scala bar 100 micron.

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	<li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants.">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 .</li><li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li><li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion.">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li><li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish:+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation.">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li><li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling.">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model.">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li><li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery.">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li><li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula.">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li><li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran.">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+and+gene+expression.">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> Questo documento descrive un metodo versatile per la mappatura dei singoli il destino della cellula in base alla fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano. Uncaging di gabbia fluoresceina destrano in celle singole si ottiene utilizzando l&#39;assorbimento a due fotoni di un laser a femtosecondi Mai Tai accoppiato al Zeiss LSM 510 META microscopio confocale. Uncaged fluoresceina destrano nelle cellule fotoattivati ​​è rapidamente visualizzato usando una semplice procedura di immunoistochimica. In questo protocollo i due fotoni di lunghezza d&#39;onda di assorbimento per fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano è di 740 nm. Questa lunghezza d&#39;onda è stato determinato sperimentalmente da photoactivating gabbia fluoresceina destrano embrioni di tipo selvatico iniettato. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione laser è stato variato dal 600-800 nm, e la presenza o assenza di fluoresceina fluorescenza post-attivazione era qualitativamente determinato. Abbiamo scoperto che 740 nm prodotta il più forte segnale di attivazione seguenti fluoresceina. Idealmente, 740 nm dovrebbe funzionare per tutti i sistemi modello, tuttavia, si consiglia di testare una vasta gamma di lunghezze d&#39;onda per determinare l&#39;ottimale a due fotoni di lunghezza d&#39;onda di eccitazione per il campione. In gabbia con fluoresceina destrano tipo selvatico embrioni iniettati, per ogni due-fotone di lunghezza d&#39;onda di eccitazione testato anche variato la potenza media del laser. Per una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 740 nm, una potenza media del laser di 47 mW prodotto un segnale fluoresceina più forte nella regione attivata rispetto a potenze inferiori laser media. Potenze superiori media del laser non ha prodotto segnali fluoresceina più forte, ma l&#39;ablazione indotta del tessuto. Dato che gli impulsi laser a femtosecondi sono efficienti a ablazione dei tessuti biologici 15, si consiglia di determinare la potenza media soglia laser per fotoattivazione che evita l&#39;ablazione dei tessuti. Assorbimento a due fotoni si verifica all&#39;interno di un volume di interazione di piccole dimensioni. Per garantire corretto funzionamento del dispositivo in gabbia con fluoresceina destrano, la cellula deve essere messa a fuoco corretta. Nel protocollo di cui sopra, le cellule GFP positive sono state contemporaneamente ripreso a luce bianca per confermare la messa a fuoco delle cellule. Pertanto, l&#39;acquisizione di luce bianca, oltre ad altri canali è consigliabile. Dopo aver confermato fuoco delle cellule, il nostro protocollo suggerisce di ingrandimento della cellula attivata. Un fattore di zoom da 50 a 70 è suggerito, tuttavia, questo valore dipende dalla dimensione della cellula prescelta. Aumentando lo zoom isola la cellula attivata dalle cellule adiacenti, e limita l&#39;area di scansione di due fotoni di attivazione. Idealmente, l&#39;area di scansione dovrebbe coprire una vasta area della cellula. Rilevazione di singole cellule attivate richiede che la colorazione di fondo essere minimo. Nel protocollo immunolocalizzazione sopra, è importante che il campione è bloccato in tampone di bloccaggio da 5 a 6 ore (punto 4.13). Durante lo sviluppo di NBT / BCIP, Uncaged fluoresceina destrano dovrebbe diventare visibile in 10 a 20 minuti. Se la colorazione di fondo è forte, si consiglia un tempo più lungo blocco e lava aggiuntive per rimuovere gli anticorpi (punto 4.17). Le figure 1 e 2 forniscono risultati rappresentativi di fotoattivazione e immunolocalizzazione. Nella Figura 1, i primi 1 - a 2-cellule embrioni stadio tipo selvatico in gabbia sono stati iniettati con fluoresceina destrano. Gli embrioni sono stati sollevati a somitogenesis metà e montato in basso punto di fusione agarosio con l&#39;orientamento laterale. Figura 1 (a, b) raffigurano campo chiaro e le immagini fluorescenti dell&#39;embrione prima fotoattivazione. La prova che l&#39;embrione è rimasto Uncaged è dimostrato dall&#39;assenza di fluoresceina fluorescenza nella figura 1 (b). Una piccola regione all&#39;interno di un somite è stato attivato con una lunghezza d&#39;onda di 740 nm per 31 secondi utilizzando un laser di potenza media di 47 mW, Figura 1 (c, freccia). Post-attivazione, a due fotoni uncaging di fluoresceina destrano è verificato come dimostrano la fluorescenza della zona attiva, Figura 1 (d, freccia). Attivazione non è stato accompagnato da ablazione laser, come il tessuto somitic rimasta intatta, Figura 1 (c). La figura 2 mostra l&#39;immunolocalizzazione di Uncaged fluoresceina destrano. Una piccola regione del mesoderma piastra laterale di un 10-somite embrione scena era fotoattivati ​​utilizzando i parametri laser stesso, come indicato in Figura 1. L&#39;embrione è stato sollevato e trattati con 4,1 passi attraverso 4.20. La freccia nella Figura 2 individua la regione attiva, come indicato da un accumulo di precipitato blu. Solo la posizione attiva è chiaramente individuata senza interferire colorazione di fondo. Preparazione di soluzioni: 1 X PBT (1 L) 10 X 100 ml PBS 2 g di BSA 10 ml di Tween 20% 10 X PBS (1 L) 80 g di NaCl 2 g di KCl 6,1 g Na 2 HPO 4 1,9 g di KH 2 PO 4 DDH 2 O a 1 L pH a 7,3 Paraformaldeide 4% (160 ml) 32% paraformaldeide (due flaconcini da 10 ml) 8 mL 20 X PBS 132 ml DDH 2 O jove_content &quot;&gt; AP Buffer (50 ml) 1 ml di NaCl 5 M 2,5 ml 1 M MgCl 2 5 ml 1 M Tris pH 9,5 250 microlitri Tween 20% 41,25 mL DDH 2 O Anticorpi soluzione (per 1 campione) 5,5 microlitri polvere Acetone 40 microlitri PBT LS 0,8 microlitri 0,1 microlitri anti-fluoresceina-AP anticorpi 2% LS (360 microlitri per 1 campione) 7,2 microlitri LS 100% 352,8 microlitri PBT 1 X Danieau media (1 L) ‡ 11,6 mL 5 M NaCl 700 microlitri 1 M KCl 400 microlitri 1 M MgSO 4 600 microlitri 1 M di Ca (NO 3) 2 5 ml 1 M HEPES DDH 2 O a 1 L regolare il pH a 7,6 ‡ Danieau è una soluzione salina ideale per l&#39;allevamento di embrioni di zebrafish dechorionated. Altri mezzi di comunicazione possono essere utilizzati, purché siano correttamente con soluzioni isotoniche osmolarità (~ 300 mOsm per zebrafish) NBT magazzino (1 ml) 50 mg Nitro Blu tetrazolo 0,7 ml di anidride dimetilformamide 0,3 mL DDH 2 O BCIP magazzino (1 ml) 50 mg di 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolil 1 ml di anidride dimetilformamide NBT / BCIP soluzione di sviluppo 1 ml di buffer AP 4,5 microlitri magazzino NBT 3,5 microlitri magazzino BCIP Acetone polvere <ol><li> Selezionate 20 pesci adulti e congelare in azoto liquido. </li><li> Macinare il pesce congelato con un mortaio e pestello in polvere. </li><li> Trasferire la polvere di pesce in un tubo da 50 ml. </li><li> Riempire il tubo conico con 100% di acetone. Vortice del tubo. </li><li> Gira il tubo a max rpm per 10 minuti. Scartare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet altre 3 volte in 100% acetone e girare il tubo a max rpm per 10 minuti. Con l&#39;ultimo lavaggio del surnatante deve apparire chiaro. </li><li> Aggiungere 100 acetone% al pellet di nuovo e lasciare che il tubo di riposare a temperatura ambiente. Le particelle più dense si sistemerà, mentre le particelle più fini rimarrà in sospensione. </li><li> Decantare le particelle in un nuovo tubo. Aliquota della soluzione polvere in tubi separati e conservarli a -20 ° C. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> CMNB-gabbia fluoresceina SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba Desalt Spin Column </td><td> Perforare </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Borato di sodio </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaine Methylsulfonate / MS222 </td><td> Ricerca Organics </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-fluoresceina-AP </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Tampone bloccante </td><td> Roche Applied Sciences </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Acido maleico </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Scientific </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek chambered coprioggetti diapositive </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Agnello nel siero </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0,8 NA Air obiettivo apocromatico </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Trasparente filtro giallo </td><td> Theatre House Inc. </td><td> Roscolux filtro colore foglio: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

La possibilità di etichettare in modo differenziato le singole cellule ha importanti implicazioni nella biologia dello sviluppo. Per esempio, determinare in che modo ematopoietiche, lignaggi vasi linfatici e sanguigni sorgono in embrioni di sviluppo richiede la mappatura destino e lignaggio tracciamento di cellule precursori indifferenziati. Recentemente, proteine ​​photoactivatable che includono: Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 e KikGR 9, 10 hanno ricevuto grande interesse come sonde cellulari traccia. Lo spettro di fluorescenza di queste proteine ​​fotosensibili possono essere facilmente convertito con eccitazione UV, permettendo una popolazione di cellule per essere distinte da quelle adiacenti. Tuttavia, il photoefficiency della proteina attivata può limitare a lungo termine delle cellule inseguimento 11. In alternativa alle proteine ​​photoactivatable, in gabbia fluoresceina destrano è stato ampiamente utilizzato in sistemi modello embrione 7, 12-14. Tradizionalmente, per uncage fluoresceina destrano, eccitazione UV da una casa lampada a fluorescenza o di un singolo fotone laser UV è stato utilizzato, tuttavia, le fonti di tale limite la risoluzione spaziale di fotoattivazione. Qui riportiamo un protocollo per mappare il destino, traccia discendenza, e rilevare le singole cellule marcate. Singole cellule in embrioni iniettati con gabbia fluoresceina destrano sono fotoattivati ​​nel vicino infrarosso con impulsi laser prodotta da un laser a femtosecondi titanio zaffiro. Questo laser è consuetudine in tutti i microscopi confocale a due fotoni come il microscopio LSM 510 META NLO utilizzati in questo documento. Dal momento che i tessuti biologici è trasparente alla radiazione nel vicino infrarosso 15, gli impulsi laser può essere focalizzato in profondità all&#39;interno dell&#39;embrione senza uncaging cellule sopra o sotto il piano selezionato focale. Pertanto, non lineare assorbimento a due fotoni è indotta solo al centro geometrico di uncage fluoresceina destrano in una singola cella. Per rilevare la cella contenente Uncaged fluoresceina destrano, descriviamo un semplice protocollo immunoistochimica 16 a visualizzare rapidamente la cellula attivata. Il protocollo di attivazione e la rilevazione presentato in questo articolo è versatile e può essere applicato a qualsiasi modello di sistema. Nota: I reagenti usati in questo protocollo si possono trovare nella tabella allegata alla fine dell&#39;articolo.

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Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Video: Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...