Vorremmo ringraziare il supporto da US National Institutes of concede Salute R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 e R01EB007279 e dell&#39;American Heart Association concedere 0855772D.

1. Ampio campo di vista di immagine pO2 in vascolarizzazione corticale di un topo <ol><li> Ratti (250 g -350 g) sono inizialmente anestetizzati con isoflurano, e l&#39;arteria femorale e la vena sono cateterizzati di monitorare la frequenza cardiaca, pressione arteriosa, ed emogasanalisi, così come per infusione endovenosa. La temperatura corporea è mantenuta a 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomia viene eseguita, ei ratti sono ventilati con una miscela di aria e ossigeno. </li><li> I campioni di sangue per la misurazione del gas del sangue vengono effettuate ogni 30-45 min e la ventilazione e l&#39;anestesia sono adeguati per mantenere il gas del sangue all&#39;interno normale range fisiologico. </li><li> Una finestra chiusa del cranio sul osso parietale 4 mm x 4 mm dimensioni è preparato per l&#39;imaging. L&#39;osso e la durata vengono rimossi e la finestra del cranio è riempita con 1,5% di agarosio e sigillato con un coprioggetto microscopio. Un ulteriore 1 mm 2 fori bava con l&#39;osso frontale è usato per indurre CSD da microiniezione intracorticale di KCl (~ 10 microlitri, 1 M). Estrema cura deve essere presa per evitare ogni danno della vascolarizzazione corticale. Eccesso di calore, pressione meccanica, o breve periodo di ipossia può compromettere barriera sanguigna e causare perdite del colorante dal sistema vascolare nello spazio interstiziale. </li><li> Una maschera da materiale otticamente opaco è collocato intorno finestra cranica. Lo scopo della maschera è quello di assorbire fosforescenza segnale che viene dal colorante che si sono riversate in tessuto dai bordi della materia dura. Il colorante nello spazio interstiziale è la fonte della fosforescenza molto luminoso che può rovinare la misura. La luminosità aumentata del colorante nello spazio interstiziale è risultato di accumulo del colorante in ambiente con bassa pressione di ossigeno e la frequenza tempra basso. Il danno del sistema vascolare in esperimento è quindi facilmente riconoscibile dalla comparsa di macchie luminose fosforescenza, nel qual caso viene respinto i dati sperimentali. </li><li> Dopo il completamento della chirurgia, isoflurano è interrotto e l&#39;anestesia è passati a alfa-cloraloso (50 mg / kg in bolo per via endovenosa seguiti da 40 mg / (kg h) infusione). </li><li> Animale è trasferito su un carrello con pressione ventilatore, e monitorare la temperatura. Respirando l&#39;aria della stanza, l&#39;animale è rapidamente spostato al setup di imaging e riattaccato per il misuratore di portata con miscela appropriata di aria e ossigeno. </li><li> Il telaio stereotassico che detiene l&#39;animale è posto sotto l&#39;obiettivo. La finestra cranica è al centro del campo visivo nel quadro dell&#39;obiettivo e posizionato parallelamente al piano focale. </li><li> Il laser pulsato è acceso e impostato su impulso di energia minima. Il fascio ottico è diretto verso contatore di energia impulso ed energia impulso consegnato al campione viene regolato per essere non più di 10 mJ / cm 2. L&#39;ISS raggio centrata sulla finestra del cranio con angolo di incidenza obliquo di circa 60 gradi e laser iss spento. </li><li> Le misurazioni dei gas del sangue e le regolazioni della ventilazione ed anestesia vengono eseguite fino a quando tutti i parametri fisiologici dell&#39;animale erano all&#39;interno normale range fisiologico. </li><li> Supponendo che il volume del sangue è di circa il 7% del peso corporeo, una quantità appropriata di R3 fosforescenza Oxyphor sonda è sciolto in 1 ml di soluzione fisiologica per ottenere 4 x 10 -5 M concentrazione ematica della sonda. La soluzione della sonda viene iniettato attraverso la vena femorale. </li><li> Una soluzione 1 M di cloruro di potassio è preparato e ~ 1 ul viene iniettata con la siringa attraverso il foro bava sull&#39;osso frontale per indurre CSD. </li><li> Il laser è acceso e l&#39;imaging viene avviato subito dopo l&#39;iniezione della soluzione di KCl. Imaging di fosforescenza viene eseguita durante ~ 10 min. </li><li> Un&#39;altra misura del gas nel sangue è eseguita a confermare che i parametri fisiologici degli animali sono ancora nel range di normalità. </li><li> Vite fosforescenza si ottengono per tutti i pixel inserendo il decadimento singolo esponenziale con montaggio non lineare quadrato con ponderazione statistica in Matlab. Fosforescenza vite vengono convertiti nel pO2 valori utilizzando un empirico Stern-Volmer come rapporto (vide infra). </li></ol> 2. Ad alta risoluzione a due fotoni pO2 imaging micro vascolarizzazione corticale del mouse <ol><li> I topi vengono anestetizzati con isofluorene arteria femorale ed è cateterizzati di monitorare la frequenza cardiaca, pressione arteriosa, ed emogasanalisi, così come per la somministrazione del colorante. La temperatura corporea è mantenuta a 37 ± 0,1 ° C e gli animali sono in respiro spontaneo una miscela di aria e ossigeno. </li><li> Una finestra del cranio è preparato secondo la tecnica originariamente sviluppata da David Kleinfeld e Winfried Denk. Una buona cura dovrebbe essere presa per evitare qualsiasi danno del sistema vascolare per evitare possibili perdite del colorante nello spazio interstiziale. </li><li> Un paio di campioni di sangue per misurare i gas di sangue effettuato nel corso di una procedura di preparazione del tutto e la ventilazione e l&#39;anestesia sono adeguati per tenere il gas nel sanguees nel normale range fisiologico. </li><li> L&#39;animale viene spostato al setup di imaging. Un telaio modificato stereotassica che detiene l&#39;animale è posto sotto l&#39;obiettivo. La finestra cranica è al centro del campo visivo nel quadro dell&#39;obiettivo Olympus 4X e posizionato parallelamente al piano focale. </li><li> Un&#39;immagine della finestra del cranio è presa con la fotocamera digitale attraverso gli oculari, e l&#39;obiettivo 4X viene sostituito con l&#39;obiettivo 20X Olympus (NA = 0,95). </li><li> Le misurazioni dei gas del sangue e le regolazioni della ventilazione ed anestesia vengono eseguite fino a quando tutti i parametri fisiologici dell&#39;animale sono all&#39;interno di un range di normalità fisiologico. </li><li> Supponendo che il volume del sangue è di circa il 7% del peso corporeo, una quantità appropriata di la fosforescenza sonda PtP-C343 è disciolto in 0,2 ml di soluzione fisiologica per ottenere ~ 15 mM concentrazione ematica della sonda. La soluzione della sonda viene iniettato attraverso l&#39;arteria femorale. </li><li> Iniziare l&#39;esperimento, impostando gli intervalli di tempo desiderato per l&#39;eccitazione tintura e la raccolta di emissione per ogni pixel. </li><li> Acquisire una scansione sondaggio che è un lento 2-dimensionale di scansione raster di degrado intensità fosforescenza che visualizza la struttura vascolare alla profondità attuale. L&#39;obiettivo si sposta perpendicolarmente al finestrino del cranio (asse Z) e lenta scansione sondaggio 2D di intensità fosforescenza sono effettuate utilizzando la potenza minima laser a 840 nm per trovare la microvasi nel piano di imaging. </li><li> Ad ogni profondità di imaging, basato sulla scansione sondaggio di fosforescenza a quella profondità, un insieme di punti all&#39;interno del sistema vascolare sono selezionati, e la registrazione di decadimenti fosforescenza in ogni punto viene ripetuto per un numero predefinito di media. </li><li> Impostare la quantità desiderata di media, intervallo di misura, e la durata sperimentare e avviare la misurazione. pO 2 misure vengono acquisite nelle posizioni selezionato con la frequenza di misura specificata per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Durante le misurazioni, il software re-indirizza il laser di eccitazione alla località selezionate cambiando la posizione degli specchi scansione del galvanometro. Controllo degli scanner galvanometro, modulatore elettro ottico, e tutte le altre apparecchiature sono eseguite da software personalizzato realizzati in LabView. </li><li> Vite fosforescenza sono ottenuti per tutti i punti selezionati inserendo il decadimento singolo esponenziale con montaggio non lineare piazza in Matlab. Fosforescenza vite vengono convertiti nel pO2 valori utilizzando un empirico Stern-Volmer come rapporto (vide infra). </li><li> Dopo aver raccolto i dati a profondità diverse corticale, iniettare destrano coniugato fluoresceina in vasi per l&#39;imaging della struttura microcircolo. </li><li> Ottenere una pila di immagini strutturali del sistema vascolare eseguendo i due fotoni di imaging di fluorescenza FITC utilizzando un canale verde nei quattro canali del rivelatore. </li><li> Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Sottocommissione del Massachusetts General Hospital di ricerca sulla cura degli animali. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pannello (a) sul lato sinistro di questa figura mostra un ampio campo di vista dell&#39;immagine della pressione di ossigeno prima dell&#39;arrivo di un&#39;onda CSD. Il grafico (b) sul lato destro mostra l&#39;evoluzione temporale della pressione di ossigeno media durante la propagazione CSD all&#39;interno della regione di interesse riportate sul grafico (a). Figura 2 (avi film): Questo film mostra l&#39;evoluzione temporale della pressione dell&#39;ossigeno in tutta la finestra del cranio durante la propagazione dell&#39;onda CSD. Barra di scala indica la pressione dell&#39;ossigeno in millimetri di mercurio. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Proiezione 3D della pila vascolarizzazione immagine. Le tonalità di grigio rappresentano una maschera volumetrico nave, creato sulla base dell&#39;immagine strutturale. PO 2 valori misurati sono colorati. Barra di scala è di 200 micrometri. Ristampato con il permesso di Nature Publishing Group 7.

<ol>
	<li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y., Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+occlusion+to+surface+and+deep+vessels+in+neocortex+via+linear+and+nonlinear+optical+absorption,+Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries.">Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries.</a> Contemporary Neuroscience Series. , (2007).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems.">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials &#38; Interfaces. , (2009).</li><li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence.">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li><li>Sakad&#382;i&#263;, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression.">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li><li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy.">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li><li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li></ol>

Abbiamo dimostrato due applicazioni della misura pO2 nel microcircolo corticale sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Mentre il primo metodo basato sul CCD fornisce immagini a largo campo di vista di pO2 monitoraggio, misurazione della pressione parziale di ossigeno nel microcircolo corticale sulla base di 2-fotoni microscopia fornisce una risoluzione capillare e permette l&#39;imaging in profondità. Entrambi i metodi forniscono ad alta velocità e alto rapporto segnale-rumore misurazioni. Inoltre,...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycopyrrolate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Regent Inc.</td>
<td>NDC 0517-4605-25</td>
<td>Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lidocaine HCL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc.</td>
<td>NDC 0409-4277-01</td>
<td>Used as the local anesthesia during surgeries.</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Baxter Healthcare Corp.</td>
<td>NDC 10019-360-40</td>
<td>Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Chloralose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0128</td>
<td>Used as a general anesthesia during experiments with rats.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein isothio-cyanate&#x2013;dextran</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>FD2000S</td>
<td>Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cerebral blood oxygenation measurement based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence

Monitoraggio delle caratteristiche spazio-temporale di sangue e l&#39;ossigenazione dei tessuti cerebrali è cruciale per una migliore comprensione della neuro-metabolico-vascolari rapporto. Sviluppo di nuove modalità di pO2 misura con il monitoraggio simultaneo di pO2 in grandi campi di vista con maggiore risoluzione spaziale e / o temporale consentirà una maggiore comprensione del funzionamento del cervello normale e avrà anche un impatto significativo sulla diagnosi e cura delle malattie neurovascolari come ictus, il morbo di Alzheimer, e trauma cranico. Modalità di imaging ottico hanno dimostrato un grande potenziale per fornire ad alta risoluzione spazio-temporali e di imaging quantitativo di pO2 sulla base di assorbimento dell&#39;emoglobina nel visibile e nel vicino campo infrarosso dello spettro ottico. Tuttavia, la misura multispettrali di ossigenazione del sangue cerebrale si basa sulla migrazione fotone attraverso il tessuto cerebrale altamente dispersione. Stima e la modellazione dei parametri dei tessuti ottici, che possono subire cambiamenti dinamici durante l&#39;esperimento, è in genere necessario per la stima accurata di ossigenazione del sangue. D&#39;altra parte, la stima della pressione parziale di ossigeno (pO2) sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza non dovrebbe essere significativamente influenzato dai cambiamenti nei parametri ottica del tessuto e fornisce una misura assoluta di pO2. Sistemi sperimentali che utilizzano ossigeno sensibili coloranti sono stati dimostrati in studi in vivo del tessuto perfusi così come per il monitoraggio del contenuto di ossigeno in colture di tessuti, mostrando che tempra fosforescenza è una potente tecnologia di imaging in grado di ossigeno accurate nel fisiologico pO2 gamma. Qui mostriamo con due diverse modalità di imaging come eseguire la misurazione di pO2 nel sistema vascolare corticale basata sull&#39;imaging vita fosforescenza. Nella prima dimostrazione che presentiamo ampio campo di vista di immagine pO2 sulla superficie corticale di un topo. Questa modalità di imaging è relativamente semplice apparato sperimentale basato su una camera CCD e un laser pulsato verde. Un esempio di monitoraggio della depressione corticale diffusione sulla base di tutta la vita fosforescenza di colorante R3 Oxyphor è stato presentato. Nella seconda dimostrazione vi presentiamo una risoluzione elevata a due fotoni pO2 immagini in micro vascolarizzazione corticale di un mouse. Il setup sperimentale comprende un personalizzato costruito 2-fotone microscopio con laser a femtosecondi, modulatore elettro-ottico, fotonica e di conteggio tubo moltiplicatore foto. Vi presentiamo un esempio di imaging l&#39;eterogeneità pO2 nel microcircolo corticale tra capillari, con un romanzo PtP-C343 tintura con maggiore 2-fotoni sezione eccitazione. Clicca qui per visualizzare l&#39;articolo relativo <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici.</a>

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Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Vi presentiamo una procedura sperimentale per la misurazione della pressione parziale di ossigeno (pO2) in vasi cerebrali sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Preparazione degli animali e delle procedure di imaging sono stati delineati per entrambi ampio campo visivo CCD-based imaging di pO2 nel ratto e nel 2-fotoni immagini eccitazione base di pO2 nei topi.

Ossigenazione cerebrale misura Sangue Sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Vi presentiamo una procedura sperimentale per la misurazione della pressione parziale di ossigeno (pO2) in vasi cerebrali sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Preparazione degli animali e delle procedure di imaging sono stati delineati per entrambi ampio campo visivo CCD-based imaging di pO2 nel ratto e nel 2-fotoni immagini eccitazione base di pO2 nei topi.

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

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Neuroscienze

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modello del ratto dell'ipoperfusione lieve intrauterina con stenosi Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Effetti del Neurotrauma indotta da Blast il roditore pressurizzato Middle arterie cerebrali

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Modello di iniezione guancia per la misurazione simultanea del dolore e dei comportamenti correlati all'itch

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Mappatura del flusso sanguigno cerebrale e dei campi elettrici: posizionamento degli elettrodi nei topi

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

Autore in primo piano: Approccio basato sulla stimolazione per migliorare il flusso sanguigno cerebrale nel modello di Alzheimer 

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

Posizionamento di elettrodi stimolanti extracranici e misurazione del flusso sanguigno cerebrale e dei campi elettrici intracranici in topi anestetizzati

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...