<p class="jove_title" style="text-align: justify"> Sintesi procedurale per tutta la termite-gut estrazione del DNA: </p><ol><li> Termiti freddo sul ghiaccio, rimuovere intestino utilizzando una pinzetta sterile e stabilizzare i campioni di intestino nel buffer. </li><li> Omogeneizzare i campioni in PVPP / SDS / buffer fenolo. </li><li> Estrarre e purificare il DNA da lisato grezzo con colonne Qiagen DNeasy. </li></ol><p class="jove_title" style="text-align: justify"> Protocollo: </p><ol><li> Sul ghiaccio, rimuovere il fegato dalle termiti casta lavoratore con pinza sterile. </li><li> Trasferire immediatamente il coraggio e contenuto in una sterile, priva di nucleasi tubo contenente 50 microlitri gelida 1x biologia molecolare grado di buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelare i campioni a -20 ° C, o procedere direttamente con omogeneizzazione. </li><li> Trasferire i campioni di intestino e ad un tampone sterile, priva di nucleasi 2 tubi ml con tappo a vite pre-caricato con 500 mg di sterili zirconia / perle di silice (0,1 mm) e 700 ml di tampone 1x TE contenente 1% w / v polivinilpolipirrolidone (PVPP ). </li><li> Aggiungere 50 ml di solfato di sodio al 20% dodecil (SDS) e 500 ml di fenolo ai campioni. </li><li> Omogeneizzare (battito tallone) sul più alto impostazione con tre cicli di 30 omogeneizzazione sec e 30 sec di raffreddamento sul ghiaccio. </li><li> Sedimento materiale insolubile per 1 min a 8.000 x <em>g.</em> </li><li> Purificare 300-microlitri aliquote del acquosa (superiore) strato con colonne Qiagen DNeasy con il metodo descritto per la purificazione lisato grezzo. </li><li> Quantificare contenuto degli acidi nucleici e congelare i campioni a -20 ° C per un uso successivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns.">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> <em style='font-style: italic'>FEMS Microbiol. Lett</em>. <b>138</b>, 17-22 (1996).</li><li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite,+Reticulitermes+Speratus,+without+Cultivation.">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> <em style='font-style: italic'>Extremophiles</em>. <b>2</b>, 155-161 (1998).</li><li>Mor&#233;, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment.">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> <em style='font-style: italic'>Appl. Environ. Microbiol</em>. <b>60</b>, 1572-1580 (1994).</li><li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites.">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> <em style='font-style: italic'>Appl. Environ. Microbiol</em>. <b>45</b>, 1602-1613 (1983).</li><li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria.">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>314</b>, 1464-1467 (2006).</li><li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method.">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> <em style='font-style: italic'>Appl. Environ. Microbiol</em>. <b>62</b>, 3905-3907 (1996).</li><li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis.">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> <em style='font-style: italic'>Microbiology</em>. <b>149</b>, 2529-2537 (2003).</li><li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+Diversity,+Abundance,+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+(Cubitermes+spp).">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> <em style='font-style: italic'>Appl. Environ. Microbiol</em>. <b>69</b>, 6007-6017 (2003).</li><li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction.">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> <em style='font-style: italic'>Appl. Environ. Microbiol</em>. <b>58</b>, 2292-2295 (1992).</li></ol>

<p> Nella nostra esperienza, il DNA estratto dalle comunità microbiche del legno al seno specie di termiti come nevadensis Zootermopis è sufficientemente puro per il modello PCR dopo un giro di estrazione e purificazione. Tuttavia, alcuni termiti come lettiera al seno e il terreno al seno specie può avere una maggiore concentrazione di acidi umici nel loro contenuto intestinale e può richiedere ulteriore purificazione di DNA microbico intestinale. La resa del DNA totale dalle viscere di 5 lavoratori nevadensis Z. è nel range di 10-30 mg. P...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PVPP/SDS/phenol</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>homogeneization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>DNeasy Tissue Kit</td>
<td>Kit</td>
<td>Qiagen</td>
<td>77607</td>
<td>Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)</td>
</tr>
<tr>
<td>TE</td>
<td>Buffer</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9285</td>
<td>1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate</td>
</tr>
<tr>
<td>zirconia/silica beads </td>
<td>Supplies</td>
<td>BioSpec Products</td>
<td>11079101z</td>
<td>0.1 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PVPP</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6755</td>
<td>1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer </td>
</tr>
<tr>
<td>Zootermopsis nevadensis</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Termites</td>
</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4390</td>
<td>Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>77607</td>
<td>TE-saturated, ~73%</td>
</tr>
<tr>
<td>MiniBeadbeater-8</td>
<td>Tool</td>
<td>BioSpec Products</td>
<td>963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSS</td>
<td>Buffered Salt Solution, pH 7.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Formulation per liter: 2.5 g  K2HPO4, 1.0 g  KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and  10 mL of a 1M soln. of NaHCO3</td>
</tr>
<tr>
<td>AxioPlan-2</td>
<td>Microscope</td>
<td>Carl Zeiss, Inc. USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>
		

extracting dna from the gut microbes of the termite (zootermopsis angusticollis) and visualizing gut microbes

<p class="jove_content">Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente da legno consumando. Il tratto intestinale termite contiene una popolazione microbica densi e ricchi di specie che assiste nella degradazione della lignocellulosa prevalentemente in acetato, la sostanza nutriente chiave alimentando il metabolismo delle termiti (Odelson &amp; Breznak, 1983). All&#39;interno di queste popolazioni microbiche sono batteri, archeobatteri metanogeni e, in alcuni (&quot;inferiore&quot;) termiti, eucarioti protozoi. Così, le termiti sono i soggetti di ricerca di eccellenza per lo studio delle interazioni tra le specie microbiche e le numerose funzioni biochimiche che svolgono a beneficio della loro ospite. La composizione delle specie delle popolazioni microbiche in budella delle termiti così come i geni chiave coinvolti in vari processi biochimici è stata esplorata mediante tecniche molecolari (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall&#39;ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l&#39;estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).</p>

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Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

<p class="jove_content">Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.</p>

Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

15.4K Views.  California Institute of Technology - Caltech. Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.