Studiamo il microbiota che vive nei giardini di funghi sulle formiche che crescono funghi. Vogliamo sapere chi sono e come stanno organizzando questo ecosistema microbico. In particolare, vogliamo sapere come il microbiota interagisce fisicamente con il fungo che le formiche coltivano.
E queste interazioni sono per lo più mediate dal biofilm. Il giardino microbico coltivato dalle formiche è un campione complesso ed eterogeneo composto dal fungo coltivato, dal substrato aggiunto per la coltivazione e dal microbiota. Oltre ad essere molto delicato, è difficile trovare metodi che preservino tutti i componenti del giardino per l'imaging.
I nostri risultati suggeriscono che il microbiota integra le strutture del giardino dei funghi, supportando anche il fatto che possono partecipare alle risposte fisiologiche di questo ambiente. E forniamo anche l'insieme di prove che i biofilm sono importanti per queste interazioni. Il nostro protocollo preserva le strutture fungine nei biofilm, semplificando al contempo altri processi.
Eppure preserva la delicata struttura del giardino, dettagliando ulteriormente l'interazione fisica del microbiota e svelando la struttura spaziale del biofilm. I biofilm sono sistemi cellulari in cui i microrganismi incorporati in una matrice EPS formano reti sociali. L'elettromicroscopia a scansione ci permette di osservare con un dettaglio senza precedenti come il microbiota si organizza spazialmente nel giardino dei funghi, nelle ife circostanti e in tutto il substrato.
Riteniamo che le fasi di preparazione che suggeriamo qui saranno ampiamente applicate per perfezionare gli studi in altri ecosistemi microbici. Per iniziare, individua e contrassegna la colonia di specie di formiche attine. Scava una trincea che circonda l'area del nido fino a quando la camera del giardino non è esposta.
Aprire lateralmente la camera del giardino per evitare che il terreno crolli sulla superficie del giardino. Usando una pinza entomologica, raccogli con cura i campioni del giardino. Trasferisci i campioni del giardino in un contenitore di plastica pulito contenente uno strato di intonaco per bilanciare l'umidità.
Dopo aver trasferito il giardino e le formiche operaie, sigillare ermeticamente il contenitore per evitare che il campione si secchi. Chiudere la trincea utilizzando il terreno precedentemente rimosso. Conservare i campioni del giardino a una temperatura compresa tra 23 e 25 gradi Celsius, fino a un'ulteriore elaborazione.
Per la fissazione del campione, utilizzare una pinza entomologica per rimuovere operaie, uova, pupe e larve dai campioni del giardino. Metti da parte i frammenti di giardino non più grandi di cinque millimetri cubi e aggiungili in un tubo da due millilitri. Quindi, con una pipetta di vetro Pasteur, aggiungere circa un millilitro di soluzione fissativa Karnofsky alle provette per immergere completamente i campioni.
Agitare delicatamente la provetta per lasciare i campioni in ammollo e incubare i campioni a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore. Per iniziare, procurati frammenti di colonie di specie di formiche attine nella soluzione fissativa di Karnofsky. Dopo il fissaggio, rimuovere completamente la soluzione fissativa di Karnofsky utilizzando una pipetta di vetro senza interrompere il campione.
Incubare in serie il campione con un millilitro di concentrazioni crescenti di etanolo, assicurandosi che il campione rimanga indisturbato. Dopo aver rimosso completamente l'etanolo, utilizzando una pinza e una spatola, trasferire con cura il campione in un contenitore per campioni per l'essiccatore dei punti critici. Posizionare il coperchio sul contenitore e immergerlo in un becher di vetro graduato contenente una quantità di etanolo al 100% sufficiente per immergere il contenitore.
Quindi trasferire il contenitore del campione in un altro becher di vetro graduato contenente una quantità sufficiente di etanolo al 100%. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi trasferire il contenitore nell'essiccatore per punti critici.
Per iniziare, procurati frammenti di colonie di specie di formiche attine sottoposte a essiccazione nel punto critico. Per preparare i portacampioni, avvolgere i tronchetti con un foglio di alluminio, coprendo solo la parte superiore. Scrivi il codice o il numero di esempio sul fondo di ogni stub per identificarli, prima di coprire la parte superiore degli stub con del nastro biadesivo di carbonio.
Quindi aprire il coperchio del contenitore del campione e trasferire con cura il campione essiccato in una piastra di Petri di vetro utilizzando una pinza e una spatola. Posiziona con cura i frammenti del campione da giardino sulla superficie appiccicosa del tronco coperto di nastro adesivo. Dopo il rivestimento sputtering con oro, posizionare i tronchetti nel portacampioni per la microscopia elettronica a scansione.
Utilizzare le opzioni sullo schermo o il controllo manuale per regolare l'ingrandimento e la posizione dell'immagine. Spostare lo stage per ottenere una visione completa del campione. Utilizzare la funzione RDC per concentrarsi su aree specifiche.
Quando si osserva una struttura interessante, regolare di conseguenza l'ingrandimento, la messa a fuoco, la luminosità, il contrasto e la stigmatizzazione. Per una corretta stigmatizzazione, utilizzando l'interfaccia utente manuale, spostare il tavolino nelle direzioni X e Y. Regola la velocità raster per controllare la risoluzione dell'immagine.
Regolare l'ingrandimento in base alla parte di cui si sta eseguendo l'immagine. Per salvare l'immagine, utilizzare la funzione di blocco e fare clic sull'icona della foto. Imposta il percorso del file per il salvataggio dell'immagine.
Infine, analizza almeno tre frammenti di giardino, catturando immagini a tutti gli intervalli di ingrandimento menzionati. Le ife fungine nei giardini attini sono state osservate come strutture intatte a forma di tubo che ricoprono la superficie del substrato, indicando un'efficace preparazione del campione. I biofilm diffusi consistevano in cellule microbiche che formavano un sottile strato da una a tre cellule che copriva la superficie del substrato.
