Ringraziamo il Dr. Allison Richard, ex direttore della struttura peptide LSU per la sintesi ligando fluorescente, il Centro per la Ricerca Interdisciplinaray Biotecnologie, UF per il ligando-litica sintesi del peptide, e l&#39;impianto Microscopio Socolovsky per dare accesso al microscopio a fluorescenza. Il finanziamento è stato fornito dal Programma di Sviluppo SERDP esplorativi (SEED) del Dipartimento della Difesa, Dipartimento di Energia e Agenzia di Protezione Ambientale, il Programma AgCenter squadra Biotecnologie interdisciplinare e lo stato della Louisiana.

Esperimento 1: Estrazione del budello termiti protozoi in condizioni anaerobiche <ol><li> Utilizzare una casella di fan (Laboratori Coy) in un vano portaoggetti per far circolare sempre aria attraverso un disseccante e il tipo D catalizzatore Stak-Paks per controllare l&#39;umidità ei livelli di ossigeno e di eliminare le temperature irregolari. Riempire il vano portaoggetti con un flusso continuo di azoto per 20 a 30 min. Monitorare i livelli di ossigeno con un sensore di ossigeno (C-squared, Inc.) per 1 h. Utilizzare l&#39;azoto per raggiungere e mantenere condizioni anaerobiche, quando necessario. </li><li> Preparare Trager U media (Trager 1934) e aggiustare il pH a 7,0. Sparge il setto filtrante sterilizzati nel vano portaoggetti con una miscela di 2,5% di idrogeno, anidride carbonica del 5% e del 92,5% di azoto per 1 ora per rimuovere residui di ossigeno. </li><li> Silanize tutti i materiali tra cui vetrini da microscopio, tubi microcentrifuga, pipette, vetreria, ecc utilizzati negli esperimenti utilizzando Sigmacote per prevenire l&#39;assorbimento di protozoi o peptidi alle superfici (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / mediaLib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Dal intestino termite protozoi sono organismi strettamente anaerobici non devono essere esposti all&#39;ossigeno. Pertanto le seguenti operazioni vengono eseguite in condizioni anaerobiche in una scatola di guanti (vedi 1.1). Con una pinza immergere tutto il corpo di un lavoratore termiti nel 70% di etanolo e ruotare lentamente per circa 10 s per rimuovere i contaminanti di superficie. </li><li> Rimuovere il lavoratore dal etanolo e lasciare asciugare su un Kimwipe pulita per circa 20 s. Utilizzare una sterile punta sottile pinza per tenere l&#39;addome lavoratore e afferrare la punta del ventre con un altro paio di pinze per tirare dolcemente l&#39;intestino verso l&#39;alto o verso il basso in un angolo di 45 gradi. Se l&#39;intestino è tirato in un angolo retto e con troppa forza si rischia di spezzarsi. Place 10 coraggio in una goccia di 100 ul Trager supporti a U su un vetrino da microscopio. </li><li> Pierce il coraggio con un paio di sterili sonde multa dissezione per rilasciare il protozoi e delicatamente trasferire il contenuto intestinale con una pipetta 200 ul in una provetta 1 ml contenente 900 microlitri Trager U media. Dopo aver lasciato per la sedimentazione di frammenti di parete intestinale (5 s), il trasferimento di 900 l di supernatante in una nuova provetta. </li><li> Trasferire 10 ml di cultura protozoi di un vetrino da microscopio sigmacoted e verificare lo stato di protozoi sotto un microscopio a 200 ingrandimenti X. </li><li> Preparare colture di controllo del pyriformis aerobica Tetrahymena protozoi, Amoeba sp., Euglena sp. E Paramecium sp. (Supply Company Carolina biologica, Burlington, Carolina del Nord), così come una cultura durante la notte di Escherichia coli nei terreni di coltura raccomandato dal fornitore. </li></ol> Esperimento 2: ligando Aggiungi accoppiato con un colorante fluorescente per i protozoi ei batteri culture di prova per il legame alla superficie di membrane e pareti cellulari In precedenza avevamo usato librerie phage display (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) per identificare 19 eptapeptide sequenze che si legano ai protozoi (protocolli disponibili http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Un ligando con una sequenza di peptidi (ALNLTLH) che ha mostrato somiglianze con glicoproteine ​​putativo noto dalla membrana Trypanosoma brucei è stato sintetizzato e accoppiato ad un C-terminale sonda fluorescente (EDANS, 5 - ((2-amminoetil) ammino) naftalen-1-solfonico acido, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) mediante sintesi del peptide stato solido (SSP), utilizzando la resina EDANS NovaTag (EMD Biosciences). Qui mostriamo che il ligando si lega al protozoi, che sono stati isolati da nell&#39;intestino delle termiti e altri protozoi a vita libera, ma non ai batteri. <ol><li> Cultura protozoi come descritto nella Exp. 1. Fissare i protozoi con il 10% di formaldeide a 4 ° C per 12 h. </li><li> Centrifugare la soluzione protozoi (30 xg, 10 min), scartare il surnatante e lavare il pellet contenente i protozoi fissa due volte in 1 ml Trager U media. Risospendere il pellet in 1 ml Trager U media. Inoltre, fissare altri protozoi, ed E. coli per i controlli. </li><li> Incubare i microrganismi fissata per 1-2 ore con una soluzione di legante sintetizzato accoppiato al EDANS colorante fluorescente (preparato in acqua) ad una concentrazione finale di 50 micron. Il ligando si scioglie meglio in acqua di Trager U media. </li><li> Osservare i microrganismi al microscopio a fluorescenza a 400 ingrandimenti X ad un massimo di assorbanza a 341 nm e una emissione nella regione blu a 471 nm. </li></ol> Esperimento 3: Test attività protozoacidal del ligando accoppiato ad un peptide litica in vitro (cultura protozoi) Un coniugato del ligando e il peptide litiche Ecate (Mutwiri et al. 2000) è stato sintetizzato in precedenza presso l&#39;impianto di proteine ​​LSU. <ol><li> Silanize materiali e la preparazione dell&#39;intestino cultura termite protozoi nel vano portaoggetti anaerobica unos descritto nel Exp. 1. </li><li> Preparare le culture di microrganismi aerobi controllo (ad esempio, E. coli e le specie protozoi a vita libera pyriformis T.). </li><li> In ambiente anaerobico del vano portaoggetti, pipetta 6 aliquote di 198 ml di cultura protozoi in provette Eppendorf da 0,5 ml. Aggiungere 2 ml di una soluzione 100 mM di ligando-litici peptide alla metà delle aliquote (concentrazione finale 1 micron) della cultura intestino termite protozoi. Aggiungere 2 ml di acqua per l&#39;altra metà delle aliquote (controlli). </li><li> Sul bancone, preparare aliquote simili di E. coli e T. pyriformis con 1 litici peptide microM, ligando-litica peptide o acqua. </li><li> Dopo 1 ora, trasferire 10 ml di ogni cultura protozoi alle diapositive. Confrontare la sopravvivenza dei trattati protozoi a quella dei controlli al microscopio a 200 ingrandimenti X. </li><li> Dopo 1 ora, piatto 100 l di ca. Diluizione 10 -4 della E. culture coli su BHI e incubare a 37 ° C durante la notte. Confrontare il numero di unità formanti colonie sulle piastre. </li></ol> Esperimento 4: L&#39;iniezione del ligando accoppiato ad un colorante fluorescente nel hindgut termite <ol><li> Tirare aghi (modello GD-1, 1 x 900 mm) utilizzando un PC-10 di vetro Narishige estrattore micropipetta con un livello di calore a doppio stadio (65 e 48) per ottenere una dimensione di punta di 20-30 micron. Confermare la dimensione punta misurando sotto un microscopio con un micrometro. </li><li> Riempire un ago con ca. 30 ml di 50 micron di ligando fluorescente segnato in sospensione in acqua tramite una siringa collegata. Riempire un altro ago con acqua per il controllo. Allega una micropipetta (0,5 microlitri e 32 mm di lunghezza, Drummond Azienda scientifico) ad un titolare di un micromanipolatore. Inserire un ago al titolare del sistema di iniezione in un micromanipolatore secondo. Impostare i parametri di iniezione iniziale di circa 1 s lunghezza dell&#39;impulso e 10-12 iniezione psi. Avanzare l&#39;ago lentamente nella micropipetta e iniettare la soluzione con un pedale-driven ad alta velocità, sistema di iniezione elettronica con un controllo lunghezza dell&#39;impulso collegato a un flusso controllato di gas di azoto, che assicura un volume costante è riproducibile iniettato. Dopo l&#39;iniezione, rimuovere la micropipetta e registrare la lunghezza della soluzione iniettata utilizzando un calibro a corsoio. Calcolare il volume iniettato dai parametri noti della micropipetta. Regolare la pressione del gas azoto e la lunghezza degli impulsi di espellere 0,3 ul di soluzione in una singola iniezione. </li><li> Stringere la fine di un addome lavoratore termite con una pinza morbido per rimuovere eventuali escrementi presenti nel retto. Immobilizzare lavoratore termite da loro agghiacciante in ghiaccio per 5 min. </li><li> Fai ricevitori per tenere i lavoratori termite, tagliando 100 puntali microlitri utilizzando un bisturi. Tagliare la punta ad una lunghezza di 10 - 12 mm e utilizzare in base alle dimensioni delle termiti. </li><li> Collegare il ricevitore al micromanipolatore. Mettere un lavoratore in una capsula di Petri sul lato dorsale e aspirare il primo operaio in testa il destinatario utilizzando una pompa di aspirazione di azoto in modo che il capolinea del lavoratore sporge dal ricevitore. </li><li> Tenendo il termite nel ricevitore, con attenzione avanzare l&#39;ago riempito con il micromanipolatore per inserirla nel ano lavoratore. Iniettare 0,3 ml di soluzione (ligando marcato fluorescente o acqua per i controlli). </li><li> Luogo i lavoratori iniettati con legante o acqua in tre diverse capsule di Petri con carta da filtro umida e tenerli a 26 ± 2 ° C con il 78% di umidità relativa </li><li> Estirpare coraggio da termiti iniettato e raccogliere i protozoi dopo 24 ore, come indicato sopra nella Exp. 1. Fissare e osservare i protozoi come mostrato in Esp. 2. </li></ol> Esperimento 5: Test attività protozoacidal del ligando accoppiato ad un peptide litica in vivo (iniezione in termite hindgut) <ol><li> Silanize materiali come descritto nella Exp. 1. </li><li> Preparare una soluzione 500 mM del ligando-litica peptide in acqua. </li><li> Seguire i punti 3,1) attraverso 3,4) per preparare gli aghi di vetro, ricevitori e lavoratori termite. </li><li> Seguendo i metodi descritti in 3.5) iniettare 0,3 ml di soluzione di ligando-litiche peptide (trattamento) o acqua (controllo) nel hindgut di 20 lavoratori termiti. </li><li> Tenere termiti per 24 h, coraggio estirpare dai lavoratori diversi e osservare contenuto intestinale sotto il microscopio, come descritto in 3.6). e 3,7). </li><li> Non appena una morte di protozoi nell&#39;intestino termite è confermata, tenere rimanenti termiti trattati ed i controlli in piastre di Petri con carta da filtro umida e osservare mortalità giornaliera. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Esperimento 1: Di solito, foregut, dell&#39;intestino e hindgut sono ottenuti in un unico pezzo, quando la procedura è seguita correttamente (Figura 1a). I protozoi risiedono in alta densità nelle porzioni anaerobica dei hindgut e può essere rilasciato da perforando la hindgut con una pinza (figura 1b 1 &amp; 2). La più grande protospecie Zoa nell&#39;intestino della termite sotterranea Formosa è il mandrino a forma di P. grassii, che è 200-300 micron di lunghezza e 150 micron di larghezza e può essere visto ad occhio nudo. La specie più grande secondo è la pera a forma di H. hartmanni (50-140 micron di lunghezza e 30-80 micron di larghezza). La più piccola specie è il cono a forma di S. leidyi (15-50 micron di lunghezza e 8-30 micron di larghezza;. Lai et al 1983). Le specie di protozoi sono mostrati nella Figura 2. In condizioni ottimali la cultura delle tre specie di protozoi isolati dall&#39;intestino di termiti sotterranee Formosan rimarrà vivo e in salute per almeno 72 h in anaerobica Trager U media (Figura 3a). Tuttavia, se le condizioni non sono ottimali cultura protozoi morirà rapidamente. Se ci sono residui di ossigeno nei media, il movimento di protozoi cesserà immediatamente. Se la pressione osmotica è troppo alta o l&#39;integrità della membrana è compromessa la membrana superficiale del rigonfiamento si protozoi fuori e la rottura delle cellule (Figura 3b). Se la pressione osmotica è troppo bassa o membrane sono compromesse, protozoi si accartocciano e si restringono (Figura 3c). Esperimento 2: Abbiamo confermato che il ligando accoppiato ad una sonda fluorescente legato a tutte e tre le specie di protozoi dal hindgut di Formosa termiti sotterranee a densità rilevabile. Legame con il ligando si verifica sulla superficie della cellula intera (Figura 4). Siti di legame sono concentrati nella regione anteriore del protozoi sulla axostyle (un foglio di microtubuli) e nucleo in P. grassii. Abbiamo osservato alcuni autofluorescenza irregolare di particelle di legno ingerito dai protozoi. Tuttavia, autofluorescenza è di solito facile da discernere dal legame specifico del ligando, poiché non vi è autofluorescenza della superficie, la axostyle e il nucleo (Figura 4). Abbiamo anche rilevato fluorescenza in tutte le specie testate aerobica protozoi a vita libera (Figura 5), ​​il che suggerisce che il ligando si lega alle strutture generiche ai protozoi. Tuttavia, nessun legame con il ligando è stato osservato per E. coli. Esperimento 3: Un mM di ligando-litica peptide ucciso tutti e tre specie di protozoi dall&#39;intestino dei lavoratori Formosan termiti sotterranee e la vita libera T. pyriformis in vitro in meno di 10 minuti, mentre i controlli rimasto in vita. La Figura 6 mostra la progressiva perdita dell&#39;integrità della membrana dell&#39;intestino termite protozoi trattati con ligando-litica peptide. Membrane rigonfiamento e rottura, avvizzire e morire protozoi. Nessuna differenza è stata osservata nel numero di E. colonie di Escherichia tra i trattamenti di ligando-litica peptide e acqua. Peptide litica senza ligando, tuttavia, ha ridotto il numero di E. colonie di Escherichia notevolmente (Figura 7). Ciò suggerisce che l&#39;attaccamento del ligando in qualche modo protegge i microrganismi non bersaglio da lisi. Esperimento 4: Quando 0,3 microlitri 50 micron del ligando fluorescente marcato è stato iniettato nel hindgut dei lavoratori termiti, l&#39;associazione a P. grassii, S. leidyi e H. hartmanni è stata confermata tramite microscopia a fluorescenza simile a Exp. 2 (Figura 4). Tessuto intestinale termite non ha mostrato fluorescenza. Esperimento 5: Iniezione di 0,3 microlitri 500 micron ligando-litica peptide ucciso tutti e tre specie di protozoi nell&#39;intestino di Formosa termiti sotterranee entro 24 ore. Le termiti sono morti entro 10 giorni dopo la perdita del loro protozoi simbiotica. In precedenza, Husseneder e Collier (2009) iniettato la stessa concentrazione di peptidi litici in budella delle termiti. Senza il ligando attaccato, ha preso più tempo prima che i protozoi nell&#39;intestino (72 h) e le termiti erano morti (sei settimane). Ciò suggerisce che il ligando aumenta l&#39;efficienza protozoacidal di peptidi litici, molto probabilmente legando i peptidi litici ai protozoi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. a: Formosa intestino termite sotterranea di una diapositiva che mostra le principali sezioni dell&#39;intestino (anteriore, medio, hindgut), b 1 e 2: hindgut è trafitto con una pinza per liberare il contenuto dell&#39;intestino che contiene il protozoi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Le tre specie di protozoi flagellati trovato nel hindgut delle termiti di Formosa sotterraneo: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, ec) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Protozoi nella cultura, a) sana protozoi, b) con membrane protozoi sporgenti, c) avvizzite protozoi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La conferma del legame del ligando accoppiato ad una sonda fluorescente per termite intestinoprotozoi (dall&#39;alto verso il basso: P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi), trattati con ligando fluorescente marcata e controlli non trattati (mostrando autofluorescenza). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Di legame a vita libera protozoi aerobica, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, e d) Paramecium. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Il trattamento di protozoi con a) acqua (controllo) e b) 1 mM ligando-litica peptide. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. E. coli colonie su piastre (10 diluizione -4): a) trattati con acqua (controllo), b) trattate con 1 mM ligando-litica peptide, c) trattati con 1 mM peptide litica.

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	<li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+&#946;CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases.">Conjugates of lytic peptides and LHRH or &#946;CG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li><li>Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paratransgenesis+for+termite+control.">Paratransgenesis for termite control.</a> Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+engineered+bacteria+(Escherichia+coli)+to+monitor+ingestion,+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites.">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies.">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li><li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity.">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li><li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+(Isoptera).">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li><li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments.">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li><li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide,+d-Hecate,+on+Trichomonads.">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li><li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate,+Trichomonas+termopsidis,+and+of+certain+other+termite+protozoa.">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ligando-litica peptidi sono stati utilizzati con successo per raggiungere in modo efficace e distruggere le cellule tumorali (Hansel e Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Sulla base di questo concetto, abbiamo sviluppato un ligando eptapeptide che si lega alla superficie di protozoi nell&#39;intestino delle termiti di Formosa sotterranee e accoppiato a un peptide litica con l&#39;obiettivo di distruggere queste obbligare cellulosa digerire simbionti nell&#39;intestino delle termiti per raggiungere termite cont...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDANS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novabiochem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anaerobic glove box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coy Laboratories, Inc.</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intellus environmental controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Percival</td>
<td>I36NL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC-10 Glass micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>GD-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leitz micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vermont Optechs, Inc.</td>
<td>ACS01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research, Inc.</td>
<td>MINJ-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcaps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>1-000-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA fluorescence imaging system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMRxA2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMLB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ61</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

testing protozoacidal activity of ligand-lytic peptides against termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into termite hindgut)

Stiamo sviluppando un nuovo approccio per il controllo delle termiti sotterranee che avrebbe portato alla ridotta dipendenza l&#39;uso di pesticidi chimici. Termiti sotterranee dipendono da protozoi del hindguts dei lavoratori di digerire in modo efficiente legno. Peptidi litici hanno dimostrato di uccidere una varietà di protozoi parassiti (Mutwiri et al. 2000) e anche protozoi nell&#39;intestino della termite Formosa sotterraneo, Coptotermes formosanus (Husseneder e Collier 2009). Peptidi litici sono parte del sistema immunitario aspecifico degli eucarioti, e distruggere le membrane di microrganismi (Leuschner e Hansel 2004). La maggior parte dei peptidi litici non sono suscettibili di nuocere eucarioti superiori, perché non influiscono sul elettricamente neutro colesterolo contenenti le membrane delle cellule di eucarioti superiori (Javadpour et al. 1996). Azione del peptide litica può essere mirata a specifici tipi cellulari con l&#39;aggiunta di un legante. Per esempio, Hansel et al. (2007) ha riferito che peptidi litici coniugati con ligandi dei recettori di membrana di cellule di cancro potrebbero essere utilizzati per distruggere le cellule tumorali del seno, mentre peptidi litici da solo o coniugato con non specifici peptidi non sono stati efficaci. Peptidi litici inoltre sono stati coniugati con ormoni umani che si legano ai recettori sulle cellule tumorali per la distruzione mirata delle cellule del cancro alla prostata e ai testicoli (Leuschner e Hansel 2004). In questo articolo presentiamo le tecniche utilizzate per dimostrare l&#39;attività protozoacidal di un peptide litico (Ecate), accoppiato ad un ligando eptapeptide che si lega alla membrana superficiale di protozoi dall&#39;intestino di termiti sotterranee Formosa. Queste tecniche includono estirpazione dell&#39;intestino dai lavoratori delle termiti, la cultura anaerobica di budello protozoi (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), la conferma microscopici che il legante marcato con un colorante fluorescente si lega l&#39;intestino termite protozoi e altri protozoi a vita libera ma non di batteri o tessuto intestinale. Abbiamo anche dimostrato che il legante stesso accoppiato ad un peptide litici uccide in modo efficiente intestino termite protozoi in vitro (cultura protozoi) e in vivo (microiniezione in hindgut dei lavoratori), ma è meno bacteriacidal che il peptide litica da sola. La perdita di protozoi porta alla morte delle termiti in meno di due settimane. In futuro, saremo geneticamente ingegnere microrganismi che possono sopravvivere nel hindgut termiti e diffondere attraverso una colonia di termiti come &quot;cavalli di Troia&quot; per esprimere ligando-litica peptidi che avrebbero ucciso i protozoi nell&#39;intestino delle termiti e successivamente uccidere le termiti nella colonia . Ligando-litica peptidi potrebbe anche essere utile per lo sviluppo di farmaci contro protozoi parassiti.

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Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Vi presentiamo le procedure per dimostrare che ligandi si legano alla membrana superficiale della cellulosa digestione protozoi nell&#39;intestino delle termiti di Formosa sotterraneo usando la microscopia a fluorescenza e che ligandi accoppiato con peptidi litici uccidere questi protozoi<em&gt; In vitro</em&gt; (Anaerobica cultura protozoi) e<em&gt; In vivo</em&gt; (Iniezione nel hindgut termite).

Testing Protozoacidal di Ligand-litica Peptidi Contro Gut Termite protozoi In vitro (Cultura protozoi) e In vivo (Microiniezione in Termite hindgut)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

testing-protozoacidal-activity-ligand-lytic-peptides-against-termite

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Biology

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

14.8K Views.  Louisiana State University Agricultural Center. Vi presentiamo le procedure per dimostrare che ligandi si legano alla membrana superficiale della cellulosa digestione protozoi nell'intestino delle termiti di Formosa sotterraneo usando la microscopia a fluorescenza e che ligandi accoppiato con peptidi litici uccidere questi protozoi In vitro (Anaerobica cultura protozoi) e In vivo (Iniezione nel hindgut termite).

Video: Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Ricerca

Biologia

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Indagare la comunità microbica nel hindgut Termite - Intervista

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Livelli di simbiosi - Visualizzazione della Comunità hindgut Termite microbica

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Test della barriere fisiologiche di trasmissione virale in Afidi Utilizzando Microiniezione

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...