La dissezione manuale dell'intestino di questo elegan è una tecnica potente ma semplice che consente lo studio di vari aspetti della post biologia isolando il tessuto in popolazioni cellula-specifiche. Questa tecnica di dissezione tissutale su scala fine è facile da eseguire e utilizza attrezzature di laboratorio standard, rendendola un metodo robusto e accessibile per molti. Inizia tirando il capillare di vetro standard lungo 4 pollici e con diametro esterno di 1,2 millimetri in una forma di ago per iniezione usando un estrattore di aghi.
Preparare almeno 5 pipette microcapillari da 50 e 100 micrometri. Utilizzare una micro forgia per forgiare le pipette micro capillari a 50 micrometri o 100 micrometri spuntando rispettivamente 3 o 5 segni di graduazione come indicato dal righello oculare micro forgia sotto la lente dell'obiettivo 5X. Quindi applicare una pipetta micro capillare al tubo dell'aspiratore della bocca.
Preparare un bagno M9 e un bagno tampone di dissezione aggiungendo 2 millilitri di M9 in una capsula di Petri sterile da 35 millilitri di diametro e 2 millilitri di tampone di dissezione all'altra capsula di Petri sterile da 35 millimetri di diametro. Infine, aggiungere 100 microlitri di albumina sierica bovina o soluzione BSA funzionante ad ogni bagno e mescolare ruotando. Per preparare l'array di dissezione aggiungere 150 microlitri di soluzione di levamisolo funzionante al primo pozzetto dei due vetrini di concavità del pozzo e 150 microlitri di tampone di dissezione al secondo pozzetto.
Aggiungere 20 microlitri di soluzione BSA funzionante a ciascun pozzetto. Per sezionare a mano l'intestino del verme caenorhabditis elegans CL2122, spostare 20 vermi adulti dal mezzo di crescita dei nematodi o dalla piastra NGM nel bagno M9 usando un piccone per vermi. Quindi spostare tutti i 20 vermi dal bagno M9 al bagno tampone di dissezione.
Quindi spostare lotti di 10 vermi dal bagno tampone di dissezione nel pozzetto contenente la soluzione di levamisolo. Una volta che il movimento del verme rallenta rapidamente spostarli dal pozzo levamisolo al pozzetto contenente il tampone di dissezione. Lasciare che i worm inizino a muoversi un po' nel buffer di dissezione ben prima di iniziare la dissezione.
Sotto un cannocchiale di dissezione fluorescente, fare un taglio appena dietro la faringe o davanti al retto usando un ago ipodermico per produrre un numero uguale di metà anteriore e metà metà posteriore sezioni dell'intestino. Mentre si attende circa un minuto affinché l'intestino estruda al massimo dal corpo, aggiungere 50 microlitri di tampone chelante al pozzetto per contribuire a ridurre la degradazione dell'RNA. Per facilitare l'estrusione dell'intestino utilizzare la pipetta microcapillare da 100 micrometri attaccata a un aspiratore a bocca e aspirare il verme dentro e fuori dalla pipetta.
Una volta che un intestino è sufficientemente estruso, utilizzare l'ago ipodermico calibro 27 per tagliarlo via dal resto del corpo e da qualsiasi gonade rimanente. Aspirare la sezione intestinale utilizzando la pipetta micro capillare e trasferirla nella provetta microcentrifuga contenente il reagente di isolamento degli acidi nucleici. Mantenere l'intestino isolato sul ghiaccio e ripetere la procedura per l'intestino rimanente.
Questo metodo ha dimostrato il successo della dissezione e dell'isolamento dell'intestino. Il metodo ha anche riportato l'isolamento dell'RNA e la sorveglianza microbica da intestini isolati. Poiché i vermi CL2122 ospitavano il promotore metallico specifico dell'intestino fuso con GFP, l'intestino è stato osservato come un bagliore verde sotto il cannocchiale fluorescente.
La dissezione del verme adulto mostrava un intestino estruso dopo aver praticato un'incisione primaria appena dietro la faringe. La dissezione riuscita di un segmento intestinale è apparsa priva di contaminanti visibili come detriti dalla gonade o dalla carcassa. Al contrario, la dissezione infruttuosa mostrava la gonade e la carcassa attaccate al segmento intestinale.
I rendimenti di RNA dalla dissezione della mano erano più efficienti poiché il campione finale di 60 sezioni intestinali totali produceva circa 15 nanogrammi di RNA totale di alta qualità. La disaggregazione dei vermi e l'isolamento FACS delle cellule intestinali erano meno efficienti in quanto richiedevano centinaia di migliaia di cellule intestinali per ottenere quantità commisurate di RNA totale. L'amplificazione totale del DNA genomico microbico utilizzando un test di rilevamento pan-batterico ha mostrato che il campione finale di 40 sezioni intestinali totali dalle regioni anteriori, medie e medie posteriori ha prodotto la quantità bassa ma rilevabile di circa 0,009 picogrammi di DNA microbico totale.
La cosa più importante da ricordare quando si esegue questa procedura è di non paralizzare eccessivamente i vermi prima della dissezione in quanto ciò può inibire l'estrusione intestinale massima.
