NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01426 Vorremmo ringraziare Raquel Santos per assistenza tecnica.

1. Metodi di consegna sistemica Anche se la consegna di farmaci sistemici non è l&#39;approccio più efficiente per raggiungere elevate concentrazioni del farmaco nel sistema nervoso centrale, le consegne sistemici sono comodi e ben accettato dai pazienti. Qui dimostreremo procedure corrette per tre approcci sistemici solitamente usata somministrazione: iniezione endovenosa, iniezione intraperitoneale, e sonda gastrica. A. iniezione per via endovenosa (Vein iniezione di coda) <ol><li> Prima di iniziare la procedura, il peso corporeo di ogni mouse deve essere registrato. Come per tutti gli studi preclinici, il peso corporeo devono essere controllati regolarmente (due volte alla settimana o più) per valutare la potenziale tossicità dei farmaci. Non oltre l&#39;1% del peso corporeo del mouse in volume dovrebbe essere iniettato in una sola volta. Per esempio, non più di 0,2 ml di liquido deve essere iniettato in un topo 20g. Tutti i fluidi iniettati per via endovenosa deve essere sterilizzati con un metodo appropriato. </li><li> Il mouse deve essere portata per 5-10 minuti utilizzando una piastra elettrica o una lampada di calore per dilatare la vena della coda. Se si utilizza una lampada di calore, monitorare il mouse in qualsiasi momento per evitare l&#39;ipertermia. </li><li> Il mouse è trasferito ad un dispositivo di ritenuta, che trattiene il mouse, consentendo l&#39;accesso alla vena della coda (vedi video). Nella coda di topo ci sono quattro vasi visibili: i vasi sui lati dorsale e laterali sono le vene, e la nave sul lato ventrale è un&#39;arteria. Per accedere alla vena della coda, la coda del topo si tiene presso il punto più distale, e ruotato di 90 gradi in modo che la vena è rivolto verso l&#39;alto. Il sito di iniezione viene pulito con un batuffolo di cotone imbevuto di alcool e una siringa da insulina 28g viene inserito, lato smussato alto, nella vena (vedi video). Se l&#39;ago è correttamente posizionato nella vena, dovrebbe muoversi liberamente e senza pressioni. Iniettare lentamente il farmaco con una pressione uniforme sul 5-10 secondi. Se una bolla appare sulla coda, stop iniezione in quanto questo indica che l&#39;ago non è più in vena. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, applicare una leggera pressione al sito di iniezione fino a quando l&#39;emorragia si ferma. Questa operazione richiede normalmente 30-60 secondi. Monitorare il mouse per 5-10 minuti dopo l&#39;iniezione per assicurarsi che non ci sono ulteriori emorragie. </li></ol> B. iniezione intraperitoneale <ol><li> Prima di iniziare l&#39;iniezione, il farmaco deve essere caricato in una siringa collegata ad un ago 28g. Assicurarsi che ci sia spazio nella siringa per il disegno indietro il pistone prima dell&#39;iniezione (ad esempio, se l&#39;iniezione 200μL, assicurarsi che la capacità siringa è 300μL o superiore). </li><li> Rimuovere il mouse dalla gabbia per la coda e collocarla su una superficie strutturata, in modo che il mouse ha qualcosa da presa. Un coperchio gabbia di solito è sufficiente. Lasciare che il mouse per allungare il suo corpo e poi usare i tuoi mano non dominante, afferrare la pelle sul dorso del mouse, avendo cura di pizzicare leggermente la pelle il più possibile tra il pollice e indice e il medio (vedi video). Girare il mouse in modo che l&#39;addome del mouse è rivolto verso l&#39;alto. Se il mouse può liberamente muovere la testa, rilasciare la presa e riprovare, in modo da evitare di essere morsi durante l&#39;iniezione. </li><li> Con la mano dominante, prendere la siringa ed inserire l&#39;ago con un angolo di 30 gradi nel quadrante in basso a sinistra del mouse (vedi video). Tenendo il mouse leggermente invertita aiuterà spostare gli organi di distanza dal sito di iniezione. Per assicurarsi che l&#39;ago sia nello spazio intraperitoneale, tirare indietro lo stantuffo della siringa. Se qualsiasi liquido o sangue appare nella siringa, poi l&#39;ago non è nello spazio intraperitoneale e deve essere rimosso. Se non fluido è aspirato nella siringa, iniettare il contenuto della siringa con una pressione uniforme sul 1-5 secondi e rilasciare il mouse. </li><li> Monitorare il mouse per 5-10 minuti dopo l&#39;iniezione per assicurare che il mouse ritorna a livelli normali attività. </li></ol> C. orale Gavage <ol><li> Prima di iniziare l&#39;iniezione, registrare il peso del mouse. Il volume massimo che può essere consegnato mediante sonda gastrica è 10 ml per chilogrammo di peso corporeo. Per esempio, il volume massimo di un mouse 20g sarebbe 200μL. Tentare di iniettare maggiori volumi può causare reflusso, che causerà consegna incompleta droga. Se è necessario somministrare maggiori volumi rispetto a quello sopra, fino a tre dosi possono essere somministrate in 24 ore. </li><li> Per evitare la puntura del esofago, è importante misurare la lunghezza dell&#39;ago sonda gastrica per ogni mouse. In possesso di una punta 18g palla ago curvo sonda gastrica al livello dell&#39;ultima costola del mouse, e segnare la lunghezza alla punta della testa del mouse utilizzando un pennarello indelebile (vedi video). Durante la sonda gastrica, questo marchio sarà un punto di sosta quando si inserisce l&#39;ago nella bocca del mouse. </li><li> Trattenere il mouse utilizzando la stessa presa per mano come un&#39;iniezione intraperitoneale. Inserire l&#39;ago sonda gastrica in bocca, sulla lingua, e ADVAUna volta che l&#39;ago attraverso la faringe. Non inserire l&#39;ago passato il segno di fermarsi. L&#39;ago dovrebbe procedere senza intoppi, senza alcuna pressione (vedi video). Se si verificano pressioni, stop e togliere l&#39;ago per evitare l&#39;iniezione di liquido nei polmoni. </li><li> Con l&#39;ago in posizione, spingere il pistone in 1-5 secondi e quindi rimuovere l&#39;ago lo stesso angolo che è stato inserito. Monitorare il mouse per 5-10 minuti, prestando attenzione a eventuali segni di respiro affannoso che potrebbe indicare che il liquido è entrato nei polmoni. </li></ol> 2. Consegna locali Acuta convezione-Enhanced consegna A. Sonda Costruzione Un reflusso resistente cannula CED per i roditori non è ancora disponibile in commercio. Qui si dimostrerà un metodo per la costruzione cannula che è stata adattata da un primo metodo descritto da Krauze et al (Krauze 2005). <ul><li> La cannula ha tre parti (figura 1): 100um tubo di silice di diametro attraverso il quale i flussi infusate, un ago metallico rigido per il supporto strutturale, e tubi flessibili in teflon per il caricamento del infusate. </li><li> Per ottenere l&#39;asta rigida di metallo, usare fiamme libere per fondere la plastica su un catetere Surflo IV (24g stiletto) e con delle pinzette rimuovere l&#39;ago metallico. Il resto del catetere può essere scartata. Tagliare un pezzo di tubo di silice (OD 0,163 millimetri), leggermente più lungo che l&#39;ago metallico, utilizzando un singolo filo della lama di rasoio. Ruolo il tubo di silice in una piccola goccia di cianoacrilato base ad azione rapida adesivo (ad esempio Krazy Glue), avendo cura di non avere la colla sulle estremità del tubo. Inserire il tubo di silice nella ago di metallo e lasciare asciugare per 5 minuti. </li><li> Una volta asciutto, il tubo di silice devono essere saldamente apposta ago. Le estremità della silice deve essere tagliato in modo che sporge di 2 millimetri di silice tubo dal l&#39;estremità appuntita dell&#39;ago e 3mm di silice tubo sporge dalla fine piatta (vedi video). </li><li> Tagliare una sezione di tubo in Teflon 20 cm di lunghezza. Rotolo l&#39;ago di metallo in una piccola goccia di adesivo, sempre facendo attenzione a non prendere la colla sulle estremità del tubo di silice in quanto ciò ostruire la cannula. Inserire l&#39;ago nel tubo in Teflon ad una profondità di 1 cm. Lasciate asciugare per 1 minuto. Utilizzando una pistola per colla, applicare una goccia di colla a caldo al giunto tra l&#39;ago metallico e il tubo in Teflon (vedi video). Assicurarsi che il comune è coperto su tutti i lati e lasciare asciugare per almeno 1 ora. Cannule possono essere effettuate fino a una settimana di anticipo e conservato a temperatura ambiente. </li></ul> B. Procedura di Infusione <ul><li> Per preparare l&#39;area chirurgica, tutte le superfici devono essere irrorate con un disinfettante, come ad esempio una soluzione di clorexidina al 2%. Guanti chirurgici sterili dovrebbero essere indossati durante la procedura. Le superfici vengono poi coperti con drappi assorbente. Le seguenti forniture deve essere posto in zona chirurgica: <ul><li> Riscaldamento pad per mantenere la temperatura corporea del mouse </li><li> Due piccoli piatti Petri, uno contenente perossido di idrogeno al 3%, e uno contenente 2% di clorexidina </li><li> Garza sterile e cotone tamponi </li><li> Bisturi sterili monouso (Numero 21) </li><li> Aghi sterili 22g </li><li> Topo stereotassica telaio </li><li> Controllato tasso di pompa a siringa </li><li> Autoclave del mouse pelle cucitrice, graffette, e rimozione di base </li></ul></li><li> Per configurare la cannula CED, allegare una siringa 1 ml al tubo in Teflon utilizzando un set di adattatori siringa di plastica. La cannula deve essere applicata al telaio stereotassico in modo che sia perpendicolare alla superficie chirurgico (vedi video). Per disinfettare la cannula, riempire la siringa con 1 ml di etanolo al 70% e premere lo stantuffo per eseguire l&#39;etanolo attraverso la cannula. Ripetere questo processo con una soluzione fisiologica sterile, e controllare eventuali perdite intorno alle articolazioni cannula. Per disinfettare la parte esterna della cannula, pulire delicatamente con etanolo al 70% pulire. </li><li> Riempire la cannula con soluzione salina sterile e poi tirare indietro siringa in modo che una piccola bolla d&#39;aria è aspirata nella cannula. Questa bolla d&#39;aria separerà le infusate dal salino nella cannula. Poi, backload tuo infusate (vedi video). Collegare la siringa alla pompa siringa e adescare la pompa con una breve esecuzione della cannula. </li><li> Sedare il mouse utilizzando un anestetico iniettato e preparare la pelle dal tampone più volte (per 5-10 secondi) con un pezzo di garza sterile immerso nella soluzione di clorexidina al 2%. Pomata oftalmica deve essere applicato il mouse per mantenere l&#39;umidità adeguata durante la procedura. Usando un bisturi sterile, creare una incisione sagittale lungo il centro del cranio, lungo circa 1,5 centimetri (vedi video). La superficie del cranio è poi puliti con un tampone di cotone imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Fare attenzione per evitare di perossido di idrogeno agli occhi del mouse. Le linee di sutura del cranio dovrebbe essere evidente a questo punto: se non sono visibili, tampone delicatamente il cranio con un fresh batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di perossido di idrogeno al 3%. </li><li> Identificare il bregma (Figura 2) e quindi misurare 2mm a destra e posteriore 1mm di questa struttura per individuare il sito di infusione. Utilizzando l&#39;ago sterile 22g, delicatamente creare un foro nel cranio, a questo punto ruotando l&#39;ago contro il cranio (vedi video). Evitare assolutamente di forzare l&#39;ago verso il basso contro il cranio. </li><li> A questo punto, il mouse deve essere posizionato nel frame stereotassico e iniziare a ricevere anestesia per via inalatoria (vedi video). Somministrare l&#39;anestetico ad un livello basso (1%), e monitorare attentamente il mouse per i cambiamenti nel tasso di respirazione, regolando di conseguenza l&#39;anestetico. </li><li> Posizionare la cannula sopra il foro del cranio e quindi abbassare 3 mm sotto la superficie del cranio. Iniziare l&#39;infusione, applicando le seguenti aliquote e le durate: <table border="0"><tbody><tr><td> 0,1 microlitri / min per 5 minuti </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="Totale Volume 10 ul" /></td></tr><tr><td> 0,2 microlitri / min per 5 minuti </td></tr><tr><td> 0,5 microlitri / min per 5 minuti </td></tr><tr><td> 0,8 microlitri / min per 7,5 minuti </td></tr><tr><td> OFF per 1 minuto </td></tr></tbody></table></li><li> Al termine dell&#39;infusione, rimuovere lentamente la cannula e tampone del cranio con perossido di idrogeno al 3%. Applicare la cera sterile osso al foro (vedi video). Utilizzando pinze, disegnare la pelle insieme il cranio e fiocco a chiudere. Buprenorfina deve essere somministrato per il post-operatorio del dolore. </li><li> Monitorare il mouse post-operatoria fino a quando non riprende conoscenza e di mobilità. A causa della lunghezza della procedura, può richiedere fino a un&#39;ora per il mouse per riguadagnare piena attività. Durante questo tempo il luogo della gabbia del mouse su una piastra elettrica per evitare l&#39;ipotermia, e non la casa del topo recupero con altri topi attivi. </li><li> Graffette pelle deve essere rimosso una settimana dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ul> C. imaging in vivo Infusate fluorescenza marcato può essere ripreso in seguito alla somministrazione CED, e possono essere monitorati per i cambiamenti di intensità del segnale e posizione del segnale. In genere, è meglio aspettare 2-3 ore dopo l&#39;infusione di immagine, in modo da consentire il mouse per recuperare l&#39;infusione. <ul><li> Per l&#39;anestesia durante l&#39;imaging, usare un basso livello di un anestetico per via inalatoria. Posizionare il mouse, lato dorsale alto, in una stazione di imaging (ad esempio, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Utilizzando un filtro impostazione appropriata per il fluoro, che viene esposta, acquisire un&#39;immagine. Per CED, un infuso di successo dovrebbe mostrare maggior parte del materiale del cervello in prossimità del sito di infusione (Figura 3). </li></ul> 3. Rappresentante Risultati La mancanza di reazione avversa alla somministrazione della terapia è un importante indicatore di iniezione di successo. Per esempio, dopo l&#39;iniezione coda vena ci dovrebbe essere nessun cambiamento di aspetto (ad esempio, dimensioni, colore) della coda. Una bolla o blister dopo l&#39;iniezione coda vena indicherebbe sottocutanea, piuttosto che per via endovenosa, la consegna della terapia. Per iniezioni intraperitoneali, un urto sulla pelle o decolorazione dell&#39;addome può indicare iniezione sottocutanea o danni alle strutture interne. In sonda gastrica, un mouse con respiro affannoso o tosse può indicare che il liquido è stato iniettato nei polmoni, invece che nello stomaco. Per CED, la funzione neurologica è importante per valutare la somministrazione di successo della terapia. Un mouse che sta esibendo convulsioni o emiparesi potrebbe aver ricevuto una infusione improprio. Se un infusate fluorescente viene utilizzato, imaging in vivo può essere applicato per la valutazione della efficacia dell&#39;amministrazione (Figura 3). Se il infusate non è localizzata al sito di iniezione, l&#39;infusione non ha avuto successo. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Cannula CED e Chirurgiche Set-up. Gli elementi di base della convezione avanzata parto chirurgico set-up sono mostrati. Una pompa microinfusion (A) è collegato alla cannula di infusione (B, l&#39;ingrandimento in alto). Una cornice stereotassica (C) viene utilizzato per posizionare la sonda. Questa immagine non comprendono il riscaldamento e le attrezzature anestetico utilizzato anche durante la procedura. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Mouse linee di sutura Teschio. Il sito di infusione CED (stella rossa) può essere localizzato, individuando l&#39;intersezione delle suture sagittali e coronali (il bregma) e poi misura due millimetri laterale e 1 millimetro posteriore del bregma. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Risultati Rappresentante CED di successo. Liposomes etichettati con un far-rosso colorante fluorescente sono state infuse nel cervello di topo da CED e ripreso sia in vivo ed ex vivo. Una infusione di successo mostra un segnale fluorescente localizzato al sito di infusione sia in vivo (A) ed ex vivo (B). Il segnale deve essere localizzata nell&#39;emisfero infusa senza dispersione nell&#39;emisfero controlaterale. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Immagine rappresentante del CED di successo nel tronco cerebrale di ratto. Liposomi fluorescenza-marcato infuse in tronco cerebrale di ratto. Nei ratti, per quanto 20μL può essere infusa. Lo spessore maggiore del cranio ratto e la profondità di iniezione precluso imaging in vivo, ma la posizione infusione corretta potrebbe essere verificato da ex-imaging in vivo del cervello sezionato.

<ol>
	<li>Bobo, R. H., Laske, D. W., Akbasak, A., Morrison, P. F., Dedrick, R. L., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2076-2080 (1994).</li><li>Degen, J. W., Walbridge, S., Vortmeyer, A. O., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+convection-enhanced+delivery+of+gemcitabine+or+carboplatin+in+a+malignant+glioma+model+in+rats.">Safety and efficacy of convection-enhanced delivery of gemcitabine or carboplatin in a malignant glioma model in rats.</a> J Neurosurg. 99, 893-898 (2003).</li><li>Dickinson, P. J., LeCouteur, R. A., Higgins, R. J., Bringas, J. R., Roberts, B., Larson, R. F., Yamashita, Y., Krauze, M. T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Kirpotin, D. B., Park, J. W., Berger, M. S., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+model+of+convection-enhanced+delivery+of+liposomes+containing+CPT-11+monitored+with+real-time+magnentic+resonance+imaging:+laboratory+investigation.">Canine model of convection-enhanced delivery of liposomes containing CPT-11 monitored with real-time magnentic resonance imaging: laboratory investigation.</a> J Neurosurg. 108, 989-998 (2008).</li><li>Gill, S. S., Patel, N. K., Hotton, G. R., O'Sullivan, K., McCarter, R., Bunnage, M., Brooks, D. J., Svendsen, C. N., Heywood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+brain+infusion+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+Parkinson+disease.">Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease.</a> Nature Medicine. 9, 589-595 (2003).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+novel+therapeutic+agents+in+tumors:+physiological+barriers+and+strategies.">Delivery of novel therapeutic agents in tumors: physiological barriers and strategies.</a> J Natl Cancer Inst. 81, 570-576 (1989).</li><li>Krauze, M. T., Saito, R., Noble, C. O., Tamas, M., Bringas, J., Park, J. W., Berger, M. S., Bankiewicz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> J Neurosurg. 103, 923-929 (2005).</li><li>Krauze, M. T., Vandenberg, S. R., Yamashita, Y., Saito, R., Forsayeth, J., Noble, C. O., Park, J. W., Bankiewicz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+real-time+convection-enhanced+delivery+of+liposomes+to+primate+brain:+a+long-term+retrospective.">Safety of real-time convection-enhanced delivery of liposomes to primate brain: a long-term retrospective.</a> Exp Neurol. 210, 638-644 (2008).</li><li>Murad, G. J., Walbridge, S., Morrison, P. F., Garmestani, K., Degen, J. W., Brechbiel, M. W., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+image-guided,+convection-enhanced+delivery+of+interleukin+13+bound+to+pseudomonas+exotoxin.">Real-time, image-guided, convection-enhanced delivery of interleukin 13 bound to pseudomonas exotoxin.</a> Clin Cancer Res. 12, 3145-3151 .</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Szerlip, N. J., Walbridge, S., Yang, L., Morrison, P. F., Degen, J. W., Jarrell, S. T., Kouri, J., Kerr, P. B., Kotin, R., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> J Neurosurg. 107, 560-567 (2007).</li><li>Yamashita, Y., Krauze, M. T., Kawaguchi, T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Park, J. W., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+a+topoisomerase+I+inhibitor+(nanoliposomal+topotecan)+and+a+topoisomerase+II+inhibitor+(pegylated+liposomal+doxorubicin)+in+intracranial+brain+tumor+xenografts.">Convection-enhanced delivery of a topoisomerase I inhibitor (nanoliposomal topotecan) and a topoisomerase II inhibitor (pegylated liposomal doxorubicin) in intracranial brain tumor xenografts.</a> Neuro Oncol. 9, 20-28 (2007).</li></ol>

Tutte le procedure dimostrato qui è stato approvato dal Institutional Animal Care UCSF e del Comitato Usa.

Valutazione preclinica dell&#39;efficacia di qualsiasi agente terapeutico deve tenere in considerazione le proprietà farmacologiche di un agente e il tessuto bersaglio di interesse. Mentre i metodi di somministrazione sistemica sono in generale più facile e meglio tollerato dai pazienti, la selettività della barriera emato-encefalica spesso necessita di consegna locale della terapia per il trattamento delle malattie del SNC. Qui, abbiamo dimostrato un metodo di consegna diretta al cervello: CED. Altre forme di consegna locale al cervello comprendono la somministrazione diretta al fluido cerebro-spinale, l&#39;iniezione in bolo intratumorale, e l&#39;iniezione ventricolare. Per questi metodi, diffusibilità di terapeutico è di fondamentale importanza, con scarsa diffusione limitando la regione di copertura a pochi millimetri dal sito di iniezione (Jain 1989, Bobo 1994). Al contrario, CED utilizza la pressione positiva per aumentare l&#39;area di distribuzione della droga (Bobo 1994), pur consentendo targeting terapeutico per specifiche strutture neuroanatomiche. Nel nostro laboratorio, abbiamo effettuato con successo CED nel tronco cerebrale e nel caudato putamen nei roditori (Figura 4). La capacità di condurre CED in modelli di roditori è diventato sempre più importante in associazione con crescente interesse a massimizzare l&#39;efficacia terapeutica nel trattamento di vari tipi di malattie del SNC. CED possono essere usati per fornire una varietà di agenti, tra cui proteine ​​purificate, le droghe piccola molecola, e virus (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). La gamma di malattie che possono essere trattate con CED include tumori del sistema nervoso centrale (Yamashita 2007) così come le malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (Gill 2003). Come la ricerca CED continua ad espandersi, la necessità di imaging in vivo di CED terapia somministrata è allo stesso modo in aumento. Mentre l&#39;immagine fluorescente dimostrato qui probabilmente non sarà visibile attraverso il teschio umano, utilizzando altri metodi di co-infusione di agenti di contrasto per risonanza magnetica (Dickinson 2008) stanno suscitando interesse per valutare l&#39;applicabilità per il monitoraggio sostanze infuse nei pazienti con malattia sistema nervoso centrale.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2% Chlorhexidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9756995</td>
<td>AKA &#x201C;Nolvasan&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>20g Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>28g Needle (with syringe)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-004-270</td>
<td>AKA Insulin Syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>H312P-4</td>
<td>Store away from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-400-100</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate-based Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9592632</td>
<td>AKA &#x201C;Krazy Glue&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Feather</td>
<td>2975</td>
<td>No. 21</td>
</tr>
<tr>
<td>Gauze</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22028563</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dunlap</td>
<td>HP950</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I.V. Catheter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-841-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infusion Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BASi</td>
<td>MD-1000, MD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Image Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>Contact for Quote</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic Ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cardinal Health</td>
<td>1272830</td>
<td>AKA &#x201C;Akwa Tears&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic Syringe Adaptors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td>
<td>Fits on Luer Lock Syringes</td>
</tr>
<tr>
<td>Silica Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin Stapler, Staples, Remover</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>59020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725</td>
<td>&nbsp;</td>
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systemic and local drug delivery for treating diseases of the central nervous system in rodent models

Approfondito test preclinici del sistema nervoso centrale (SNC) terapie include una considerazione di vie di somministrazione e di biodistribuzione agente nella valutazione dell&#39;efficacia terapeutica. Tra le due categorie principali di amministrazione, locale vs sistemica, gli approcci sistemici di consegna sono spesso preferiti a causa della facilità di somministrazione. Tuttavia, la consegna sistemica può determinare concentrazione del farmaco non ottimale stato raggiunto nel SNC, e condurre a conclusioni errate per quanto riguarda l&#39;efficacia degli agenti. Locali metodi di somministrazione dei farmaci sono più invasive, ma possono essere necessarie per raggiungere livelli terapeutici farmaco sistema nervoso centrale. In questo studio dimostriamo tecnica corretta per tre vie di somministrazione dei farmaci sistemici: iniezione endovenosa, iniezione intraperitoneale, e sonda gastrica. Inoltre, mostriamo un metodo per la consegna locale al cervello: convezione-enhanced consegna (CED). L&#39;uso di composti marcati con fluorescenza è incluso per imaging in vivo e la verifica della corretta somministrazione del farmaco. I metodi sono presentati utilizzando modelli murini, ma può essere facilmente adattato per l&#39;utilizzo nei ratti.

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Approfondita sperimentazione preclinica di farmaci che agiscono nel sistema nervoso centrale spesso comporta la valutazione e il confronto biodistribuzione farmaco in associazione con percorsi specifici di somministrazione. Qui, tre metodi comunemente usati di consegna sistemica (per via endovenosa, intraperitoneale e orale), nonché un metodo per la consegna locale (convezione-enhanced consegna) sono dimostrati nei topi.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

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30.2K Views.  University of California, San Francisco - UCSF. Approfondita sperimentazione preclinica di farmaci che agiscono nel sistema nervoso centrale spesso comporta la valutazione e il confronto biodistribuzione farmaco in associazione con percorsi specifici di somministrazione. Qui, tre metodi comunemente usati di consegna sistemica (per via endovenosa, intraperitoneale e orale), nonché un metodo per la consegna locale (convezione-enhanced consegna) sono dimostrati nei topi.

Video: Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Ricerca

Neuroscienze

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Una batteria di Test computerizzato per studiare effetti farmacodinamici sul sistema nervoso centrale di farmaci colinergici in fase precoce di sviluppo di farmaci

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...