Vorremmo ringraziare Curt Mazer da Isis Pharmaceuticals per fornire consulenza di pertinenza della chirurgia ICV bolo, così come Isis Pharmaceuticals nel suo complesso per fornire il nostro laboratorio su ASOS. Inoltre, vorremmo ringraziare Carey Shaner per la revisione di questo articolo. TMM e SLD sono sostenute da sovvenzioni NIH P50AG005681, K08NS074194 e R01NS078398.

Il protocollo seguito è stato approvato dalla cura degli animali Istituzionale e utilizzare i comitati alla Washington University di St. Louis ed è in conformità con il National Institutes of linee guida di salute per l&#39;uso di animali da laboratorio. Se questa è la prima volta che l&#39;esecuzione di interventi chirurgici, si consiglia guardando l&#39;articolo JoVE su interventi chirurgici di roditori come introduzione prima di iniziare 14. ASO possono essere consegnati al sistema nervoso centrale del mouse sia attraverso infusione pompa osmotica e una singola iniezione in bolo ICV. A causa di questo, la procedura descritta di seguito è suddiviso in due segmenti. Pro e contro di ciascun metodo verranno toccati nella sezione Discussione. Le coordinate utilizzato nei protocolli sono per adulti C57BL6 e B6C3 topi. Coordinate ratto corrispondenti si trovano nella tabella 1. Alzet pompa osmotica 1. Preparazione di Alzet Pompe osmotici <ol><li> Stabilire un drap sterileE e rilasciare attentamente le seguenti voci su di esso facendo attenzione a non toccare direttamente tutto pur di mantenere la sterilità: pompa osmotica (s), modulatore di flusso (s), 1 ml siringa sterile (s), bisturi, e le sezioni di tubo (1 pezzo di tubo = 5 pompe). Per i topi, ci sono tre opzioni per le pompe: 14 giorni, 28 giorni, e 42 giorni (Figura 2A). </li><li> Stappare e riempire sterili provette coniche da 50 ml con soluzione fisiologica ml 15-20. Fino a 6 pompe assemblate possono essere aggiunti per ogni tubo conico. </li><li> Riempire un piatto p60 Petri con il 100% di etanolo. Aggiungere il numero appropriato di cateteri a etanolo. Per i topi, la lunghezza del catetere è di 2,5 mm. </li><li> Filtrare ogni ASO in tante provette da 1,5 ml Eppendorf, se necessario. Include un tubo Eppendorf riempito con soluzione fisiologica 0,9% sterile per riempire il tubo con. </li><li> Una volta che tutto è pronto, indossare guanti sterili. Assicurarsi di non toccare nulla che non sia sterile. Cambiare i guanti se necessario. </li><li> Per ogni ASO da utilizzare, riempire una siringa da 1 mle loadpumps posizionando l&#39;ago nel foro superiore e lentamente riempiendo fino perdite in eccesso fuori. Continuare fino a quando tutte le pompe sono riempiti. </li><li> Stappare le flow-modulatori e inserire nelle pompe. Spingere il flusso-modulatore quasi tutto il modo in, lasciando un&#39;apertura di mm 3-5. </li><li> Utilizzando la lama del bisturi, tagliare ogni pezzo di tubo in 5 segmenti uguali. Prendere un pezzo di tubo, riempire con soluzione salina sterile utilizzando una siringa da 1 ml, ed inserire la parte superiore del modulatore di flusso in una estremità del tubo. Poi prendere una cannula da etanolo e collegarlo all&#39;altra estremità del tubo. La pompa è montata. </li><li> Collocare la pompa completamente assemblato nella sterile da 50 ml tubo conico con soluzione fisiologica per l&#39;innesco. L&#39;adescamento consente per le pompe ad assorbire fluido di avviare il rilascio di farmaci e venire alla temperatura corretta. Il tempo di aspirazione: 14 pompe giorno: 4-6 ore, 28 pompe di giorno: 40 ore, 42 pompe di giorno: 60 ore. Una volta terminato il montaggio delle pompe, tappare i tubi conici e posto in un ambiente pulito37 ° C bagnomaria fino chirurgico. </li></ol> 2. Procedura di pre-chirurgica <ol><li> Pulire tutto giù con il 70% di etanolo per sterilizzare la zona e fissare teli sterili sul piano del tavolo e stereotax per creare un campo sterile. È importante essere consapevoli del campo sterile tutta la chirurgia. Accendere il seguente: sterilizzatore Perlina, Pad Riscaldamento, luce, lettura digitale, e Ossigeno / Sistema Isoflurano (Figura 1). </li><li> I seguenti elementi saranno necessari se facendo un singolo intervento chirurgico o di un intero lotto di interventi chirurgici come noi abitualmente facciamo: 1 paio di pinze, 1 pinza emostatica curva, 1 paio di piccole forbici, 1 paio di piccole forbici spuntate curve, 1 ratto taglierina dell&#39;osso , 1 pinza emostatica retta, 5-0 punti di sutura in nylon, 1 tubi conici con il 70% di etanolo, 1 tubo conico con il 95% di etanolo, 1 tubo conico con iodio, 1 tubo conico con perossido di idrogeno, pacchetto di tamponi di cotone sterile, 1 bottiglia di super colla, 1 tubo di pomata antibiotica, 1 tubo di occhiolubrificante, e 1 rasoio elettrico. </li><li> Inserire le punte di entrambe le coppie di forbici, pinze, e emostatica curva nello sterilizzatore tallone per 15 sec. Rimuovere e mettere in etanolo al 70%. Quando si esegue più di un intervento chirurgico, sterilizzare nuovamente le punte degli strumenti in tra animali. </li><li> Ruotare la isoflurano al 4% e O 2-0,4 L / min e flusso di gas diretto alla camera. Abbiamo il nostro sistema / ossigeno isoflurano calibrato almeno una volta all&#39;anno per assicurare che stiamo fornendo la giusta quantità di anestesia. Posizionare il mouse nella camera e attendere che la respirazione è notevolmente rallentato. Rimuovere il mouse ed eseguire un pizzico punta a garantire il mouse è completamente incosciente. </li><li> Radere i peli dalla parte superiore della spalla fino a tra gli occhi. Se il mouse comincia a svegliarsi, posizionare il mouse nuovamente nella camera fino a quando il mouse è ancora del tutto inconsapevole, confermando con un pizzico punta. Posizionare il mouse anestetizzato sulla stereotax e spingere il cono sopra il naso.Sii gentile come i denti e le ossa sono fragili. </li><li> Dirigere il flusso del gas al stereotax per mantenere il mouse anestetizzato. E &#39;importante controllare di tanto in tanto per assicurarsi che il mouse è completamente incosciente con un pizzico punta tutta la chirurgia. Fissare la testa con le barre di orecchio. Preferiamo livellamento barre orecchio, sebbene di indirizzare il ventricolo laterale, un cranio perfettamente piano non è necessaria a causa delle grandi dimensioni del ventricolo. </li><li> Girare il livello isoflurano fino al 2,0% per la manutenzione. Dab occhio unguento su ogni occhio. Come si vede nel video, giaceva un telino sterile sopra il mouse in modo che solo la base del collo e della testa sono esposti. Poi disinfettare la zona chirurgica pulendo la sommità della testa e del collo con un movimento circolare partendo dal centro dell&#39;area rasata e spostando verso l&#39;esterno prima con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 95%, seguito da un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. </li><li> Si consiglia di utilizzare un sistema di retroazione rettale sonda temperatura controllata di riscaldamento che assicurala temperatura del topo rimane ad una stabile 37 ° C. Se la temperatura del mouse diminuisce durante l&#39;intervento, il recupero post-chirurgico può richiedere più tempo e l&#39;ipotermia risultante può portare ad attività della proteina aberrante, compresa iperfosforilazione dei microtubuli proteina Tau associata 15. Dopo aver impostato il sistema di riscaldamento, si è ora pronti per iniziare l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 3. L&#39;impianto di Alzet pompa osmotica <ol><li> Prima di iniziare l&#39;intervento, messo su un nuovo paio di guanti sterili. Poi, con pinze e un piccolo paio di forbici, fare una incisione nella pelle dalla base del collo sopra cranio dell&#39;animale fino tra gli occhi </li><li> Prendere le forbici smussate con la curva rivolta verso l&#39;alto e far scorrere sotto la pelle alla base della parte posteriore del collo verso hindlimb sinistra. Non ci dovrebbe essere alcuna resistenza. Se non c&#39;è, togliere le forbici e riprovare. Questo forma la tasca sottocutanea per la pompa osmotica. </li><li> Wipe il cranio pulita con tamponi di cotone sterile, seguito da un batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata per migliorare bregma. </li><li> Pulire i ml provette coniche 50 che contengono le pompe per mantenere la sterilità delle pompe. Prendere accuratamente una pompa dal tubo conico utilizzando all&#39;emostato curvo, avendo cura supplementare che la pompa non tocca i lati del tubo conico. Tenere la base della pompa con una pinza e spingere il modulatore flusso nel resto del modo con la pinza emostatica ricurva. </li><li> Tenere la pompa dove il modulatore di flusso e tubi si incontrano con la pinza emostatica curva. Inserire la pompa sotto la pelle alla base del collo e spingerlo indietro verso la hindlimb sinistra fino a fine corsa senza resistenza. Fare attenzione a non lasciare che il tocco niente catetere. </li><li> Con la pinza emostatica curva, afferrare la cannula alla scanalatura in cui la parte superiore incontra il piedistallo. Spostare il driver cannula in posizione e fissarlo in posizione. </li><li> Posizionare una singola goccia di colla super sulla base della cannula. Push la parte superiore della cannula nel conducente e posizione in modo che il tubo sia puntato subito indietro. </li><li> Toccare la punta del catetere di bregma e azzerare le coordinate sul display digitale. Sollevare e spostare il catetere 1,1 millimetri lateralmente verso destra e 0,5 mm posteriormente (Figura 2B). Tenere la pelle fuori strada con la pinza emostatica curva. </li><li> Guidare il catetere metallico sottile attraverso il cranio fino alla pressione saldamente la base cannula di plastica contro la parte superiore del cranio. Il catetere di metallo può essere guidato direttamente attraverso il cranio nei topi a causa della relativa cranio sottile. Se si utilizza ratti, praticare un foro nel cranio prima di abbassare il catetere. </li><li> Tirare qualsiasi pelle che ha colla su lontano dal cranio. Con il driver cannula tenendo la cannula / catetere in posizione, attendere 1-2 min per la colla per asciugare completamente. </li><li> Quando si pratica, per valutare il posizionamento del catetere, iniettare 20-40 ml di 2,5% FastGreen Dye attraverso il tubo (Figura 2C). Attendere 2-3 minuti, perfuse il mouse con PBS 1X 0,03% eparina, e rimuovere il cervello. Tagliare coronale al sito del catetere. Se il catetere è stato posizionato nel ventricolo, il colorante viene perfuso in tutto il sistema ventricolare del mouse (Figura 2D). </li><li> Tenere il catetere in posizione con la pinza emostatica curva, aumentando nel contempo il conducente. Rilasciate lentamente all&#39;emostato per assicurare che la cannula sia correttamente fissato al cranio. </li><li> Con un tampone di cotone, premere sulla parte superiore della cannula. Montare i Clippers ossei ratto nel boschetto tra la parte superiore e la base della cannula. Agganciare la parte superiore della cannula mentre ancora premendo con il bastoncino di cotone. Cercare di mantenere il livello tagliaunghie in modo da non staccare la cannula dal cranio. Se la cannula fa venire scollata, in modo rapido re-incollare e applicare una pressione con un tampone di cotone per altri 2 min. </li><li> Usando il filo di sutura 5-0, emostatico regolare, e pinze, sutura lungo la piena apertura, prestando particolare attenzione a destra sopra la cannula. Usiamo un running orizzontale materasso sutura (vedi Figura 5) in virtù della grande incisione sul cranio. </li><li> Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica sulla testa e sul collo. Svitare l&#39;orecchio bar e allentare il cono di naso. Rimuovere il mouse dalla stereotax e posto su un rilievo di riscaldamento per il recupero. Monitorare i topi strettamente per la durata del recupero, in genere comprese tra 10-30 minuti. Verificare ogni 2-3 minuti fino a quando il mouse comincia a camminare in giro e che si governa. </li></ol> 4. Assistenza post-operatoria <ol><li> Monitorare i topi al giorno dopo l&#39;intervento chirurgico per la prima settimana. </li><li> Se il mouse sembra essere nel dolore o disagio, si consiglia di fornire il mouse con un mg / kg iniezione sottocutanea di 5 Carprofen una volta ogni 24 ore per 5 giorni, al fine di alleviare il dolore. </li><li> Se vi sembra essere un&#39;infezione, applicare generosamente pomata antibiotica all&#39;area quotidiana e consultare un veterinario che si occupa di assicurare che la ferita guarisce correttamente. </li><li> RTogliete il 5-0 sutura in nylon 7-10 giorni dopo l&#39;intervento per evitare irritazioni dal filo di sutura. </li></ol> 5. Modifica o rimozione Alzet pompa osmotica Dopo che la pompa è fatto infondendo attivamente ASO, può essere modificato o completamente rimosso. <ol><li> Seguire la stessa procedura di pre-chirurgia come sopra, con le seguenti modifiche: 1) non sarà necessario le forbici curve, emostatica curva, frese ossee ratto, né il display digitale, e 2) invece di preparando la testa del topo, barba e disinfettare la parte posteriore del mouse all&#39;incrocio tra la pompa e il tubo. </li><li> Fare una incisione 1,5 cm sul retro del mouse, perpendicolare alla giunzione pompa / tubi, con pinze e forbici. Estrarre con cautela la pompa fuori l&#39;incisione senza significativamente trazione / spinta sul tubo come può urtare il catetere. </li><li> Per rimuovere la pompa, tagliare il tubo di circa 0,5 cm al di sopra del modulatore di flusso e di toccare la supercolla per il tubo to sigillo chiuderlo. Attendere 1-2 min per asciugare la colla. Riposizionare il tubo nella incisione e sutura chiusa. Dab pomata antibiotica sulla pelle suturata e posizionare il mouse su un blocco di recupero riscaldato. </li><li> Per cambiare la pompa, hanno appena fatto pompe pronto insieme a un piatto di 10 cm riempito con il 95% di etanolo. Cateteri non sono necessari con le nuove pompe. </li><li> Afferra una nuova pompa con le pinze. Immergere le dita in etanolo, prendere in mano la pompa, e scartare il flow-modulatore. Poi, con cautela e lentamente tirare fuori la vecchia pompa dal modulatore di flusso attaccato al tubo e cannula. Non appena è spento, far scorrere lentamente la nuova pompa, assicurando che il modulatore di flusso non tocca mai l&#39;esterno del mouse. </li><li> Reinserire la nuova pompa attraverso l&#39;incisione di nuovo nel pacchetto sottocutaneo e sutura la cute. Dab pomata antibiotica sulla ferita del mouse e posto sul pad di recupero. </li><li> Proprio come con l&#39;impianto pompa, monitorare i topi al giorno dopo l&#39;intervento chirurgico per verificare pain / disagio e infezioni. Trattare con Carprofen e antibiotici come ritenuto necessario. </li></ol> ICV BOLO 6. Procedura di pre-chirurgica <ol><li> Seguire la stessa procedura di pre-chirurgia come nella Sezione 2 di cui sopra con le seguenti modifiche: 1) non sarà necessario forbici curve, emostatica curva, o utensili da taglio osseo di ratto; 2) Pulire a 10 microlitri Hamilton siringa e l&#39;ago con acqua sterilizzata e carico con ASO e 3) fissare la siringa e l&#39;ago per l&#39;apparato stereotassico in cui si trovava il conducente cannula. </li></ol> 7. Bolo di ASO <ol><li> Con pinze e un piccolo paio di forbici, fare un&#39;incisione dalla base del collo fino a tra gli occhi. </li><li> Pulire il cranio puliti con tamponi di cotone sterile, seguita da un batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata per migliorare bregma. </li><li> Portare la siringa / ago in posizione e fissare. Assicurarsi che la parte smussata dell&#39;ago affronta posteriore. Abbassarel&#39;ago finché non tocca bregma. Azzerare tutte le coordinate. Spostare l&#39;ago lateralmente verso destra 1,0 millimetri e 0,3 millimetri anteriore (Figura 3A). </li><li> Guidare lentamente l&#39;ago attraverso il cranio solo fino a quando il foro dell&#39;ago è a filo con la parte superiore del cranio. Ancora una volta, questo può essere fatto a causa dello spessore ridotto del cranio mouse. Azzerare la coordinata z ed abbassare l&#39;ago -3.0 mm ad una velocità di 1 mm / sec (Figura 3B). Attendere 2-3 minuti per il cervello per sigillare intorno all&#39;ago. </li><li> Consegnare il pieno 10 ml di ASO a una velocità di 1 ml per sec. Attendere 2-3 minuti. Usiamo una velocità di infusione 1 ml per ASOS nel ventricolo, anche se questo tasso può variare tra diversi farmaci. Quando si pratica, verificare il corretto posizionamento dell&#39;ago, fornendo 10-20 ml di 2,5% FastGreen Dye. Perfondere il mouse con 1X PBS 0,03% eparina presto dopo infusione colorante e rendere sezioni coronali del cervello per verificare che il colorante è nel sistema ventricolare (Figura 3C). </li> &lt;li&gt; Tenere premuto un tampone di cotone contro il cranio alla base dell&#39;ago. Sollevare l&#39;ago a una velocità di 1 mm al sec. Appena l&#39;ago è fuori del cranio, rotolare il tampone di cotone sopra il foro dell&#39;ago e tenere per 1 min per impedire qualsiasi fuoriuscita ASO. </li><li> Suturare la pelle chiuso, applicare pomata antibiotica, e il luogo del mouse sul tappetino di recupero riscaldato. A seconda della concentrazione ASO, potrebbero essere necessari 20 minuti per un paio d&#39;ore per riprendersi completamente. </li><li> Proprio come con l&#39;impianto della pompa, controllare i topi al giorno dopo l&#39;intervento chirurgico per controllare il dolore / disagio e infezioni. Trattare con Carprofen e antibiotici come ritenuto necessario. </li></ol>

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Gli autori ricevono le loro oligonucleotidi antisenso di Isis Pharmaceuticals.

La capacità di fornire farmaci globalmente nel SNC come mostrato nel video è una tecnica estremamente potente che è facile da imparare ed usare. Con la pratica, un singolo impianto di pompa o un ICV bolo può essere completato in 10 min, consentendo ampie coorti di topi da trattare contemporaneamente. Ciò è particolarmente utile per gli studi con una lettura del comportamento, come un numero maggiore per il comportamento del mouse sono fondamentali per aiutare a vedere differenze significative. Sulla base delle nostre esperienze offrendo ASO tramite pompe e iniezioni in bolo, abbiamo osservato alcuni pro e contro di ciascun metodo. Va notato che queste sono le opinioni in nostro laboratorio e potrebbero non essere vero per tutti i modelli di topo e di ratto. Troviamo un vantaggio di utilizzare delle pompe è la loro capacità di fornire una elevata quantità di ASO poiché l&#39;ASO è distribuito su un periodo molto più lungo di tempo. Questo di solito equivale a knockdown più sostenuta o splicing dopo attivoASO infusione, anche se questo potrebbe non essere sempre così. Le pompe consentono anche un calendario preciso di consegna ASO (14 giorni, 28 giorni o 42 giorni) e le pompe possono essere cambiati una volta per consentire ancora più a lungo attivo ASO infusione. Tuttavia, abbiamo notato che cambiando le pompe più di una volta aumenta la variabilità dovuta alla formazione di tasche fibroso intorno alla pompa che evitare che la pompa liquido appositamente assorbente. Uno svantaggio delle pompe è che alcuni topi non tollerano la pompa così come gli altri. Se la linea transgenica si sta lavorando è più fragile, una pompa può essere troppo ingombrante. Le pompe hanno anche bisogno di essere rimosso dopo l&#39;infusione finale, sottoponendo i topi ad un altro intervento chirurgico e l&#39;anestesia aggiunto. Se facendo opera comportamento, è particolarmente importante rimuovere la pompa e lasciarla per almeno 1-2 settimane di recupero in quanto la presenza della pompa interesserà alcuni comportamenti nei topi. Con ICV bolo iniezioni, un vantaggio è il costo. Vi è uninvestimento iniziale per l&#39;acquisto di siringhe e aghi, ma nel corso del tempo, iniezioni in bolo sono più convenienti in quanto non ci sono pompe / tubi / cateteri per l&#39;acquisto. In generale, c&#39;è meno up-tenere con le ICV iniezioni in bolo a causa della mancanza di cannule e pompe. Troviamo anche che ICV bolo possono essere usati per fornire ASO ai topi più giovani fragili e / o più. Uno svantaggio del ICV bolo è che è una singola iniezione. Non tanto generale ASO può essere fornito attraverso questo percorso, e se la durata di azione della ASO in uso è breve, gli effetti knockdown / splicing sarà anche di breve durata. Entrambe le pompe osmotiche nonché il bolo ICV hanno la capacità di fornire ASOs knockdown proteine ​​che possono alterare o splicing di geni in tutta SNC roditore, una tecnica che ha ampie applicazioni in più campi neuroscienze legate. Ti suggeriamo di pilotaggio entrambi i metodi di consegna se non siete sicuri che la via di somministrazione è più adatto per il vostro sstudio pecific.

Alcuni farmaci sono in grado di attraversare la barriera ematoencefalica (BBB), richiedendo diretto Sistema Nervoso Centrale (SNC) consegna. Per aggirare la BBB, i farmaci possono essere consegnati direttamente nel cervello con i metodi descritti. Mentre il nostro laboratorio e la carta dettagliata attenzione qui su oligonucleotidi antisenso (ASO), altri farmaci, come le piccole molecole, gli anticorpi, vettori di terapia genica, ecc., Possono anche essere consegnati attraverso l&#39;esatto stesso approccio. Alcune proteine ​​svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Tali proteine ​​formano spesso specie tossiche e si accumulano in aggregati, che porta alla eventuale morte neuronale e la successiva malattia neurologica 3-4. Nel tentativo di rallentare o addirittura arrestare la progressione di queste malattie, una opzione terapeutica può essere di indirizzare direttamente e diminuire la proteina causativo. Tuttavia, queste proteine ​​sono spesso presenti ubiquitariamente attraverso il SNC, rendendo difficile e<html> ffectively loro bersaglio su scala globale. Al fine di indirizzare i geni durante l&#39;intero sistema nervoso centrale, amministriamo ASO in un mouse liquido cerebrospinale (CSF) attraverso il ventricolo laterale di bypassare il BBB. Questo metodo specifico sfrutta il sistema ventricolare topo che bagna l&#39;intero cervello e il midollo spinale, consentendo un&#39;ampia distribuzione dei ASOs. Usiamo ASOs che sono 18-20 mer molecole RNA-simili che si legano direttamente la sequenza di mRNA bersaglio e, a seconda delle modificazioni chimiche ASO, sia a) recluta RNasi H per degradare l&#39;mRNA che porta a knockdown o B) spostare splicing alternativo 1 , 2,16,17. Va notato che esistono molecole multiple per abbattere una specifica proteina in vivo, compresi shRNA. Dal momento che queste molecole non sono al centro di questo articolo, ci indirizziamo il lettore a rivedere gli articoli che meglio approfondito i meccanismi atterramento di azione ed i vantaggi / svantaggi di ciascun 5-6. jove_content &quot;&gt; Nel lavoro precedente, abbiamo utilizzato ASO per indirizzare la proteina superossido dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo transgenico di sclerosi laterale amiotrofica (SLA), 7 (Figura 4). Mutazioni SOD1 verificarsi in circa il 2% di tutti gli SLA 8 casi, anche se è stato recentemente ipotizzato che SOD1 possono svolgere un ruolo importante nella SLA sporadica e 9-10. Diminuendo totale SOD1 livelli nella SLA transgenici topo, la sopravvivenza dopo l&#39;esordio è stato aumentato significativamente 7. Questi dati importanti sono stati i primi per dimostrare che un trattamento ASO nel sistema nervoso centrale potrebbe avere un profondo impatto positivo su un modello di malattia neurologica. Da allora, ASO mirate per SOD1 umane sono entrati e completato con successo la fase I di sperimentazione clinica umana con effetti collaterali minimi (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , come presentato al 2012 64 th Annual Academy of Neurology. piani per spostare le ASO ora di studi di fase II sono attualmente in corso. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Mentre rivolge SOD1 è stata la prima dimostrazione di utilizzo di ASO per il trattamento di una malattia neurologica, molti altri studi da allora sono stati eseguiti guardando diverse malattie e le rispettive proteine ​​target. Nel 2010 e nel 2011, Asos che spostano splicing della proteina di sopravvivenza dei motoneuroni 2 (SMN2) sono stati utilizzati in modelli di topi transgenici di atrofia muscolare spinale (SMA) e ha determinato un significativo miglioramento dei fenotipi di malattia 11,12. Questi ASOs splicing sono ora in fase I di sperimentazione clinica in bambini affetti da SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la somministrazione transitoria di ASOs mirati contro il gene huntingtina riuscirono a salvare drammaticamente modello murino di Huntington, anche dopo che i livelli di proteina huntingtina ritornando al basale 13. In tutti questi studi, sono state consegnate ASOs ventricolo laterale di diminuire i livelli totali del gene o alterare gene splicing mediantel&#39;intero SNC. Entrambe le pompe osmotiche e una singola iniezione in bolo può essere utilizzato per fornire ASO al QCS. Le pompe consentono una lenta, erogazione continua, mentre la intracerebroventricolare (ICV) bolo è un veloce, l&#39;iniezione di una volta. Abbiamo usato entrambi questi metodi con successo, se non abbiamo riportato il confronto diretto tra pompa e bolo in una singola linea transgenica. Utilizzando ASO nel SNC è un potente mezzo per diminuire i livelli di proteine ​​totali e / o cambiamento splicing di diverse proteine. Mentre usiamo ASO esclusivamente come trattamento per i disturbi neurologici, ci rendiamo conto che gli altri campi possono anche beneficiare di questa tecnica. Fino a quando la proteina di interesse è espresso nel sistema nervoso centrale e l&#39;obiettivo finale è quello di raggiungere CNS modifiche a livello di espressione genica, utilizzando ASO nelle tecniche dimostrate può essere molto utile.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

A causa dell&#39;impossibilità di attraversare la barriera ematoencefalica, alcuni farmaci devono essere consegnati direttamente nel sistema nervoso centrale (SNC). Il nostro laboratorio si concentra in particolare su oligonucleotidi antisenso (ASO), anche se le tecniche mostrate nel video qui possono anche essere usati per fornire una pletora di altri farmaci per il sistema nervoso centrale. Oligonucleotidi antisenso (ASO) hanno la capacità di atterramento obiettivi specifici della sequenza 1, nonché del cambio rapporti isoforma di geni specifici 2. Per assicurare la massima diffusione knockdown gene o splicing nel sistema nervoso centrale di topi, le ASO possono essere consegnati nel cervello utilizzando due percorsi separati di somministrazione, entrambi i quali dimostriamo nel video. I primi utilizzi Alzet pompe osmotiche, collegato ad un catetere che viene impiantato chirurgicamente nel ventricolo laterale. Questo permette ai ASOs di essere continuamente infuso nel SNC per un determinato periodo di tempo. La seconda prevede una singola iniezione in bolo di un hiconcentrazione gh di ASO nel ventricolo destro laterale. Entrambi i metodi utilizzano il sistema ventricolare cerebrale mouse per consegnare la ASO per tutto il cervello e il midollo spinale, sebbene a seconda delle esigenze dello studio, un metodo può essere preferita all&#39;altra.

Dopo infusione pompa o un tempo designato dopo l&#39;iniezione ICV bolo (noi abitualmente uso quattro settimane), è importante per testare l&#39;efficacia dei ASOs. Si consiglia di riprendere varie regioni del cervello e del midollo spinale per misurare i livelli / isoforme del gene bersaglio, sia a livello di mRNA utilizzando quantitativa PCR in tempo reale, nonché il livello proteico utilizzando Western Blot o ELISA (Figura 4 per un esempio pubblicato ). Ciò contribuirà a determinare ASO efficacia nelle diverse regioni del SNC. Se l&#39;emivita della proteina mirata è lungo, si consiglia di attesa più lungo dopo ASO infusione al fine di valutare la massima knockdown proteine ​​o di splicing. È anche importante per testare distribuzione oligo. Infusi Pompa sfociano in distribuzione attraverso gli emisferi sia ipsilaterale che controlaterale, anche se una maggiore concentrazione di ASO è spesso visto in zone più vicine al sistema ventricolare 16. ICV bolo iniezioni di produrre un più Unifodistribuzione rm di oligo attraverso il SNC 16, anche se gli effetti non possono durare più a lungo. Noi indirizziamo il lettore a Southwell et al. Vedere un confronto diretto di pompa rispetto a bolo oligo distribuzione 16. Raccomandiamo inoltre testare dosi multiple così come la durata d&#39;azione degli ASO poiché ogni ASO si comporterà in modo leggermente diverso in vivo. ASO in genere hanno una relativamente lunga durata d&#39;azione, con atterramento di destinazione o di splicing della durata di diversi mesi dopo la consegna ASO. Inoltre, alcuni ASO funzionano meglio di altri e alcuni obiettivi del gene sarà più facile da atterramento di altri. A causa di questo, quando lo screening Asos per determinare il candidato di piombo, si consiglia di testare almeno 3-5 Asos in vivo con un n = 4-6 adulti topi per ASO come primo passaggio. Se si utilizza un farmaco diverso ASOs, sarà anche importante per il pilota concentrazione ideale farmaco, durata di azione dei farmaci, e del SNC farmacodistribuzione per tale composto specifico. <img alt="Tabella 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tabella 1. Chirurgia Coordinate. Le coordinate utilizzate per colpire il diritto ventricolo laterale in entrambi i topi e ratti momento dell&#39;impianto pompe osmotiche, nonché l&#39;esecuzione di un intracerebroventricolare (ICV) bolo. Entrambe le coordinate, per pompe e ICV bolo, indirizzare il diritto ventricolo laterale. Usiamo due diverse serie, perché questi sono ciò che abbiamo più esperienza con e sappiamo forniscono un&#39;eccellente distribuzione di ASO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Figura 1. Setup stereotassica. (A) L&#39;apparecchiatura stereotassica necessaria per la pompa Alzet e ambulatori iniezione in bolo. I), perle di vetro Sterilizzarer. ii) Lettura digitale. iii) Base Stereotassica con le braccia in movimento. iv) Temperatura controllata Riscaldamento Pad. v) Isoflurano / Sistema di ossigeno. vi) Camera isoflurano. (B) Primo piano del cono di naso e orecchie bar. (C) Due allegati richiesti. A sinistra: Siringa / porta-aghi per ICV iniezioni in bolo. Destra: Driver cannula per l&#39;impianto della pompa osmotica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Figura 2. Alzet osmotica pompa impianto. (A) Alzet opzioni pompa osmotica per i topi. 14 pompe. Giorno (0,25 ml / ora), 28 pompe di giorno (0,25 ml / ora), 42 pompe di giorno (0,15 ml / h) (B) Coordinate per l&#39;impianto pompa dal bregma: -0.5 mm posteriormente, -1.1 mm Laterale ( a destra), e -2,5 mm ventrale (lunghezza del catetere). (C) Dopo aver guidato il catetere attraverso l&#39;cranio e incollaggio della cannula, colorante viene lavata attraverso il catetere per valutare il corretto posizionamento del catetere nel ventricolo laterale. (D) cervello perfuso immediatamente dopo tintura somministrato come in (C). Se catetere viene inserito correttamente nella ventricolo, il colorante sarà distribuito in tutto il sistema ventricolare del mouse. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Figura 3. Intracerebroventricolare iniezione in bolo. (A) Coordinate per iniezione in bolo da bregma: 0,3 millimetri anteriore, -1.0 mm laterale (destro), e -3,0 mm ventrale (B) Dopo aver guidato l&#39;ago attraverso il cranio -3.0 mm ventrale, colorante viene spinto attraverso la siringa. per valutare il corretto posizionamento dell&#39;ago nel successivamente ventricolo. (C) cervello perfuso poco dopo tintura somministrata come in (B). Se l&#39;ago viene inserito correttamente nella ventricolo, lacolorante sarà distribuito in tutto il sistema ventricolare del mouse. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Figura 4. Gli oligonucleotidi antisenso riducono SOD1 ratto in vivo (figura prelevata direttamente da Smith et al. 7). (AD) antisenso SOD1 oligonucleotidi SOD r146192 o SOD strapazzate erano infuso per 28 giorni nel ventricolo destro laterale di ratti normali a 100 mg / giorno. (A) endogeni SOD1 livelli di mRNA di cervello e midollo spinale, come misurato da RT-PCR quantitativa. ( B) a-tubulina livelli di proteina SOD1 e seguendo ASO infusione. (C e D), i livelli di proteina per la tubulina e SOD1 quantificati per le diverse regioni del seguente infusione cervello. (E) ASO contro presenilina 1 o GSK-3 e beta, Sono stati infusi per 2 settimane nel ventricolo destro laterale di topi transgenici e dei livelli di mRNA valutate nel giusto corteccia frontale / temporale. Riprodotto con il permesso della American Society for Clinical Investigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Figura 5. Esecuzione orizzontale sutura materasso. 5-0 nylon filo di sutura è tessuto dentro e fuori della pelle, partendo anteriore e posteriore di lavoro, concentrandosi più sulla cannula. Una volta giunto al punto più posteriore, il filo di sutura viene poi riportato su e filettata sulla cannula una volta di più. Questo assicura corretta chiusura della ferita e impedisce la cannula / tubo da lavorare attraverso la pelle.

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Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Si descrive un metodo per indirizzare farmaci per il sistema nervoso centrale o impianto di un catetere o eseguendo una iniezione in bolo nel ventricolo destro laterale nei topi. Ci concentriamo in particolare sulla fornitura di oligonucleotidi antisenso. Questa tecnica è facilmente adattabile ad altri farmaci e ai ratti.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

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Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K Views.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Si descrive un metodo per indirizzare farmaci per il sistema nervoso centrale o impianto di un catetere o eseguendo una iniezione in bolo nel ventricolo destro laterale nei topi. Ci concentriamo in particolare sulla fornitura di oligonucleotidi antisenso. Questa tecnica è facilmente adattabile ad altri farmaci e ai ratti.

Video: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Ricerca

Neuroscienze

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Una batteria di Test computerizzato per studiare effetti farmacodinamici sul sistema nervoso centrale di farmaci colinergici in fase precoce di sviluppo di farmaci

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...