Name: optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
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Questo lavoro è stato generosamente sostenuto dal National Institutes of Health / Istituto Nazionale di Malattie Neurologiche e Stroke (/ NINDS NIH) concessione 1R01NS086981 e l&#39;Hilton Fondazione Conrad N.. Ringraziamo il Dr. Laurent Bentolila e il Dr. Matthew Schibler per la preziosa assistenza con microscopia confocale. Ringraziamo coloro che hanno contribuito al forum chiarezza (http://forum.claritytechniques.org). Ringraziamo in modo particolare il Dr. Karl Deisseroth per aprire il suo laboratorio per insegnare questa affascinante tecnica. Gli autori sono grati per il generoso sostegno da parte della Organizzazione Brain Mapping Medical Research, Cervello Fondazione supporta il mapping, Pierson-Lovelace Foundation, la Fondazione Ahmanson, Capital Group Aziende Charitable Foundation, William M. e Linda R. Dietel Fondo filantropico, e il Fondo Northstar . La ricerca riportato nella presente pubblicazione è anche parzialmente sostenuto dal Centro nazionale per le risorse di ricerca e dall&#39;Ufficio del direttore della NazioneAl Institutes of Health ai numeri premio C06RR012169, C06RR015431, e S10OD011939. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con Istituzionale cura degli animali e le linee guida Comitato Usa (IACUC). Thy1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato topi sono stati utilizzati per questi esperimenti, ma qualsiasi topi che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere cancellati e ripreso con successo. 1. Preparazione del tessuto Attenzione: paraformaldeide (PFA) e acrilammide sono tossici e irritanti. Effettuare esperimenti che utilizzano questi reagenti in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi). <ol><li> Sacrificare l&#39;animale in camera di eutanasia con ~ 1 ml di isoflurano fino respirazione cessa (~ 2 - 3 min). </li><li> Utilizzare una pompa peristaltica impostato ~ 5 ml / min per defluire in intracardiaca il mouse con la soluzione di perfusione (Tabella 1) a 4 ° C fino a quando il sangue viene cancellato dai tessuti (5 - 10 min). </li><li> Modificare il perfusato di soluzione fissativa (Tabella 1)a 4 ° C fino al collo e coda sono notevolmente irrigidito (5 - 10 min). </li><li> Terminare la perfusione e decapitare il animali. Sezionare delicatamente il cervello dal cranio rimuovendo prima il tessuto connettivo circostante cranio e quindi la rimozione di osso dalla superficie ventrale del cranio e sollevando il cervello (figura 1a), come descritto in 20. Nota: Prestare particolare attenzione alla rimozione di osso che circonda i lobi flocculonodular del cervelletto e dei bulbi olfattivi. <ol><li> Sezionare il midollo spinale dalla colonna vertebrale, inserendo delicatamente la punta di una multa, tagliente forbice tra il midollo spinale e la colonna vertebrale e il taglio dei singoli segmenti della colonna vertebrale di distanza, come descritto in 21. </li></ol></li><li> Hemisect cervello ponendolo in una matrice plastica cervello di topo e tagliando lungo la linea mediana con una lama di matrice. </li><li> Aggiungere ogni emisfero e del midollo spinale per separare 50 ml vasca centrifugaes con ~ 40 ml di soluzione di idrogel (Tabella 1). Da questa copertura in avanti punto le provette con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori durante tutte le fasi successive. </li><li> Incubare la provetta contenente il campione in idrogel a 4 ° C con agitando delicatamente (~ 30 rpm) per 7 giorni. </li></ol> 2. polimerizzazione <ol><li> Scartare ~ 25 ml di idrogel, mantenendo il campione e ~ 25 ml di idrogel nella provetta da centrifuga. </li><li> Deoxygenate campione rimuovendo il tappo e posizionare il tubo da centrifuga in barattolo essiccatore e collega il vaso ad un vuoto. Applicare il vuoto per almeno 10 minuti per consentire gas disciolti venire dalla soluzione e formare bolle. Agitare delicatamente per rimuovere le bolle. </li><li> Sostituire il vuoto nel vaso essiccatore 100% azoto oltre 2 - 3 min. Una volta che la pressione equalizza (una volta all&#39;inizio della giara essiccatore può essere aperto), tappare rapidamente il tubo per impedire la reintroduzione di ossigeno. </li><li> Polimeroizzare l&#39;idrogel ponendo la provetta con il campione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 3 ore fino polimerizzazione è completa. Idrogel polimerizzato assumerà una consistenza gelatinosa (Figura 1b). Nota: Una piccola quantità di idrogel non polimerizzato in alto è accettabile. </li><li> Utilizzare una spatola per rimuovere il campione polimerizzato dalla provetta, poi tagliare via l&#39;eccesso idrogel dal campione. </li><li> Rimuovere l&#39;idrogel restante ponendo il campione su un panno senza pulire e delicatamente sfregamento e rotolare il tessuto su di esso, lasciando solo un sottile strato di idrogel polimerizzato sul campione. </li></ol> 3. La rimozione dei lipidi Nota: il tessuto lipidico-eliminato è fragile, maneggiare con cura. Utilizzare un filtro cella quando lo svuotamento del tubo per evitare di perdere del campione. Inoltre, il campione si gonfiano in tutto il processo di compensazione, tuttavia, gonfiore può essere invertito durante il processo di indice di rifrazione corrispondente. Attenzione: Sodium solfato dodecil (SDS) e l&#39;acido borico sono irritanti. Effettuare esperimenti li utilizzano in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi). <ol><li> Trasferire campione polimerizzato di clean 50 ml tubo di centrifuga, aggiungere 45 ml di compensazione tampone (Tabella 1). Incubare a 45 ° C con un leggero scuotimento (~ 30 rpm). Modificare il buffer al giorno per un periodo iniziale di 7 giorni versando fuori il buffer di compensazione utilizzato in rifiuti chimici e l&#39;aggiunta di ~ 45 ml di tampone di compensazione fresco. Tenere le provette da centrifuga contenenti i campioni coperti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori. </li><li> Dopo i primi 7 giorni, incubare il campione a 40 ° C e lo scambio di compensazione tampone ogni 2 - 3 giorni. Continuare compensazione fino a quando tutti i lipidi sono solubilizzati e tessuti raggiunge la trasparenza (Figura 1c). Questo sarà il 4 - 6 settimane per un emisfero del cervello del mouse e 2 - 4 settimane per un midollo spinale. </li><li> Una volta che il tessuto viene cancellato, il trasferimentocampione in un tubo da 50 ml centrifuga e lavare 4 volte in PBST (Tabella 1) a 40 ° C agitando delicatamente (~ 30 rpm) su 24 ore per rimuovere residui di SDS. </li></ol> 4. La colorazione molecolare Attenzione: 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) è un irritante e gli esperimenti che utilizzano dovrebbe essere eseguita in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi). <ol><li> Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml pulito e riempire con 1 mg / ml DAPI in 1x PBST, pH 7.5. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore. Tenere le provette da centrifuga contenenti i campioni coperti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori. </li><li> Lavare 3 volte in PBST a temperatura ambiente per almeno 6 ore / lavaggio. </li></ol> 5. indice di rifrazione di corrispondenza Attenzione: 2,2&#39;-tiodietanolo (TDE) è un irritante e gli eventuali esperimenti utilizzandolo should essere eseguita in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi). <ol><li> Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml pulito e riempire con il 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubare a 40 ° C agitando delicatamente (~ 30 rpm) per 24 ore. </li><li> Scambio 30% TDE con 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubare a 40 ° C con delicata agitazione per 24 ore. Nota: Il campione si restringerà torna a dimensioni approssimative di originale. </li><li> Su una superficie piana e pulita rotolare un pezzo di adesivo riutilizzabile in un cilindro con diametro uniforme solo leggermente maggiore dello spessore del campione. </li><li> Disporre il cilindro adesivo riutilizzabile in un cerchio aperto (~ diametro 25 mm interno con una piccola apertura nella parte superiore) su un piatto fondo di vetro 40mm. Se correzioni devono essere fatte, togliere il cilindro dal vetro e tagliato con una lama di rasoio. </li><li> Utilizzare una punta P1000 pipetta per creare una tenuta tra l&#39;adesivo riutilizzabile e vetro darotolare intorno al bordo esterno del cilindro. </li><li> Luogo ~ 100 ml 63% TDE sul piatto di vetro e diffuso in tutto per coprire la superficie di vetro all&#39;interno del cerchio di adesivo riutilizzabile. </li><li> Utilizzando una spatola, posizionare accuratamente il campione al centro del cerchio, facendo attenzione a non formare bolle. </li><li> Pipetta altri 100 ml di 63% TDE direttamente sul campione, quindi collocare immediatamente a 40 millimetri di vetro di copertura circolare su l&#39;adesivo riutilizzabile. </li><li> Utilizzando l&#39;indice, medio e anulare di entrambe le mani, premere con attenzione intorno al perimetro del cerchio finché il vetro di copertura ha preso contatto con il campione. </li><li> Portare lentamente il piatto fondo di vetro in posizione verticale di riposo contro una superficie, quindi aggiungere 63% TDE con una pipetta finché la soluzione raggiunge la piccola apertura nella parte superiore. Usare un panno senza pulire per asciugare la punta della pipetta in modo che la soluzione non cola sul vetro. Per evitare bolle nella camera, non svuotare la pipetta fino in fondo. </li><li> Ala piccola apertura, aggiungere elastomero silicio per racchiudere il cerchio e creare una camera chiusa. Attendere 5 minuti che si asciughi prima di imaging. </li></ol> 6. Microscopia Attenzione: I laser utilizzati in confocale, illuminazione piano singolo e la microscopia foglio di luce sono molto potente e può causare la cecità. Tutti gli esperimenti che utilizzano il laser deve essere eseguita dopo una formazione completa e con grande cautela e protezione per gli occhi adeguata. <ol><li> Posizionare la camera di imaging con il campione all&#39;interno sul palco di un microscopio confocale a scansione laser. </li><li> Aprire il software di imaging (vedi Tabella dei Materiali). Per accendere il laser ad argon di eccitazione, fare clic sulla scheda di configurazione nella parte superiore del programma quindi l&#39;icona del laser. Seleziona la casella accanto a argon per alimentare il laser e spostare la scala slitta al 30%. Osservare il puntatore lentamente riscaldare nella posizione selezionata. <ol><li> Ritorna alla scheda acquisiscono in alto. Nella grande scatola &quot;Impostazioni percorso del fascio &amp;# 34; andare al carico / salva casella di impostazione e selezionare il menu a tendina per selezionare un canale di lunghezza d&#39;onda appropriata per immagine YFP (527 nm). </li></ol></li><li> Selezionare obiettivi appropriati per l&#39;imaging individuando il collegamento ipertestuale rosso con l&#39;etichetta &quot;Obiettivo: oggetto corrente&quot; sotto la casella impostazioni del canale. Facendo clic sulla scheda si apre tutti gli obiettivi disponibili e una selezione ruoterà automaticamente la torretta. <ol><li> Utilizzare obiettivi (ad es., 10X) con una distanza grande lavoro (maggiore dello spessore del tessuto per creare l&#39;immagine, ad esempio, 11 mm) e una apertura numerica (ad es., 0,3) per massimizzare risoluzione in piano dell&#39;immagine e minimizzare lo spessore della sezione ottica. </li></ol></li><li> Sulla colonna di sinistra del menu a discesa, aprire il &quot;XY: risoluzione&quot; finestra per impostare matrice di acquisizione, chiamato &quot;format&quot;, a 1.024 x 1.024 o un valore appropriato per il limite laterale risoluzione dell&#39;obiettivo. Impostare il fattore di zoom più basso possibile (ad es., 1.7). </li><li> Nella stessa finestra, impostare parametri medi 8 media di linea e 1 fotogramma facendo cadere giù i menu etichettate singolarmente di conseguenza. Utilizzare valori grandi per un alto rapporto segnale-rumore e piccoli valori per l&#39;acquisizione rapida. Nota: 8 medie di linea e 1 media struttura acquisiranno immagini di alta qualità di un emisfero del cervello del mouse in circa 4 ore. </li><li> Individuare il campione utilizzando i controlli di scena. Una volta che un campo rappresentativo è visibile, impostare il guadagno e offset. Nota: Il guadagno e offset varia considerevolmente in base al tipo di tessuto, fluorofori, e / o caratteristica anatomica di essere ripreso. Per YFP, impostare i valori 760-780 per il guadagno e da -1,0 a -1,5 per l&#39;offset. </li><li> Selezionare &quot;scan tile&quot; e selezionare i confini della regione di interesse. Impostare i limiti superiore e inferiore della z-stack da acquisire. Impostare lo spessore della sezione ottica basato su limite di risoluzione ottica sezione del oggettivo. Nota: Un obiettivo dilimite di risoluzione ottica sezione è definita principalmente dalla sua apertura numerica. La maggior parte del software di controllo microscopio calcolerà automaticamente un valore appropriato per l&#39;obiettivo in uso. Per un obiettivo 10X con una apertura numerica di 0,3 sarebbe di circa 11 micron. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione. Nota: Questo può richiedere più ore. </li><li> Raccogliere immagini ad alta risoluzione usando obiettivi ingrandimento superiore di specifiche regioni di interesse. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

compensazione passiva di idrogel incorporato tessuti (chiarezza passivo) è un metodo semplice e poco costoso per la compensazione grandi pezzi di tessuto. Questo approccio non richiede attrezzature dedicate e può essere facilmente eseguita con un agitatore a temperatura controllata. Nell&#39;arco di poche settimane, anche di grandi dimensioni, i tessuti altamente mieliniche, come ad esempio un intero cervello o del midollo spinale, diventeranno trasparenti e adatto per la microscopia. Anche se questo rapporto è concentrata sulla compensazione del tessuto cerebrale, CLARITY passivo può essere applicato a qualsiasi tessuto. I punti di forza e di debolezza delle tecniche di compensazione ottica sono stati discussi in precedenza nella letteratura 13,17,22, ma sono più chiaramente disposti in 23. CHIAREZZA passivo è adatto per esperimenti in cui un gran numero di campioni vengono azzerati contemporaneamente e riproducibilità è di grande importanza. L&#39;uso di un idrogel per fornire sostegno supplementare al tessuto facilita multiple sondare del tessuto. In questo rapporto, una piccola tintura peso molecolare, DAPI, è stato dimostrato, ma vari cicli di anticorpi sondaggio sono possibili anche con questo approccio. L&#39;approccio descritto in precedenza si discosta dal nostro protocollo precedentemente pubblicato 15 in un paio di modi significativi. In primo luogo, l&#39;approccio corrente, i campioni sono stati non intracardiaca perfusi con idrogel. Ciò è dovuto al fatto che l&#39;idrogel può prematuramente polimerizzare nel tubo ed aghi dell&#39;apparato perfusione, portando a perfusioni incompleti e compensazione incoerente. Incubando tessuti paraformaldeide fissato in idrogel per 7 giorni è in linea con il protocollo di CHIAREZZA originale 14, anche se un incubazione 1 giorno viene utilizzato per 1 - sezioni di tessuto 3 mm di spessore nella tecnica CLARITY passivo (PACT) 17. In secondo luogo, questo approccio esegue la rimozione dei lipidi ad una temperatura leggermente superiore che precedentemente riportato 15-17. Higher temperature accelera la rimozione di lipidi, ma deve essere bilanciato con la possibilità di una catastrofica perdita di integrità del tessuto (fusione). Aumentando la temperatura di incubazione dell&#39;8 ° C (45 ° C) per 7 giorni e poi di 3 ° C (40 ° C) per il resto del processo di rimozione di lipidi, compensazione tessuto viene accelerato, ma senza il rischio concomitante la perdita di integrità dei tessuti. Questo aumento della temperatura è coerente con temperature riportate durante elettroforetica Tissue compensazione (ETC) nel protocollo CLARITY originale (50 ° C) 14. Inoltre, è stata osservata alcuna diminuzione dell&#39;intensità di fluorofori transgenically espresse né diminuzione della colorazione DAPI. Deossigenazione è un passo importante nella creazione di idrogel. L&#39;idrogel può polimerizzare in presenza di ossigeno disciolto nella soluzione idrogel, ma nelle nostre mani la velocità e la completezza della polimerizzazione era molto più variabile senza deossigenazione. Se la hydrogel non polimerizza, la ragione più comune è la presenza di ossigeno nel idrogel. Il processo di compensazione ottica è notevolmente facile da implementare, tuttavia, la microscopia che segue può essere piuttosto complicato. Di fondamentale importanza sono gli obiettivi utilizzati all&#39;immagine tessuto. La distanza di lavoro di un obiettivo definisce la profondità che può immagine in un campione di tessuto. Un obiettivo con una distanza di lavoro di 2 mm può solo image 2 mm nel campione, quindi la distanza di lavoro di un obiettivo deve essere maggiore dello spessore del campione per un&#39;immagine completamente. Allo stesso modo, l&#39;apertura numerica di un obiettivo pone un limite alla dimensione di caratteristiche che può risolvere sia in piano e lo spessore delle sezioni ottiche che può acquisire significato. Messa Aereo Illumination Microscopy (SPIM) e foglio leggero Microscopy (LSM) possono superare la limitazione dello spessore sezione ottica dalla natura dell&#39;illuminazione, ma questi microsCopes non sono ampiamente disponibili. Alta apertura numerica, grandi obiettivi distanza di lavoro sono rari e costosi, ma sono necessari per l&#39;imaging di alta qualità da grandi sezioni otticamente eliminato. Una volta che le immagini sono state acquisite, sono spesso molto grandi, che vanno da alcune centinaia MB di bassa risoluzione (sia in piano e la direzione z) sull&#39;immagine per alcuni TB per un&#39;immagine di alta risoluzione raccolte su LSM. I computer utilizzati per l&#39;analisi delle immagini richiedono non solo una grande quantità di spazio, ma grandi quantità di memoria ad accesso casuale (RAM) per l&#39;elaborazione delle immagini. I pacchetti software adatti della analisi di grandi volumi di immagini otticamente eliminato includono Amira, Imaris, e ImageJ 14-16. Tra i limiti di questo approccio, CHIAREZZA passivo richiede più tempo per cancellare tessuti, rispetto ad altri approcci di compensazione ottica. Diminuendo il volume del tessuto viene controllata da taglio o sezionamento in pezzi più piccoli possono Accelrano lipidi rimozione. Inoltre, riducendo la concentrazione di paraformaldeide in idrogel a sua volta diminuzione reticolazione e aumentare la dimensione dei pori idrogel, portando a più rapida compensazione 17, anche se questo può portare ad una maggiore espansione del tessuto, i singoli sperimentatori possono trovare che vale la pena la diminuzione della compensazione tempo. Inoltre, in combinazione con TDE come agente di compensazione, la quantità di espansione del tessuto complessivo può essere limitato. Anche se questo rapporto descrive l&#39;uso di piccole coloranti peso molecolare, anticorpi sondaggio è un passo molto naturale successivo. La presenza del idrogel non solo fornisce supporto fisico ai tessuti eliminato, ma serve anche come un impedimento per la penetrazione di anticorpi in profondità nei tessuti. Diminuendo la concentrazione di acrilamide o la concentrazione paraformaldeide aumenterà la dimensione dei pori in idrogel, facilitando (e quindi accelerazione) anticorpo penetrazione 17, ma questo ha un effetto deleterio sulla tissespansione ue. Tuttavia, anticorpi sondando di blocchi di tessuto può essere realizzato in pochi giorni e cervello intero in un paio di settimane con concentrazioni di acrilamide e paraformaldeide descritte nel rapporto originale 14. tecniche di compensazione ottica permettono di guardare in profondità nel cervello, favorire la comprensione della sua struttura e funzione. Questi nuovi strumenti consentiranno ai ricercatori di visualizzare il cervello a risoluzioni cellulari e molecolari, aumentando la nostra comprensione di questa più complessa di organi.

The ability to image complete neuroanatomical structures is immensely valuable for understanding the brain in health and disease. Traditionally, 3D imaging has required tissue sectioning to provide the axial resolution and to visualize deep anatomical structures. This approach can produce high-resolution data sets, but requires sophisticated image reconstruction techniques and is very labor intensive. As a result, it has been limited to the imaging of small volumes of tissue1-3. Optical sectioning, on the other hand, is well suited for the creation of high-resolution 3D images of fluorescently labeled tissues. Since optical sectioning is inherently three dimensional, it does not require extensive computation to produce a 3D image volume. However, light scattering and tissue opacity limit the depth at which tissues can be optically sectioned. The depth of imaging is limited to about 150 &#181;m in laser scanning confocal microscopy and to less than 800 &#181;m using two-photon excitation microscopy4-8.
In order to overcome these limitations, several optical clearing techniques have been recently developed and then further refined to permit the deep microscopic imaging of intact tissues. The use of benzyl alcohol and benzyl benzoate (BABB) to render fixed tissues transparent was among one of the earliest approaches9. However, this approach was limited by the quenching of fluorescence in the samples and incomplete clearing of highly myelinated structures10. Refinements of this technique, such as 3D Imaging of Solvent Cleared Organs (3DISCO), have led to very rapid and complete tissue clearing, but still suffer from rapid loss of fluorescent signals, especially yellow fluorescent protein (YFP)10. Water-based clearing solutions, such as Sca/e11 and SeeDB12, preserve fluorescent signals, but do not completely clear highly myelinated tissues. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) is a promising new optical clearing technology that appears to overcome the limitations of previously developed water-based clearing solutions13. In contrast with other optical clearing techniques, Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 embeds the brain in a porous matrix that provides structural integrity to proteins, nucleic acids and small molecules, while leaving lipids unbound. The lipids are then removed electrophoretically, culminating in an optically cleared brain that can be easily visualized and equally easily probed using commonly available techniques.
Electrophoretic tissue clearing (ETC) is used to remove lipids from hydrogel embedded tissues in CLARITY, however, ETC can be difficult to implement consistently and tissues subject to electrophoresis can exhibit tissue distortion, browning, loss of fluorescence and antibody reactivity. Passive lipid clearing avoids these limitations, but requires increased clearing times15-17. Passive clearing also permits the clearing of large numbers of samples in parallel, since it is not limited by the number of ETC apparatuses available. Decreasing the concentration of paraformaldehyde and excluding bis-acrylamide from the hydrogel have led to great increases in the speed of clearing at the expense of greater tissue expansion16. Less expensive alternatives to the refractive index matching solution used in the original CLARITY technique have been developed17-19. 2,2'-thiodiethanol (TDE) is an inexpensive and rapid brain clearing agent that reverses some of the tissue expansion that occurs during lipid removal18. This report incorporates passive clearing of hydrogel embedded tissue and the use of TDE as a refractive index matching solution to the original CLARITY technique to produce a highly reproducible and inexpensive protocol for the optical clearing of the mouse central nervous system.

<table><tbody><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>buffers</td></tr><tr><td>32% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-5</td><td>perfusion and hydrogel</td></tr><tr><td>2,2&#039;-thiodiethanol (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>refractive index matching solution</td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>VA-044 initiator</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>hydrogel</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>preservative</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>perfusion</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>perfusion</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>nuclear stain</td></tr><tr><td>99.9% isoflurane</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Hydrocholoric acid</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>buffers</td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Willco dishes</td></tr><tr><td>Reusable adhesive</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>Silicon elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>Lint-free wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Mouse brain matrix</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>sectioning tissue</td></tr><tr><td>Matrix blades</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>sectioning tissue</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>microscopy</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>microscopy</td></tr></tbody></table>

optical clearing of the mouse central nervous system using passive clarity

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Visualizzare l&#39;organizzazione strutturale del cervello è fondamentale per capire come la morfologia e la connettività influenzano la funzione del cervello in salute e malattia. tecniche di compensazione ottici permettono di popolazioni di cellule immagine in 3D nei tessuti intatti, che ci permette di studiare la morfologia e la connettività coeso. I topi che esprimono proteine ​​fluorescenti guidata da promotori specifici per sottopopolazioni di cellule permettono uno a prendere in giro a parte il complesso schema di connettività neuronale nel cervello. Thy1-YFP topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati in letteratura compensazione ottica perché questi topi esprimono YFP in un sottogruppo di neuroni di proiezione che risiedono nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo, così come altre strutture del cervello (Figura 2a e b). Inoltre, YFP + neuroni corticali strato V proiettano attraverso il tratto corticospinale nelle scavo pinal (figura 2c e d), che li rende molto utile per valutare l&#39;effetto di insulto assonale e / o lesioni del midollo spinale sui neuroni corticali 15. Attraverso l&#39;uso della microscopia confocale e sezionamento ottico di tessuti otticamente eliminato si può facilmente valutare differenze di densità neuronale attraverso grandi strutture anatomiche. Oltre a Thy1-YFP topi transgenici, qualsiasi numero di topi transgenici può essere ripreso. PLP-EGFP topi transgenici esprimono migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) in oligodendrociti maturi che esprimono proteine ​​proteolipid (PLP) in tutto il cervello e il midollo spinale (Figura 3a). PV-TdTomato topi transgenici esprimono TdTomato in un sottogruppo di parvalbumina (PV) che esprime interneuroni nel cervelletto, striato e nell&#39;ippocampo (Figura 3b). Anche in topi che non esprimono transgeni fluorescenti, piccole coloranti fluorescenti peso molecolare, come DAPI, può facilmente diffondersi nei tessuti idrogel incorporato e consentire la valutazione dei nuclei cellulari nel cervello (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig1.jpg" /> Figura 1:. Le diverse fasi di cervello Clearing Fotografia di Thy1-YFP + cervello di topo che è stato rimosso dal cranio (a). Fotografia di Thy1-YFP + topo emisfero cerebrale idrogel-embedded (b). Fotografia di Thy1-YFP + topo emisfero cerebrale dopo la rimozione dei lipidi (c). Barre di scala sono 5 mm in ogni pannello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54025/54025fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig2.jpg" /> Figura 2: Thy1-YFP espressione nel cervello unND del midollo spinale. Thy1-YFP + neuroni della corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo ripreso a ingrandimento 5X e ricostruita in 3D (a). Una proiezione massima intensità di un&#39;immagine 10X pila di corteccia cerebrale dimostrando la arborization dendritica dei neuroni piramidali corticali strato V (b). espressione Thy1-YFP in un midollo spinale cervicale e toracico intatto ripreso a ingrandimento 5X e ricostruito in 3D (c). Una proiezione massima intensità di un&#39;immagine 10X pila di midollo spinale dimostrando singoli assoni (d). Barre di scala sono 1 mm (a), 100 micron di (b), 2 mm (c), e 100 micron di (d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54025/54025fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig3.jpg" /> Figura 3: PLP-EGFP e PV-TdTomato espressione nel cervello. </strong&gt; espressione PLP-EGFP in una sezione del cervello coronale 2 mm di spessore ripreso a 5X ingrandimento (a). Questa immagine è di circa 1 mm dalla superficie della sezione di tessuto. espressione PV-TdTomato nel cervelletto di un emisfero cerebrale intatto ripreso a 10X di ingrandimento (b). Questa immagine è di circa 0,5 mm dal piano sagittale mediano. Barre di scala sono 1 mm (a) e 250 micron di (b). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54025/54025fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54025/54025fig4.jpg" /> Figura 4: colorazione DAPI nell&#39;espressione cervello DAPI nel cervelletto di un emisfero cerebrale intatto ripreso a 5X ingrandimento.. L&#39;immagine è di circa 1 mm dal piano sagittale mediano. L&#39;inserto mostra il livello di dettaglio visibile a questa profondità di imaging a 10X di ingrandimento. Scala bar unre 250 micron nel pannello principale e 50 micron nel riquadro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54025/54025fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Buffer </td><td> chimico </td><td> concentrazione finale </td></tr><tr><td> soluzione di perfusione </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampone fosfato </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Nitrato di sodio </td><td> 0,5% w / v </td></tr><tr><td></td><td> eparina </td><td> 10 U / ml </td></tr><tr><td> soluzione fissativa </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampone fosfato </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Paraformaldehyde </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td> soluzione idrogel </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampone fosfato </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> paraformaldeide </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> L&#39;acrilamide </td><td> 4% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Bis-acrilammide </td><td> 0,05% v / v </td></tr><tr><td></td><td> VA-044 iniziatore </td><td> 0.25% w / v </td></tr><tr><td> buffer di Clearing </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acido borico </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodio dodecil solfato </td><td> 4% w / v </td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10x tampone fosfato </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% v / v </td></tr><tr><td></td><td> Sodio azide </td><td> 0,1% w / v </td></tr></tbody></table> Tabella 1: lista dei buffer e soluzioni.

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Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  University of California, Los Angeles. Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

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Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Ricerca

Neuroscienze

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Immunologia e infezioni

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Biologia

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...