Questo lavoro è stato supportato dal NIH Neuroscience Blueprint Nucleo di assegnazione (P30 NS057105, BJS) per Washington University, programma di progetto di Grant NS032636 (BJS) e dal Centro Hope for Neurological Disorders.

1. Packaging di vettori lentivirali Vettori lentivirali sono prodotte da cotrasfezione di un vettore di trasferimento lentivirale ed altri plasmidi necessari per il confezionamento in cellule 293T secondo il metodo trasfezione fosfato di calcio. Usiamo 10 da 100 mm, piatti di coltura di tessuto di questo protocollo. Esso può essere aumentato o basso a seconda delle applicazioni. La linea cellulare 293T viene mantenuta in modificato da Dulbecco (DMEM) con glucosio (4500 mg / L), integrato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina a 37 ° C incubatore con il 5% di CO 2. <ol><li> Seed 293T cellule a confluenza del 30-40% a 10 piatti di tessuto da 100 mm Cultura (3 x 10 6 cellule / piatto) in terreno di coltura. Riportare le cellule incubatrice. </li><li> Dopo 20-24 cultura h, controllare la densità delle cellule. Le cellule devono essere circa 80% di confluenza al momento della transfezione. </li><li> Preparare una provetta da 50 ml. Aggiungere 4,4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) meno il volume totale del seguente DNA plasmidico. Aggiungere 100 pg trasferimento lentivirale plasmide (figura 1), 58 mg pMDLg / pRRE, 31 pg pCMV-G, 25 pg PRSV-Rev, 600 microlitri 2M CaCl 2. Mescolare delicatamente. </li><li> Preparare un altro tubo da 50 ml. Aggiungere 5 ml 2x HBS (HEPES 0,05 M, 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,12). </li><li> Prendere la DNA-CaCl 2 miscela di 10-ml pipetta e aggiungere al tubo contenente 2 x HBS, goccia a goccia mentre il tubo vortex. </li><li> Mantenere la reazione di precipitazione a temperatura ambiente (RT) per 30 min. </li><li> Rimuovere le piastre di coltura da incubatrice. Mescolare la reazione di precipitazione bene nel vortex. Aggiungere 1 ml di sospensione per ogni 100 mm di cellule contenenti piatto. La sospensione deve essere aggiunto lentamente, goccia a goccia mentre delicatamente il mezzo nel piatto. Torna questi piatti per l&#39;incubatore e lasciare per 5 ore. </li><li> Rimuovere il terreno dalla coltura. Aggiungere 6 ml di mezzo di coltura fresco contenente 6 mM di sodio butyrate ad ogni piatto. Riportare le culture di incubatore. Dopo la coltura di una notte, se vi è un reporter fluorescente nel costrutto, controllare l&#39;espressione del gene reporter sotto microscopio a fluorescenza. Solitamente, oltre l&#39;80% delle cellule esprimono il gene reporter se è guidata da un promotore ubiquitario (ad esempio promotore CMV). </li><li> Due giorni (40-44 h) dopo la transfezione, raccogliere il supernatante da 10 piatti in 2 ml 50-provette (circa 30 ml ciascuna provetta). Congelare il surnatante in freezer -80 ° C o andare al passaggio successivo. </li></ol> 2. Concentrazione e purificazione dei vettori <ol><li> Centrifugare il raccolto di fresco o congelato surnatante a 900 g (circa 2000 rpm) per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari nel supernatante. </li><li> Collegare una siringa da 60 ml ad un 0,2 micron filtro SFCA siringa. Trasferire il supernatante da 50-ml provetta alla siringa. Filtrare il surnatante in una provetta da centrifuga polyallomer. </li><li> Take 5 ml di saccarosio 20% (preparato in PBS) in una pipetta da 5 ml. Inserirela pipetta al fondo della provetta contenente supernatante. Aggiungere lentamente la soluzione di saccarosio sotto il surnatante vettore. Ripetere questi passaggi per il surnatante da un altro tubo. </li><li> Centrifugare il surnatante a 11000 giri al minuto e 4 ° C per 4 h con Beckman SW28 rotore swing. </li><li> Rimuovere il surnatante. Aggiungere 150 ul Lattosio 4% (preparato in PBS) a ciascuna provetta. Risospendere il pellet. </li><li> Trasferire il vettore concentrato da tutte le provette da centrifuga a 1,5 ml provetta. Lasciare la provetta in ghiaccio per 15 min. </li><li> Mescolare la sospensione vettore pipettando. Spin con microcentrifuga a piena velocità (circa 16000 g) per 1 min. </li><li> Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 ml. Dividere il campione finale in 20 aliquote pl e conservati in congelatore -80 ° C. </li></ol> 3. Titolazione dei vettori <ol><li> Seme 5 x 10 4 / pozzetto di HT1080 cellule in 12-pozzetti in 1 ml di terreno DMEM supplementato con 10% FBS. </li><li> Dopo overnigcultura ht, contare le celle da un bene e segnare il numero di cellulare. </li><li> Effettuare 5-volte diluizione seriale (1:5, 1: 25; 1:125, e 1:625) del vettore concentrato con mezzo di coltura. Aggiungi I ul di ciascun vettore diluito in pozzetti separati. I campioni possono essere duplicati per aumentare la precisione. </li><li> Aggiungere 1 pl 4 mg / ml Polybrene (Hexadimethrine bromuro) in ciascun pozzetto contenente vettore e in un pozzo senza vettore. Mescolare agitando delicatamente la piastra. Torna a incubatore per 48 ore. </li><li> Rimuovere media da pozzi di coltura cellulare. Lavare ogni pozzetto con PBS. Aggiungere 250 pl 1x tripsina-EDTA soluzione alle cellule. Quando le cellule vengono staccate (3-5 min), aggiungere 1 ml di mezzo di coltura. Risospendere le cellule pipettando. Trasferimento sospensione di cellule in provette ml 1,5 centrifuga. </li><li> Centrifugare a 900 g per 6 min. Per i vettori con un gene reporter fluorescente (GFP per esempio), passare al punto 3.7 per l&#39;analisi FACS. Per i vettori che non un giornalista, andare al punto 3.8 per qPCR in tempo reale. </li><li> Per vettori contenenti un fluogene reporter fluorescente, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 300 ml di 3,7% di formaldeide in PBS. Determinare la percentuale di cellule positive del reporter mediante analisi FACS. Il titolo sarà rappresentato come unità di trasduzione per millilitro concentrato vettore (TU / ml). </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> Ad esempio, se 1 x 10 5 cellule è stato trasdotto con pl 1/25 (0,04 pl) vettore e 30% di cellule positive sono giornalista, il titolo sarà: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> Utilizzare solo le diluizioni cadono in una relazione lineare tra la percentuale di cellule positive e la quantità di vettore aggiunto per calcolare titolo. Il titolo finale dovrebbe essere una media dei titoli ottenuti da trasduzioni di almeno 2 diverse quantità del vettore. <ol start="8"><li> Per vettori senzagene reporter fluorescente, estrarre il DNA genomico da HT1080 cellule usando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) secondo il protocollo del produttore. Amplificazione sequenza di vettore nel DNA genomico utilizzando ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) con inneschi (in HIV-1 PBS / psi regione 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;e 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, e TaqMan sonda 5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;. Gene albumina che è una sola copia del gene nel genoma (2 copie per cellula) è stato amplificato con i primer 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;e 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39; e 5&#39;-probe-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA FAM-TAMRA-3 &#39;come controllo interno. Determinare i numeri di copie di vettore e di albumina da PCR in piastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del fabbricazione con il seguente programma: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 minuti, e 35 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 2 min. Diluizioni seriali di dieci volte di plasmidi di concentrazione nota (rappresentato come copianumero) contenente le sequenze modello dovrebbe essere amplificato per creare una curva standard per la quantificazione di campioni sconosciuti. Il titolo sarà rappresentato come unità di integrazione per millilitro concentrato vettore (UI / ml). </li></ol><img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Trasduzione delle Culture neocorticale Culture neocorticale contenenti sia neuroni e glia sono preparati da corteccia di topo usando una procedura in due fasi placcatura come descritto in precedenza 18. Neocortices ottenuti da topi fetale a 14-16 giorni di gestazione vengono piastrati su un monostrato precedentemente stabilito gliale in MEM additivato con il 10% FBS, 20 mM di glucosio e glutammina 2 mM a 24-pozzetti di coltura tissutale. <ol><li> Dopo 5 giorni in vitro, aggiungere 10 pM citosina arabinoside (Ara-C) in CENALcultura ortical per inibire non neuronali divisione cellulare. Continua a coltura le cellule per 2 giorni. </li><li> Mezzo di coltura caldo 37 ° C in bagno d&#39;acqua per 5-10 min. Sostituire Ara-C contenente il mezzo con terreno di coltura fresco (500 pl / pozzetto). </li><li> Aggiungere vettore con desiderata MOI (molteplicità di infezione, il rapporto tra il numero di particelle vettore per il numero di cellule bersaglio) alla cultura. Continua coltura per 24 h. Usiamo MOI di 1-10 (di solito 5) in colture primarie corticali. </li><li> Sostituire terreno di coltura con terreno fresco. Continua la cultura. Se c&#39;è un gene reporter nel costrutto vettore, controllare le cellule sotto microscopio fluorescente 2 giorni dopo trasduzione. Espressione del gene reporter sarà visibile in neuroni 2-7 dopo trasduzione, a seconda del design vettore e la dose usata. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi I titoli dei vettori lentivirali prodotti con questa gamma di protocollo 10 8 -10 10 IU / ml el&#39;elevatoh sono adatti per la trasduzione di una varietà di tipi di cellule del CNS sia in vitro che in vivo. Tabella 1 e la figura 2 mostra un risultato rappresentativo con i vettori prodotti da questo protocollo. Noi trasdotte murini culture neocorticali con vettori lentivirali esprimenti proteina verde fluorescente (GFP), controllata da sinapsina (SYN) promotore o proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) promotore. Sette giorni dopo la trasduzione, abbiamo effettuato immunocolorazione di neuroni etichette ed astrociti con anticorpi anti-NeuN e anti-GFAP, rispettivamente. Come mostrato nella tabella 1 e Fig. 2A, dopo trasduzione con il vettore che porta il promotore sinapsina, oltre il 90% dei neuroni (cellule NeuN +) esprimono GFP e non astrociti (GFAP + cellule) esprimono questo gene reporter. Quando promotore GFAP è utilizzata nel costrutto vettore (Fig. 2B), circa 80% di astrociti (GFAP + cellule) espressiones GFP; tutte le cellule GFP + astrociti sono come confermato dalla colocalizzazione con GFAP e l&#39;assenza di espressione di GFP in cellule NeuN-etichettati. Questi risultati dimostrano che vettori lentivirali sono molto efficaci per fornire transgeni alle cellule del CNS e cellula-specifici espressione genica può essere raggiunta quando vengono utilizzati promotori appropriati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di vettori lentivirali dell&#39;HIV basati ed i plasmidi confezionamento. La provirus HIV-1 è mostrata in alto. Gli elementi di vettore di produzione sono separati in quattro differenti plasmidi. Il trasferimento lentivirale plasmide contiene un ibrido 5 &#39;LTR in cui viene sostituita con la regione U3 del citomegalovirus (CMV), il segnale di imballaggio (ψ), la sequenza di RRE, il tratto polypurine centrale (cPPT), un gene di interesse (ad es un reporter fluorescente) insieme con un promotore di scelta, e il 3 &#39;LTR in cui lasequenze cis regolazione sono completamente rimosso dalla regione U3. pMDLg / pRRE contiene geni gag e pol ed sequenza RRE da HIV-1 sotto il controllo del promotore CMV. PRSV-Rev contiene la sequenza codificante di Rev guidata dal promotore RSV. pCMV-G VSV contiene il gene della proteina-G sotto il controllo del promotore CMV. PA indica il segnale di poliadenilazione da umano β-globina. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> Figura 2. Espressione dei geni reporter in coltura mista topo neocorticale trasdotte con vettori lentivirali trasportano cellulari tipo-specifici promotori. Le colture sono state transdotte con LV-SYN-GFP (A) o LV-GFAP-GFP vettori (B) ad una MOI di 5. Sette giorni dopo la trasduzione, le cellule sono state immunomacchiate con anticorpo anti-NeuN o anti-GFAP. I pannelli superiori mostrano fluorescenza GFP, pannelli centrali mostrano immunostaining e pannelli inferiori sono uniti immagini (GFP: verde; NeuN o GFAP: rosso). </p&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Vettore </td><td> GFP + cellule in neuroni </td><td> + GFP negli astrociti </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92,2 ± 7,3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78,3 ± 11,5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Confronto di espressione GFP in culture neocorticali murine trasdotte con vettori lentivirali che trasportano promotori diversi a. un colture murini neocorticali (5 x 10 5 / pozzetto in 24-pozzetti) sono state transdotte con LV-SYN-GFP o LV-GFAP-GFP ad una MOI di 5. Sette giorni dopo la trasduzione, le culture sono stati fissati e immunomacchiate per NeuN o GFAP. Il numero di cellule GFP e NeuN / GFAP che esprimono sono stati contati in immagini da 10 campi per ogni condizione sperimentale. I valori rappresentano la percentuale di neuroni (NeuN + cellule) oastrociti (GFAP + cellule), che ha inoltre espresso il gene reporter GFP. I valori riportati sono medie ± SD di tre esperimenti indipendenti.

<ol>
	<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).</li><li>Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-promoter+lentiviral+vectors+for+constitutive+and+regulated+gene+expression+in+neurons.">Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).</li><li>Hioki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transduction+of+neurons+by+lentivirus+with+enhanced+neuron-specific+promoters.">Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters.</a> Gene Ther. 14, 872-882 (2007).</li><li>Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+promoter+usage+for+lentiviral+vector-mediated+transduction+of+cultured+central+nervous+system+cells.">Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells.</a> J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Blomer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).</li><li>Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transgene+expression+in+rat+brain+using+lentiviral+vectors.">Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors.</a> J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).</li><li>Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-activator+gene+of+human+T-lymphotropic+virus+type+III+(HTLV-III).">Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III).</a> Science. 229, 69-73 (1985).</li><li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+immunodeficiency+virus+type-1+central+DNA+flap+is+a+crucial+determinant+for+lentiviral+vector+nuclear+import+and+gene+transduction+of+human+hematopoietic+stem+cells.">The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 96, 4103-4110 (2000).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).</li><li>Farson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new-generation+stable+inducible+packaging+cell+line+for+lentiviral+vectors.">A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).</li><li>Broussau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).</li><li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titering+lentiviral+vectors:+comparison+of+DNA,+RNA+and+marker+expression+methods.">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).</li><li>Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+heat+stress+reduces+excitotoxic+and+apoptotic+components+of+oxygen-glucose+deprivation-induced+neuronal+death+in+vitro.">Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro.</a> J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).</li><li>Mazarakis, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+virus+glycoprotein+pseudotyping+of+lentiviral+vectors+enables+retrograde+axonal+transport+and+access+to+the+nervous+system+after+peripheral+delivery.">Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery.</a> Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).</li><li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+gene+transfer+through+retrograde+transport+of+lentiviral+vector+pseudotyped+with+a+novel+type+of+fusion+envelope+glycoprotein.">Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).</li><li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production.">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li><li>Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+HIV-1-based+lentiviral+vectors+using+HYPERFlask+vessels+and+anion+exchange+membrane+chromatography.">Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography.</a> BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).</li><li>Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulation+of+HIV-1+gene+expression:+a+novel+mechanism+of+induction+independent+of+NF-kappa+B.">Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B.</a> J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).</li><li>Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+production+and+transduction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+vectors.">Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors.</a> J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).</li><li>Palsson, B., Andreadis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physico-chemical+factors+that+govern+retrovirus-mediated+gene+transfer.">The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer.</a> Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-{kappa}B+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats.">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li><li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoters+and+serotypes:+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo.">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato la produzione di vettori lentivirali e l&#39;applicazione di questi vettori nelle culture neocorticali. Abbiamo dimostrato efficace e cellula-specifico tipo trasduzione con i vettori prodotti da questi metodi. Quando il promotore sinapsina viene utilizzata, l&#39;espressione della GFP è strettamente neurone specifico. Quando il promotore GFAP viene utilizzata, l&#39;espressione della GFP è esclusivamente in astrociti. Se nessun tipo-specifico espressione cellulare è richiesto,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> Butirrato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrine bromuro (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> Cellule 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080 cellule </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> Falcon 100 x 20 mm del tessuto culture piatto </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ in provetta polyallomoer </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0,2-micron filtro a siringa </td><td> Corning </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system

La consegna del gene efficiente nel sistema nervoso centrale (SNC) è importante per studiare le funzioni dei geni, modellando le malattie neurologiche e lo sviluppo di approcci terapeutici. Vettori lentivirali sono strumenti interessanti nella trasduzione di neuroni e altri tipi di cellule nel sistema nervoso centrale come trasducono entrambe le cellule che si dividono e non dividere, espressione sostegno costante dei transgeni, e hanno capacità di confezionamento relativamente grande e bassa tossicità 1-3. Vettori lentivirali sono stati utilizzati con successo nella trasduzione molti tipi di cellule neurali in vitro e negli animali 4-6 7-10. Notevoli sforzi sono stati fatti per sviluppare vettori lentivirali con una migliore biosicurezza ed efficienza per la consegna gene. Le correnti di terza generazione replicazione-difettosi e auto-inattivazione (SIN) vettori lentivirali sono rappresentati nella Figura 1. Gli elementi necessari per il confezionamento vector sono divisi in quattro plasmidi. Nel lentivirale transFer plasmide, la regione U3 lunga ripetizione terminale in 5 &#39;(LTR) viene sostituito con un promotore forte da un altro virus. Questa modifica permette la trascrizione della sequenza vettore indipendente di HIV-1 Tat proteina che è normalmente richiesto per l&#39;espressione genica HIV 11. Il segnale di imballaggio (Ψ) è essenziale per incapsidamento e l&#39;elemento reagente Rev (RRE) è richiesto per produrre vettori alto titolo. Il tratto centrale polypurine (cPPT) è importante per l&#39;importazione nucleare del DNA vettore, una caratteristica necessaria per trasduzione non-cellule che si dividono 12. Nella 3 &#39;LTR, le sequenze cis-regolatori vengono completamente rimosso dalla regione U3. Questa soppressione è copiato 5 &#39;LTR dopo la trascrizione inversa, con conseguente inattivazione trascrizionale di entrambi LTR. PMDLg plasmide / pRRE contiene HIV-1 gag / pol geni, che forniscono proteine ​​strutturali e trascrittasi inversa. PRSV-Rev codifica Rev che si lega al RRE efficiente per l&#39;esportazione di RNA dal nucleo. pCMV-G codificala glicoproteina virus della stomatite vescicolare (VSV-G) che sostituisce HIV-1 Env. VSV-G espande il tropismo dei vettori e permette di concentrarsi tramite ultracentrifugazione 13. Tutti i geni che codificano le proteine ​​accessorie, tra Vif, Vpr, Vpu, e Nef sono esclusi nel sistema di imballaggio. La produzione e manipolazione dei vettori lentivirali deve essere effettuata secondo le linee guida per la ricerca NIH implicano il DNA ricombinante ( <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a> ). L&#39;omologazione da individuo comitato istituzionale per la sicurezza biologica e chimica può essere richiesto prima di utilizzare vettori lentivirali. Vettori lentivirali sono comunemente prodotte da cellule 293T cotrasfezione con trasferimento lentivirale plasmide ed i plasmidi helper che codificano le proteine ​​necessarie per il confezionamento vettore. Molti plasmidi trasferimento lentivirali e plasmidi helper possono essere ottenute da Addgene, non-Profit repository plasmide ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Alcuni stabili linee cellulari di confezionamento sono state sviluppate, ma questi sistemi offrono minore flessibilità e l&#39;efficienza imballaggio diminuisce generalmente nel tempo 14, 15. Kit di transfezione disponibili in commercio possono supportare elevata efficienza di trasfezione 16, ma possono essere molto costoso per preparazioni di grandi dimensioni vettore. Metodi di precipitazione di fosfato di calcio fornire trasfezione molto efficiente di cellule 293T e fornire così un approccio affidabile e conveniente per la produzione di vettori lentivirali. In questo protocollo, si produrre vettori lentivirali per cotrasfezione di cellule 293T con quattro plasmidi basati sul principio di precipitazione con fosfato di calcio, seguito da purificazione e concentrazione con ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio 20%. I titoli vettore sono determinate da fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) analelisi o qPCR in tempo reale. La produzione e la titolazione dei vettori lentivirali di questo protocollo può essere rifinito con 9 giorni. Forniamo un esempio di trasduzione questi vettori in murini culture neocorticali contenenti sia i neuroni e astrociti. Dimostriamo che i vettori lentivirali sostenere ad alta efficienza di trasduzione e delle cellule tipo-specifica espressione genica nelle cellule primarie in coltura da CNS.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System at JoVE.com

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

In questo protocollo si descrive la produzione, purificazione e titolazione di vettori lentivirali. Forniamo un esempio di vettori lentivirali mediata consegna gene in colture primarie neuroni ed astrociti. I nostri metodi possono valere anche per altri tipi di cellule<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.8K Views.  Washington University School of Medicine. In questo protocollo si descrive la produzione, purificazione e titolazione di vettori lentivirali. Forniamo un esempio di vettori lentivirali mediata consegna gene in colture primarie neuroni ed astrociti. I nostri metodi possono valere anche per altri tipi di cellule In vitro E In vivo.

Video: Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Ricerca

Neuroscienze

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...