Attivare tutti i componenti di configurazione dell'acquisizione per la misurazione della fluorometria. Posizionare il piatto inferiore di vetro da 35 millimetri contenente le fibre muscolari dissociate sul palco del microscopio. Rimuovere con attenzione il terreno di coltura con una pipetta da 1.000 microlitri e sostituirlo con 2 millilitri di soluzione di suoneria a temperatura ambiente.
Utilizzando un manipolatore meccanico o motorizzato, posizionare i due fili di platino perpendicolarmente al fondo del piatto. Assicurarsi che i terminali degli elettrodi siano allineati rispetto all'asse longitudinale della fibra e a pochi millimetri di distanza dalle estremità della fibra. Regolare il posizionamento dell'elettrodo ruotando il piatto o spostando ciascun elettrodo se montato su un micro manipolatore indipendente.
Accendi la luce trasmessa e trova le fibre nel campo visivo usando un obiettivo 20X. Spostare il cubo del filtro EGFP nel percorso della luce. Dopo aver spento la luce trasmessa, attivare la luce di eccitazione a 488 nanometri utilizzando un otturatore telecomandato.
Per identificare le fibre EGFP positive, centrare le fibre con il segnale EGFP più luminoso al centro del campo visivo. Utilizzare un diaframma posizionato nel percorso della luce di eccitazione per focalizzare la luce di eccitazione in un'area specifica della fibra. Ciò consente l'acquisizione del segnale, dove il segnale EGFP CaV1.1 è massimo.
Regolare la posizione della fibra con lo stadio meccanico per allinearsi con il percorso della luce del diaframma e memorizzare la posizione XY della fibra. Dopo essere tornati alla prima localizzazione salvata, impostare la durata di due impulsi di stimolazione sequenziale su 1 millisecondo, l'ampiezza a 20 volt e la polarità degli impulsi su alternati. Quindi, utilizzare un interruttore di attivazione manuale per fornire i due impulsi sequenziali.
Durante la stimolazione, osservare due contrazioni concentriche omogenee delle fibre in risposta ai due impulsi di polarità opposta. Se non si osserva alcuna contrazione o una sola contrazione concentrica con impulsi di polarità alternati, scartare le fibre dal resto dell'esperimento. Aggiungere 2 microlitri di soluzione MTS 5 TAMRA da 10 millimolari direttamente nel piatto e mescolare delicatamente con una pipetta da 1.000 microlitri.
Incubare per quattro o cinque minuti per consentire la diffusione della molecola di tiolo fluorescente nel lume del sistema tubulo trasversale. Attraverso la stimolazione di campo, applicare stimolazioni ripetitive bipolari per evocare treni di potenziale d'azione successivi ad una velocità di 50 hertz per 300 millisecondi ogni 1 secondo per 5 minuti. Rimuovere la soluzione colorante dal piatto con una pipetta da 1.000 microlitri.
E sostituirlo con 2 millilitri di soluzione di suoneria a temperatura ambiente. Lasciare che la fibra macchiata si riprenda dal protocollo di colorazione per almeno 10 minuti. Dopo aver rivalutato la salute delle fibre e l'attività elettrica con due impulsi alternati, spostare il cubo del filtro MTS 5 TAMRA nel percorso della luce e attivare la luce di eccitazione a 533 nanometri con un otturatore di luce telecomandato per confermare visivamente la colorazione sulle fibre.
Successivamente, utilizzando la posizione memorizzata sul palco motorizzato, posizionare la fibra al centro del campo con il cubo filtrante MTS 5 TAMMA, il diaframma e l'obiettivo di immersione in olio 60X. Dopo aver riorientato i fili di platino di stimolazione del campo a ciascuna estremità della fibra, allineare i fili sull'asse principale delle fibre in linea retta e distanziarli di cinque millimetri, con la fibra al centro. Nel software di acquisizione, selezionare il protocollo che verrà utilizzato per l'acquisizione.
Questo passaggio è controllato solo con il computer e attiva tutti i dispositivi a valle per la stimolazione elettrica e il controllo dell'otturatore del percorso della luce. Per ogni protocollo, ridurre al minimo il tempo totale di acquisizione il più possibile per evitare lo sbiancamento del segnale, ma consentire alcune decine di millisecondi di illuminazione della luce e acquisizione del segnale prima della prima stimolazione elettrica per registrare una linea di base. Esegui il protocollo premendo Esegui.
Il segnale registrato viene visualizzato automaticamente sullo schermo. La piccola ampiezza del segnale e la rapida contrazione meccanica della fibra spesso nascondono la maggior parte del segnale e mostrano un artefatto di movimento. Aggiungere 1 micromolare di 100 millimolari e benzoile paratoluene sulfonamide alla soluzione di registrazione per ridurre al minimo le risposte contrattuali e distinguere ulteriormente il segnale derivante dai movimenti S4 dovuti all'attivazione della fibra.
Dopo alcuni minuti, eseguire lo stesso protocollo una seconda volta. L'artefatto del movimento è ora rimosso, ma rimane un piccolo cambiamento di fluorescenza corrispondente al movimento S4. Spostare leggermente il piatto utilizzando lo stadio meccanico per acquisire un segnale da un'area senza fibre o detriti.
Eseguire il protocollo un'ultima volta per registrare la fluorescenza di fondo. Esportare le tracce e utilizzare un programma di fogli di calcolo per esprimere il segnale come delta f su f 0 in funzione del tempo e applicare la correzione della linea di base, se necessario. Gli esempi di immagini trasmesse e fluorescenti del muscolo sezionato e non dissociato che esprimono un costrutto EGFP CaV1.1 sono mostrati qui.
Le immagini rappresentative di una fibra muscolare che esprime un costrutto EGFP CaV1.1 VS D3 prima e dopo la colorazione MTS 5 TAMRA sono mostrate in questa figura. Questo colorante colora anche le cisteine endogene di fibre non trasfettate. Le immagini confocali di un costrutto EGFP CaV1.1 VS D3 e la colorazione MTS 5 TAMRA mostrano un pattern a doppia banda caratteristico della localizzazione di CaV1.1 sul sistema tubulo trasversale della fibra muscolare.
La registrazione fluorometrica rappresentativa in risposta a due stimoli e misurata con un fotodiodo è mostrata qui. Entrambi i segnali sono normalizzati dal loro valore minimo e tracciati in funzione del tempo relativo alla rispettiva depolarizzazione. Queste registrazioni mostrano che la fase ascendente e il tempo di picco del segnale sono simili per entrambe le depolarizzazioni imposte sulla fibra.
