Inizia mettendo un topo gravido sacrificato sulla schiena su una tavola di dissezione. Usando una pinza, pizzica la linea mediana addominale. Con un paio di forbici affilate, tagliare l'addome attraverso la pelle e il peritoneo dai genitali alla gabbia toracica sopra la linea mediana.
Rimuovere l'utero contenente gli embrioni e metterlo immediatamente sul ghiaccio. Tagliare con cura attraverso il sacco vitellino sui lati placentari e rimuovere gli embrioni. Quindi, posizionare le teste embrionali decapitate in un piatto ghiacciato contenente HBSS carente di calcio e magnesio.
Posizionare la testa in un piatto da 35 millimetri rivolto a sinistra. Forare un occhio con il bordo della pinza, tenendo saldamente il mento con l'altro. Strappare delicatamente la pelle del cuoio capelluto dalla nuca lungo la linea mediana verso il muso.
Usa la pinza angolata per entrare attraverso il midollo spinale ovale bianco e rompere il cranio aperto lungo la linea mediana, esponendo il cervello. Staccare delicatamente il cranio dai lati. Quindi, sollevare il cervello dal cranio e smaltire il cranio.
Utilizzare una pinza per rimuovere le meningi. Metti il cervello in un bijou contenente due millilitri di HBSS carente di calcio e magnesio. Aggiungi 250 microlitri di tripsina 10X al bijou.
Triturare il cervello scuotendo il bijou e poi incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere due millilitri di inibitore della tripsina di soia a ciascun bijou. Agitare per disperdere uniformemente l'inibitore.
Senza centrifugazione, trasferire due millilitri di surnatante da ogni bijou in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Utilizzando un ago calibro 19 collegato a una siringa da cinque millilitri, aspirare la sospensione due volte per triturare le cellule rimanenti nel bijou. Ripetere l'aspirazione due volte con un ago calibro 21.
Utilizzando un ago da 23 G, trasferire le cellule dal bijou nel tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente il surnatante cellulare e centrifugare a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millimetri, trasferire tutto il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri senza disturbare il pellet. Ripetere la centrifugazione.
Aggiungere 10 millilitri del mezzo galvanico in un tubo contenente i pellet combinati da entrambe le fasi di centrifugazione e mescolare bene per creare una sospensione intera. Colorare le cellule con tripano blu e contare usando un emocitometro o un contatore cellulare. Placcare le cellule aggiungendo il volume richiesto della sospensione di cellule cerebrali embrionali E17 murine in una piastra a pozzetto.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto il 5-7% di anidride carbonica per due o quattro ore. Dopo aver rimosso il supporto, aggiungere nuovi supporti di differenziazione a ciascun pozzetto. Premere verso il basso eventuali vetrini di copertura flottanti utilizzando una punta sterile per pipetta.
Mantenere le colture rimuovendo parte del surnatante e sostituendolo con nuovi mezzi di differenziazione tre volte alla settimana. Le colture sono state visualizzate mediante colorazione immunofluorescenza per NG2 e nestina come marcatori dello sviluppo, SMI31, MBP e NeuN come marcatori neuronali e CNP, GFAP e Iba1 come marcatori gliali L'infezione di colture con virus neurotropico della foresta di Semliki ha colpito gli oligodendrociti e i neuroni. Le indagini qRT-PCR delle cellule infette hanno dimostrato una sovraregolazione dell'mRNA della citochina chemiotattica Ccl5 in colture trattate con interferone beta.
Gli studi ELISA hanno mostrato un aumento di Ccl5 nel surnatante, mostrando così una correlazione tra mRNA ed espressione proteica. Studi citometrici a flusso di sospensione monocellulare hanno mostrato che il 70% delle cellule è rimasto vitale. Un gran numero di microglia, neuroni e astrociti erano presenti, mentre gli oligodendrociti erano i meno abbondanti.
