Ringraziamo i nostri colleghi presso il Dipartimento di Biologia, Università di Friburgo per fruttuose discussioni. Ringraziamo il Bloomington Stock Center per la fornitura di scorte di mosca. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Fondo nazionale svizzero (PP00P3_123339) e la Fondazione Velux per SGS

1. Allevamento larvale <ol><li> Tenere volare ceppi o incroci genetici nella cultura di massa a 25 ° C su mais pasto medio in un 12-ore di luce a 12 ore di buio in una mosca incubatore dotato di luce e timer. </li><li> Diluire sostenitore lievito in acqua per formare una pasta fluida (10 g di lievito sostenitore diluita con 3-4 ml di H 2 O distillata). Aggiungere una piccola goccia per il pasto di mais e coprire le fiale. Lasciare asciugare per almeno un&#39;ora per evitare di mosche adulte attaccare alla pasta di lievito. Mettere una piccola goccia di lievito diluito in acqua sulla superficie del cibo può migliorare ovideposizione. Alternativamente fornaio lievito pasta, acido acetico 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Svizzera A6283-100ml) può essere utilizzato. Per questo, immergere la punta di un Q-tip sulla soluzione e diffusione sulla superficie alimentare farina di mais. </li><li> Mettere mosche adulte (almeno quattro giorni, ma non più di dieci giorni) in farina di mais fiale alimentari. Mettere abbastanza adulti in ciascuna provetta per ottenere larve sufficiente ripetere la preferenzaprovare diverse volte e la comparazione statistica. Per incroci genetici, si utilizzano in genere un minimo di 20 femmine e maschi 5-10 per flaconcino, ma alcune linee richiediamo più femmine per ottenere un sufficiente prole larvale. </li><li> Consentire agli adulti di deporre le uova per 12 ore e trasferirle a nuove fiale. Gli adulti possono essere trasferiti al mattino e alla sera. Noi di solito trasferiamo adulti per sette-dieci giorni e se necessario prendere nuove adulti. </li><li> Mantenere le collezioni d&#39;uovo scattate ogni 12 ore in incubatrice e far crescere le larve a 25 ° C, 12 ore di luce a 12 ore di buio e 60% di umidità. Per eseguire il test per i componenti circadiani di movimento comportamento visivo larve di buio costante (DD) 48 ore dopo la raccolta delle uova (corrispondente a cicli di due-luce-buio). Per questo, utilizzare un incubatore a parte senza luce ma mantenere tutte le altre condizioni quali la temperatura e l&#39;umidità identici. Accertarsi di trasferire le fiale al DD incubatrice poco prima del passaggio alla fase di buio. Prima di spostare le fiale di another incubatore messo fiale in una scatola di cartone o di avvolgere i flaconcini con un foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce durante il trasferimento (imballaggio in scatole di cartone o imballaggio deve essere fatto durante la &quot;luci-on fase&quot; prima del passaggio tra incubatori). Evitare che gli animali da qualsiasi esposizione alla luce dopo questo punto e fino a inizio esperimenti. </li><li> Dopo 4 giorni (84-108 ore dalla deposizione delle uova) raccogliere presto L3 (alimentazione larve) ai punti di tempo per essere testato (vedi 4. Leggera preferenza prova, punto. 4.4.). </li></ol> 2. Configurazione di test <ol><li> Effettuare esperimenti in una stanza buia con temperatura costante e umidità. </li><li> Per mantenere due quadranti della piastra Petri nelle tenebre, coprire il coperchio con del nastro bianco e un foglio di alluminio. Per fare così, segnare il centro della circonferenza coperchio. Anche segnare quattro punti nel bordo del coperchio con 90 ° di separazione fra loro. Per rendere più facile, disegnare un quadrato 20 centimetri diviso in quattro quadranti di 10 cm di lunghezza su unfoglio di carta o con l&#39;aiuto di un computer. Tagliare 10 centimetri quadrati di carta stagnola e nastro nero (Figura 1A). Coprire due quadranti opposti incollando un quadrati di foglio di alluminio, come primo strato e il nastro nero che copre esso, fare attenzione a coprire anche il bordo del coperchio. In passato sono stati utilizzati due forme leggermente differenti di questo test. Noi qui usiamo il saggio &quot;quarter-plate&quot;, in cui il piatto Petri è diviso in quattro quarti uguali 10. Nel saggio &quot;half-plate&quot; alternativa la piastra di Petri è diviso metà (metà esposto alla luce, metà in oscurità) 1,7,8. Fino ad oggi, senza differenze significative tra i due dosaggi è stato pubblicato. </li><li> Colla un foglio quadrante come quello utilizzato per marcare i coperchi proprio sotto la sorgente luminosa sul tavolo. Contrassegnare la circonferenza di un piatto Petri centrata sull&#39;intersezione quadranti. Utilizzare i contrassegni come riferimento per posizionare la piastra di prova sempre nella stessa posizione sotto la sorgente di luce. </li><li> Installare unlampada, o una semplice lampadina bianca (Phillips, Soft tone 5W) o di una lampada a LED (lampada LED, 80012 Bianco, Osram) al di sopra della piastra di Petri con l&#39;aiuto di un cavalletto di sostegno in ferro (Fisher Scientific, S47808). Regolare l&#39;altezza in modo che l&#39;intera piastra di prova viene illuminata in modo omogeneo. Si consiglia vivamente l&#39;utilizzo di lampade LED dal momento che emettono le lunghezze d&#39;onda più specifici rispetto alle tradizionali lampadine. Inoltre LED emettono meno calore. </li><li> Regolare l&#39;intensità della luce con l&#39;aiuto di un fotometro (Ambiente PCE EM882). Per raggiungere l&#39;intensità luminosa necessaria di 350-760 lux, la lampada spostare su o giù come richiesto. Collegare la lampada ad un alimentatore regolabile maggiore versatilità per cambiare intensità senza spostare la lampada (Figura 1B). </li></ol> 3. Piatti Preparazione <ol><li> Fare 200 ml di agar 2,5% (Sigma-Aldrich, Svizzera A5093-500G) con acqua bidistillata (Millipore). </li><li> Porre piastre Petri su un tavolo (90 mm di diametro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria) in file per consentire versando caldo agarosio. </li><li> Bollire l&#39;agarosio in un forno a microonde fino a quando la soluzione è completamente trasparente e fluida. Assicurarsi che la soluzione liquida non contiene bolle. ATTENZIONE: Trasporti con attenzione la tabella poiché la soluzione può essere molto caldo! </li><li> Versare agarosio caldo in piastre Petri finché l&#39;intera superficie viene omogeneamente ricoperta con un sottile strato di soluzione, circa due o tre millimetri sono sufficienti. Sii veloce per evitare di agarosio solidificare prima di tutte le lastre di rivestimento. Lasciate raffreddare le piastre. Conservare le piastre a temperatura ambiente e utilizzarle solo lo stesso giorno della preparazione. </li></ol> 4. Test di preferenza Luce <ol><li> Operare in condizioni di luce rosso in camera esperimento di impedire l&#39;influenza della luce prima della prova Drosophila poiché non è in grado di percepire le lunghezze d&#39;onda di luce rossa. Utilizzare una lampadina rossa (Phillips, PFE712E * 8) montato in una lampada per illuminare tha posto per lavorare. </li><li> Mantenere la temperatura in tutti gli esperimenti a 25 ° C. Controllo della temperatura ambiente mediante un dispositivo di riscaldamento o di raffreddamento, se necessario. </li><li> Prendete un po &#39;di cibo dai flaconi allevati per cicli di due giorni in buio costante (da sezione 1). Poiché larve sono solitamente scavando sulla superficie del cibo, prendere lo strato più elevato (circa 5 mm di profondità) con l&#39;aiuto di una spatola (Fisher Scientific, 14-373-25A). Distribuire il cibo sul lato esterno di un piatto coperchio Petri, aggiungere un po &#39;d&#39;acqua e mescolare delicatamente con la spatola. </li><li> Raccogliere alimentazione L3 larve dal cibo. Come preferenza luce sarà testato, scegliendo solo all&#39;inizio / nutrire le larve L3 è di fondamentale importanza in quanto la fototassi negativo è assicurato. Tardo / errante L3 larve o grande larva strisciando sul cibo presumibilmente già acceso il loro photobehavior. Nutrire larve L3 (phototactic negativo) può essere riconosciuto perché i loro spiracoli anteriori sono aperte e sporgenti verso l&#39;esterno in una forma di dita. Il spiracle posteriores hanno tre aperture ciascuno, e quattro gruppi di grossi peli ramificati. Le ghiandole salivari estendono al secondo segmento addominale 11. Messa in scena di larva al microscopio è conveniente, mentre nessuna luce bianca deve essere usato. Una lampada spia rossa è necessario illuminare le larve, se messa in scena sotto microscopio stereoscopico prima è richiesto esperimenti. </li><li> Lavare larve rapidamente in acqua corrente e raccogliere precoce alimentazione larve di terza instar (ancora in luce rossa). Prima di trasferire le larve alla piastra di prova, prendere le larve con un pennello bagnato e assorbire accuratamente l&#39;acqua in eccesso con un tovagliolo di carta o carta da filtro. Non asciugare larve troppo eccessivamente in quanto potrebbe danneggiare l&#39;animale e influenzare il suo comportamento. </li><li> Utilizzando il pennello bagnato trasferire accuratamente le larve di piatti. Posizionare un gruppo di circa 30 larve al centro della piastra. Coprire la piastra con il coperchio già preparato con i quadranti e impostare la piastra sotto la sorgente di luce pronto per l&#39;esperimento (vedi sezzione 2). </li><li> Accendere la lampada luce bianca e avviare il timer. Lasciare la larva muoversi liberamente sulla piastra per 5 minuti, quindi rimuovere rapidamente il coperchio e contare il numero di larve al buio e nei quadranti luminosi. Marcare la posizione di ogni larva con un pennarello può facilitare il conteggio. In alternativa, fare una foto del piatto e contare a posteriori. Larve mostrando preferenza luce poco chiara, come larve strisciando sulle pareti o scavare nel agar deve essere considerato come preferenza neutro e solo essere incluso nel numero totale di larve quando l&#39;indice preferenza luce viene calcolato. </li><li> Dopo il conteggio, scartare la piastra con larve e sostituirla con una nuova piastra di prova per il prossimo esperimento. Raccogliere lastre utilizzate in un sacchetto di plastica autoclave per la manipolazione e lo smaltimento tardi. </li><li> Dopo aver eseguito un numero sufficiente di esperimenti di un nuovo genotipo può essere testata. 10-15 prove per genotipo sono sufficienti per l&#39;analisi. </li></ol> 5. L&#39;analisi des <ol><li> Per comodità di trasferire i dati ad un modulo dati in Excel (Microsoft) o Origine (Origin Lab) su un computer per ulteriori analisi statistiche. Disporre in una colonna il numero di animali in buio, in una seconda colonna il numero di animali in quadranti luce e nella terza il totale degli animali nella piastra (comprese larve &quot;neutro&quot;). </li><li> Calcolare l&#39;indice di preferenza (PREF) per il buio per ciascun esperimento utilizzando la seguente formula: PREF (buio) = (numero di larve nel buio - numero di larve di luce) / numero totale delle larve </li><li> Confrontare statisticamente un insieme di dati con un&#39;analisi appropriata per gruppi. Qui, usiamo un test di Wilcoxon per confrontare statisticamente due gruppi. Un test ANOVA con multiple-confronto di un Tukey post hoc test può essere fatto, se normale ipotesi di distribuzione si compie in un confronto di gruppo collettore. </li><li> Fai i grafici che mostrano chiaramente i confronti tra linee e punti di tempo lungo il ciclo giorno. We l&#39;uso del software Origin (Origine Lab) per testare la significatività statistica e generare grafici appropriati, ma qualsiasi altro software di statistica può essere utile. </li></ol>

<ol>
	<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li><li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates.">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons.">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors:+unconventional+ways+of+seeing.">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li><li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor.">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li><li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference.">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li><li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smellblind:+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction.">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Pittendrigh, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+Entrainment.">Circadian systems: Entrainment.</a> Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).</li><li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+Activity+between+LN(v)s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila.">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il test di preferenza luce descritta sfrutta l&#39;innata photobehavior larvale. Il test è facile da stabilire, permette molte ripetizioni a basso costo e fornisce preziose informazioni di rilevamento e di elaborazione della luce. Il paradigma sperimentale consente relativamente rapida quantificazione di quanti individui preferiscono chiaro o scuro. Tale preferenza può essere visualizzato come percentuale del greggio o in alternativa come Indice di Preferenza (PREF). Il PREF è espresso come differenza di animali che ...

Qui si descrive un test comportamentale basato sulla preferenza delle larve per scuro (o chiaro). Larve reagire con una risposta photonegative forte e stereotipie durante le fasi di foraggiamento (da L1 a L3 presto) 1. Il saggio è volto a valutare il comportamento photophobic della larva e confronta la preferenza chiaro o scuro di un gruppo di larve di muoversi liberamente in una capsula di Petri rivestito con agar. Questa analisi comportamentale fornisce non solo informazioni sulla sensibilità, l&#39;integrazione e temporale plasticità del sistema visivo, fornisce ulteriori suggerimenti su come sensibilità alla luce e il suo processo è controllato dal sistema circadiano. Il larvale occhio Drosophila (anche chiamato Organo Bowlig; BO), è il principale organo per la percezione della luce. Ogni occhio è composto da 12 fotorecettori (PR), otto PR esprimono il verde-sensibile rhodopsin6 (rh6) e quattro PR esprimere il blu-sensibile rhodopsin5 (RH5) 2,3. Oltre a PR, also di classe IV neuroni multidendritic, che coprono la parete del corpo larvale, sono stati identificati per rispondere alle nocivi intensità di luce 4,5. È anche noto che i neuroni pacemaker situati nel cervello larvale centrale esprimono la proteina sensibile alla luce Cryptochrome (Cry) che funge da sensore di luce blu orologio intrinseca all&#39;interno del cervello 6,7. Curiosamente photophobicity di animali di tipo selvatico mostra un componente circadiana a tempi diversi durante il corso del giorno e della notte durante il test con questo saggio. Le risposte alla luce di foraggiamento L3 larva hanno mostrato forte photophobicity all&#39;alba e photophobicity inferiore al crepuscolo durante il test di preferenza luce-buio 7. È interessante notare che solo RH5-PR sono necessari per evitare la luce, mentre Rh6-PR sono superflui. Entrambi, RH5-PR e Rh6-PR sono coinvolti nella regolazione dell&#39;orologio molecolare dalla luce 8. Il percorso Cry deve essere coordinata con gli altri percorsi di rilevazione della luce di orchestrare un appropriato uscita comportamentale nelcorso della giornata. Acetilcolina nel PR gioca un ruolo essenziale nel comportamento di evitamento luce così come trascinamento dell&#39;orologio molecolare. Blocco acetilcolina neurotrasmissione da PR a neuroni pacemaker circadiano riduce la risposta fotofobica nella preferenza saggio luce-oscurità 8. Impiegando lo stesso saggio, due coppie simmetriche di neuroni sono state recentemente identificate per commutare la preferenza luce del terzo stadio larvale di Drosophila 9. Queste due coppie di neuroni può essere funzionante durante ultime fasi larvali, quando gli animali lasciano il cibo per trovare presumibilmente un sito pupariation appropriato. Tuttavia, la questione di come le vie visive interagiscono e controllano il comportamento visivo larvale in modo circadiano rimane in gran parte senza risposta. Il saggio di preferenza luce consente confronti tra momenti circadiani, volano linee e statali circadiano con diverse qualità di luce. Il saggio è facilmente preparato e poco costoso ed è stato utile in precedenza in diversi laboratori per descrivere e studiare il comportamento derivato luce nella larva.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5093-500G</td>
 <td>2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Greiner Bio-One GmbH</td>
 <td>633180</td>
 <td>90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LEDs Lamp</td>
 <td>OSARAM </td>
 <td>80012 White</td>
 <td>LED lamp, 80012 White</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Environment Meter</td>
 <td>PCE</td>
 <td>PCE EM882</td>
 <td>Lux, Temp, RH%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermostatic cabinet</td>
 <td>Aqua Lytic (Liebherr)</td>
 <td>ET636-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Light timer</td>
 <td>Timer T</td>
 <td>6185.104</td>
 <td>230V/50HZ (check specifications for your country)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Universal thermostat</td>
 <td>Conrad</td>
 <td>UT200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Humidifier</td>
 <td>Boneco</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balck tape</td>
 <td>Tesa</td>
 <td></td>
 <td>5 cm </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glue</td>
 <td>Uhu</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lncubator lamp</td>
 <td>Phillips</td>
 <td>Softtone</td>
 <td>5W</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timer clock</td>
 <td>Ziliss</td>
 <td></td>
 <td>Ziliss, Switzerland</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Excel Software</td>
 <td>Microsoft</td>
 <td></td>
 <td>Excel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Origin Software 8.5</td>
 <td>OriginLab</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Backer Yeast</td>
 <td>Migros Switzerland</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iron support stand 17X28CM</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>S47808</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A6283-100ML</td>
 <td>20% acetic acid dilluted in H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Red light lamp</td>
 <td>Phillips</td>
 <td>PFE712E*8C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spatula </td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-373-25A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>EA</td>
 <td>EA PS 2042-06B</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminium foil</td>
 <td>Prix Coop</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater</td>
 <td>GOON</td>
 <td>NSB200C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microwave Oven</td>
 <td>Intertronic</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard corn meal fly food</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Destilled water </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in drosophila larvae

Atti luce come segnale ambientale per controllare il comportamento degli animali a vari livelli. Il sistema nervoso Drosophila larvale è usato come un modello unico per rispondere alle domande di base su come le informazioni luce viene elaborato e condiviso tra i comportamenti rapidi e circadiano. Visualizzare larve di Drosophila un comportamento di evitamento stereotipata quando esposti alla luce. Per studiare i comportamenti crepuscolare relativamente semplici test preferenza luce-buio possono essere applicati. Nei vertebrati e artropodi i percorsi neurali coinvolti nella rilevazione ed elaborazione input visivi si sovrappongono parzialmente a quelle di elaborazione photic informazioni circadiano. La questione affascinante di come il sistema di rilevamento della luce e il sistema circadiano interagiscono per mantenere uscite comportamentali coordinati rimane largamente inesplorato. Drosophila è un modello impatto biologico affrontare questi problemi, a causa di un piccolo numero di neuroni nel cervello e la disponibilità di strumenti genetici per MANIPUL neuronalezione. Il saggio di preferenza chiaro-scuro presentato consente l&#39;indagine di una serie di comportamenti visivi tra cui il controllo circadiano di fototassi.

Seguendo il protocollo descritto in precedenza, abbiamo testato la preferenza chiaro-scuro nei primi mesi del terzo stadio larvale di tipo selvatico Canton-S vola a due diversi tempi circadiani CT0 e CT12. Adulti sono stati allevati 12 ore di luce a 12 ore buio e lasciati a deporre le uova per 12 ore. Le larve crescono i primi due giorni sotto lo stesso regime di chiaro-scuro. Dal momento che abbiamo voluto testare la modulazione circadiana in condizioni costanti (free running dell&#39;orologio circadiano), larve sono s...

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Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

12.8K Views.  University of Fribourg. Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

Video: Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Measuring Circadian and Acute Light Responses in Mice using Wheel Running Activity

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2. They are responsible for timing our sleep/wake cycles and hormone secretion. Since this timing is not precisely 24-hours, it is synchronized to the solar day by light input. This is accomplished via photic input from the retina to the suprachiasmatic nucleus (SCN) which serves as the master pacemaker synchronizing peripheral clocks in other regions of the brain and peripheral tissues to the environmental light dark cycle3-7. The alignment of rhythms to this environmental light dark cycle organizes particular physiological events to the correct temporal niche, which is crucial for survival8. For example, mice sleep during the day and are active at night. This ability to consolidate activity to either the light or dark portion of the day is referred to as circadian photoentrainment and requires light input to the circadian clock9. Activity of mice at night is robust particularly in the presence of a running wheel. Measuring this behavior is a minimally invasive method that can be used to evaluate the functionality of the circadian system as well as light input to this system. Methods that will covered here are used to examine the circadian clock, light input to this system, as well as the direct influence of light on wheel running behavior.

This article will review methods that can be used to determine circadian function and light responsiveness in mice.

Risposte di misura della luce circadiani e acuta nel topo, utilizzando attività ruota corsa

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2.  They ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Gusto Preferenza Assay per adulti<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...