Per configurare il nuovo sistema di coltura a flusso multicanale senza pompa, dopo aver assemblato il modulo del serbatoio dei terreni o l'MRM, inserire i gruppi di tubi al suo interno e posizionare l'MRM nel riscaldatore. Dopo aver fissato il riscaldatore in posizione, procedere all'inserimento dei gruppi della camera tissutale o TCA nel modulo della camera di perfusione o nel PCM. Utilizzando lo strumento di inserimento TCA, inserire ciascuno degli otto TCA uno alla volta nei fori PCM.
Assicurarsi di premere saldamente sull'adattatore con l'utensile fino a quando la parte superiore del manicotto del tubo attorno a ciascuna camera tocca la superficie che circoscrive i fori nel PCM. Mettere da parte il PCM parzialmente assemblato insieme al supporto PCM e alle sei viti. 30 minuti dopo l'assemblaggio dell'involucro e dopo che l'MRM ha raggiunto la temperatura desiderata, utilizzando una pipetta da 50 millilitri, trasferire il perffato prebilanciato nell'inserto MRM preriscaldato disperdendo delicatamente il liquido lungo i lati.
Successivamente, per posizionare il PCM sull'MRM, inserire i tubi di resistenza TCA che emanano dalla parte inferiore del PCM negli inserti MRM, quattro su ciascun lato del divisore MRM. Orientare il modulo in modo che le camere tissutali poggino contro il rilevatore di ossigeno una volta posizionato. Fissare il PCM al supporto utilizzando sei viti e il cacciavite elettrico.
Quindi fissare i TCA all'interno delle alette di supporto PCM utilizzando l'elastico in dotazione, allungandolo attorno alle alette a livello delle guarnizioni in gomma. Posizionare il rilevatore di ossigeno sul supporto del rilevatore assicurandosi che la sua faccia poggi contro le alette del PCM. Allineare le coppie di fotorivelatori LED con il colorante sensibile all'ossigeno nelle camere tissutali allentando le viti poste sul lato del supporto del rilevatore e regolando le guide laterali del rilevatore, se necessario.
Infine, posiziona il coperchio sopra l'involucro. Per caricare il tessuto nelle camere, attendere che il livello del terreno sia a 0.5 pollici dall'alto. Per caricare la retina prelevata o la sclera coroidea RPE, utilizzando una pinza a punta fine, posizionare delicatamente la retina senza piegarla in ciascuna camera.
Nel frattempo, utilizzare una salvietta per fazzoletti per evitare che il liquido della camera del tessuto goccioli sul sensore di ossigeno. Lascia che il tessuto affondi verso e sopra il FRET. Per caricare le cellule RPE sulle membrane Transwell, dopo aver passato le cellule preparate con EDTA allo 0,25% di tripsina, seminarle su filtri incisi su tracce di polietilene tereftalato aventi una dimensione dei pori di 0,4 millimetri.
Il giorno dell'esperimento, tagliare le membrane in tre strisce di uguale larghezza e caricarle nelle camere tissutali usando una pinza. Il tasso di consumo di ossigeno, o OCR, della retina è rimasto costante durante il periodo in cui sono stati iniettati i composti in esame, indicando la salute e la funzione stabili del tessuto e supportando la validità del metodo. Coerentemente con i dati ottenuti utilizzando i metodi di perfusione convenzionali sia per la retina che per la sclera coroide RPE, l'OCR è diminuito in risposta all'oligomicina ed è aumentato in risposta alla FCCP.
Le variazioni nel tasso di produzione di lattato o LPR osservate sono state l'opposto di quelle osservate per l'OCR. Le cellule RPE, che non sono state precedentemente analizzate con sistemi di flusso, hanno risposto in modo simile alla sclera coroide RPE utilizzando questo metodo.
