Il lavoro è stato finanziato dal Ministero federale tedesco per l&#39;Istruzione e la ricerca, GO-Bio di Grant No. 0.315.569.

NOTA: prepuce giovanile umana è stato ottenuto con il consenso informato ed etica approvazione (Comitato Etico dell&#39;Università Charité Medicina, Berlino, Germania), nel rispetto delle leggi vigenti, da una chirurgia pediatrica dopo circoncisioni di routine. 1. Produzione di equivalenti dei tessuti per la coltivazione in MOC <ol><li> Aggregare HepaRG e HHSteC in appeso lastre goccia per generare sferoidi fegato. <ol><li> Per conseguire la tripsinizzazione delle cellule HepaRG coltivate in fiaschi di coltura cellulare (75 cm 2), rimuovere il terreno da confluenti, colture monostrato differenziate, lavare con PBS due volte, e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA. Incubare per 3 a 5 min a 37 ° C e fermare la reazione aggiungendo 6 ml di inibitore della tripsina. </li><li> Cellule Centrifuga HepaRG a 150 xg per 5 minuti, togliere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzo di coltura cellulare HepaRG, e contare le cellule. La vitalità cellulare deve essere&gt; 90%. </li><li> InPer conseguire la tripsinizzazione delle cellule HHSteC, rimuovere il terreno da colture monostrato, lavare con PBS due volte, e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA. Incubare per 5 min a 37 ° C e fermare la reazione aggiungendo 6 ml di inibitore della tripsina. </li><li> Centrifugare le cellule HHSteC a 150 xg per 5 min, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzo di coltura cellulare HepaRG, e contare le cellule. </li><li> Combinare HepaRG e HHSteC con un rapporto di 24: 1 in HepaRG mezzo di coltura cellulare. Per fare ciò, regolare il numero di cellule diluendo sospensioni cellulari in HepaRG mezzo di coltura cellulare e aggiungere 1 x 10 5 cellule / ml HHSteC a 4,8 x 10 6 cellule / ml HepaRG cellule. Mescolare con cura. </li><li> Preparare un piatto goccia appeso aggiungendo 2 ml di PBS al calo pensile e piano di appoggio. </li><li> Pipettare 20 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra goccia pendente. Preparare sempre circa il 10% in più appeso gocce che è necessario recuperare aggregati, come alcuni aggregati sono persi during la procedura. Posizionare con cura la piastra in un incubatore C 37 °. Attendere 48 ore per i sferoidi per formare. </li><li> Al fine di recuperare i sferoidi, assicurarsi di utilizzare le punte delle pipette con terminazioni punta larghe o tagliare la punta delle punte 1 ml pipette con un coltello sterile, per ampliare l&#39;apertura di circa 2 o 3 mm. Utilizzare questi suggerimenti pipette per gestire le sferoidi senza interrompere. </li><li> Lavare accuratamente sferoidi dalla piastra goccia pendente aggiungendo ripetutamente 1 ml di media per la parte superiore dei pozzetti della piastra appeso goccia con una pipetta. Lavare la piastra fino a quando tutti gli sferoidi sono cadute. Spheroids sono leggermente con un diametro medio di 300 a 400 micron e un&#39;altezza di 200 a 300 micron, a questo punto discoidale. </li><li> Raccogliere le sferoidi nella piastra ricevente e trasferirli piastre di fissaggio 24-ben ultra-bassi con un massimo di 20 sferoidi per bene con le punte delle pipette preparati. Regolare i volumi media in ogni pozzetto a 0,5 ml. Utilizzare 20 aggregati Inocolare un circuito MOC ad ottenere un tasso di miniaturizzazione di 1 / 100.000 per quanto riguarda in numero di cellule in vivo. </li><li> Incubare le sferoidi a 37 ° C e 5% CO 2 fino a nuovo uso nella MOC. Non conservare sferoidi più di tre giorni prima dell&#39;uso per assicurare la comparabilità. Coltivate aggregati per almeno un giorno piastre di fissaggio ultra-bassa per recuperare i sferoidi omogenee. </li></ol></li><li> Perseguire uno dei due approcci per generare equivalenti tessuto cutaneo: l&#39;uso di biopsie (1.2.1) o l&#39;uso di ready-made in modelli in vitro di tessuti (1.3.1). <ol><li> Tagliare transwells con un coltello incandescente sotto la staffa per preparare 96 pozzetti inserti di coltura cellulare e conservare in condizioni di sterilità fino a nuovo uso. </li><li> Sterilizzare campioni prepuzio in 80% di etanolo per 30 secondi e tagliare l&#39;anello aperto. I campioni devono avere una altezza media di 2 mm. </li><li> Utilizzare una biopsia per tagliare biopsie da 4,5 mm di diametro per ottenere una parità miniaturizaRapporto zione sia per il fegato e la pelle. Caricare le biopsie nel preparato 96 pozzetti transwell inserti con una pinza. Fare attenzione a posizionare le biopsie con il lato rivolto verso l&#39;alto epidermica. </li><li> Cultura Cellule di posizione inserisce con biopsie in un piatto ricevitore contenenti HepaRG coltura cellulare e conservare a 37 ° C e 5% di CO 2 fino a nuovo uso nella MOC. Non conservare i campioni più di 2 o 3 ore. </li></ol></li><li> Integrare ready-made in modelli in vitro della pelle, acquistato da diversi fornitori, nel MOC, facendo in modo che essi siano in 96 pozzetti transwell formato. Utilizzare il mezzo di coltura cellulare fornito dal venditore o, se è previsto un co-coltura con un altro tessuto in un ulteriore passo, utilizzare un terreno minimo supporto sia nei tessuti. Testare rispettivo terreno minimo in esperimenti statici precedenti per la sua capacità di sostenere i tessuti. <ol><li> Recuperare i modelli di pelle dalla piastra di supporto e tagliare gli inserti 96 pozzetti di sotto della staffa con un coltello incandescente. </li&gt; <li> Posizionare gli inserti indietro nella piastra ricevente e conservare a 37 ° C e 5% CO 2 fino a nuovo uso nella MOC. Non conservare campioni più lunghi di un giorno. </li></ol></li></ol> 2. Fabrication MOC <ol><li> Mescolare le PDMS e agente indurente in un rapporto di 10: 1 (v / v) e posizionare la miscela sotto vuoto per 15 minuti per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Nel frattempo, il trattamento di un coperchio piastra in policarbonato con l&#39;additivo gomma siliconica a 80 ° C per 20 min. </li><li> Inserire viti Teflon in rispettivi fori della piastra di copertura per creare quattro free-PDMS compartimenti coltura cellulare e le sei PDMS membrane, 500 micron di spessore, della micropompa. </li><li> Collegare il coperchio piastra pronti a stampo maestro dei due circuiti microvascolari e iniettare le PDMS degassati. Fare attenzione a non integrare le bolle d&#39;aria nel sistema. Se bolle emergono, provare a rimuoverli inclinando il dispositivo. </li><li> Incubare il sistema a 80 ° C per 60 min per curare il livello PDMS. </li><li> Togliere lo stampo master e le viti in Teflon dal dispositivo e legare lo strato PDMS di un vetrino con un ingombro 75 x 25 mm 2 con bassa ossidazione del plasma pressione. </li><li> Vite speciale adattatori filo MOC a tutte e quattro compartimenti coltura cellulare della copertura piastra. </li><li> Collegare siringhe contenenti terreno di coltura a femmina Luer x ¼-28 adattatori maschio e avvitarli agli adattatori MOC della copertura piastra. </li><li> Iniettare il medium nel circuito microfluidica ripetutamente spingendo e tirando le siringhe pistoni. </li><li> Controllare il corretto riempimento dei canali con liquido sotto il microscopio. </li></ol> 3. endotelizzazione del MOC <ol><li> Prima endothelializing la MOC, flush ogni circuito MOC con mezzo di crescita delle cellule endoteliali e incubare staticamente per tre giorni a 37 ° C e 5% di CO 2. <ol><li> Sterilizzare i MOCS utilizzando una etanolo wipe e metterli sotto una panca a flusso laminare. Ion Inoltre, sterilizzare due paia di pinze e due chiavi esagonali per un ulteriore uso. </li><li> Allentare i tappi del vano di coltura di tessuti del MOC utilizzando i tasti esagonali e rimuovere i tappi con le pinze. Dopo aver inserito il supporto, avvitare tappi indietro alle MOCS nello stesso modo. </li></ol></li><li> Per conseguire la tripsinizzazione delle cellule endoteliali microvascolari cutanea umane (HDMEC), rimuovere il terreno dalle colture monostrato, lavare con PBS due volte, e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA. Incubare per 5 min a 37 ° C e fermare la reazione aggiungendo 6 ml di inibitore della tripsina. </li><li> Centrifugare il HDMEC a 220 xg per 5 minuti, togliere il surnatante, risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di crescita delle cellule endoteliali, e contare le cellule. La vitalità cellulare deve essere&gt; 90%. </li><li> Regolare il numero di cellule in sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 2 x 10 7 cellule / ml diluendo con endoteliale mezzo di crescita cellulare e trasferire 250 ul di auna siringa da 1 ml. Applicare questa concentrazione di cellule al MOC per mantenere il tasso di miniaturizzazione 1 / 100.000 per tutti gli organi. </li><li> Collegare la siringa di una femmina Luer x ¼-28 adattatore maschio, espellere l&#39;aria di questo montaggio, e la vite ad uno speciale adattatore filettato MOC. Collegare l&#39;adattatore ad uno dei due compartimenti di ciascun circuito MOC. </li><li> Collegare una siringa vuota allo stesso modo al secondo compartimento del circuito MOC. </li><li> Iniettare le cellule in modo uniforme spingendo verso il basso e tirando i due stantuffi siringa più volte in modo consecutivo. Controllare l&#39;infusione di cellule al microscopio. </li><li> Incubare la MOC a 37 ° C e 5% CO 2 in condizioni statiche per 3 ore per permettere alle cellule di aderire alle pareti del canale. </li><li> Rimuovere il chip dal termostato, posizionarlo sotto un banco a flusso laminare, e sostituire le siringhe e gli adattatori MOC con speciali filo MOC camere di coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 400 ml di mezzo fresco a una compartimento di ogni circuito MOC e farlo lavare attraverso i canali per pressione idrostatica. Successivamente, sostituire il mezzo in entrambi i compartimenti con 300 ml di mezzo fresco. </li><li> Chiudere i comparti con cappucci, come descritto in 3.1.2. </li><li> Collegare il chip alla centralina pompa. Regolare la velocità di pompaggio ad una frequenza di 0.475 Hz e coltivare il chip a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Sostituire il supporto di ogni compartimento MOC ogni uno o due giorni e monitorare la morfologia delle cellule al microscopio ottico. </li></ol> 4. Caricamento del Chip <ol><li> Posizionare il MOC sotto la panca flusso laminare e aprirlo, come descritto al punto 3.1.2. </li><li> Togliere la carta dal compartimenti coltura di tessuti e sostituirlo con 300 ml di fresco terreno di coltura cellulare HepaRG. </li><li> Trasferire 20 sferoidi preformate per un tessuto compartimento cultura di ogni circuito di MOC con i puntali delle pipette con un&#39;ampia apertura (vedere i passaggi 1.1.8 / 9). Chiudere la cap con pinze e chiavi esagonali. </li><li> Trasferire 96 pozzetti inserti di coltura cellulare contenente equivalenti della pelle per il restante comparto coltura di tessuti di ogni circuito MOC con pinze. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle sotto la membrana dell&#39;equivalente pelle. Per fare questo, inserire transwells ad un angolo leggermente inclinato e spingere delicatamente verso il basso. Rimuovere eccesso di terreno intorno al transwell essere spinto verso l&#39;alto dal basso con una pipetta. </li><li> Chiudere il tappo con pinze e chiavi esagonali. </li></ol> 5. Collegamento del Chip all&#39;Unità Comando Pompa <ol><li> Impostare i parametri di funzionamento delle unità di controllo ai valori desiderati. Modifica pressione da 0 a 8000 mbar, vuoto da 0 a -800 mbar, e pompaggio frequenza 0,24-2,4 Hz. Impostare la direzione di pompaggio in senso orario o antiorario. </li><li> Rimuovere le MOC contenente equivalenti di tessuto da sotto il banco a flusso laminare e collegarlo alle unità di controllo della pompa. </li><li> Dopo la numeration sui tubi, inserire tubi pressione ai rispettivi raccordi sul MOC. </li><li> Coltivare MOC a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore o, nel caso di immagini tessuto vivo, utilizzare il supporto MOC per riscaldare il chip a 37 ° C e coltivare il chip all&#39;esterno dell&#39;incubatrice. Utilizzare il supporto riscaldato a coltivare cellule del MOC al microscopio standard. </li></ol> 6. Esecuzione scambi Media, Sampling Media e l&#39;esposizione a sostanze <ol><li> Eseguire scambio supporti routine ogni giorno o ogni altro giorno, considerando il tipo di tessuto coltivato e l&#39;attività metabolica delle cellule. <ol><li> Recuperare il MOC dal termostato e osservare al microscopio per il controllo dei media portata e verificare la contaminazione. </li><li> Scollegare il MOC dalla centralina pompa scollegando il tubo della pressione dell&#39;aria. Sterilizzare il MOC con salviette etanolo e metterla sotto il banco a flusso laminare. </li><li> Aprire la coltura di tessuti compartment contenente sferoidi fegato, come descritto al punto 3.1.2. </li><li> Rimuovere fino a 200 microlitri dal vano usando una pipetta senza interrompere sferoidi e conservare il terreno in un pozzetto vuoto di una piastra di pozzo. Analizzare il campione dei media direttamente o chiudere la piastra profondo bene e conservare i campioni di media a -80 ° C per ulteriori analisi. </li><li> Sostituire il supporto del MOC con un massimo di 250 microlitri fresco mezzo di coltura cellulare e chiudere il tappo. La differenza nella quantità di mezzo rimosso e conti per la perdita sostituito a causa di piccole quantità fuoriuscita del chip quando si chiude il sistema. </li><li> Aprire il tappo del vano coltura tissutale tenendo gli equivalenti della pelle a questo punto per verificare integrità dei tessuti. Fare attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria nel sistema. Chiudere il tappo. </li><li> Collegare il tubo di regolazione della pompa al MOC, secondo la fase 5.3, e posizionare il MOC in un incubatore. </li></ol></li></ol> 7. Analizza Campioni giornaliera media e eseguire on-line di analisi <ol><li> Analizzare tessuto prestazioni cultura on-line utilizzando l&#39;imaging cellulare dal vivo o offline, analizzando i campioni di media al giorno. Eseguire la seconda da test standard di routine enzimatici (ad es lattato deidrogenasi (LDH) di attività) o ELISA (ad esempio la concentrazione di albumina). Un&#39;analisi linea è descritta nel seguito. </li><li> Rimuovere il supporto del MOC endotelizzazione, come descritto nei punti da 6.1.1 a 6.1.4, e sostituirlo in entrambi i comparti di coltura tissutale con 200 ml di soluzione di 10 mg / ml fluoroforo coniugato acetilato lipoproteine ​​a bassa densità (LDL) (diluito in cell terreni di coltura). </li><li> Chiudere i tappi. Collegare MOC alla centralina pompa, secondo la fase 5.3, e la pompa per 30 min a 0.475 Hz per distribuire uniformemente la soluzione nel circuito microfluidica. </li><li> Arrestare il pompaggio e incubare il MOC staticamente per 3,5 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> T Simileo punto 7.2, rimuovere la soluzione LDL acetilata da entrambi i compartimenti e sostituirlo con 400 ml di terreno fresco in uno dei due scomparti. </li><li> Attendere da 3 a 5 minuti per lasciare che la pressione idrostatica guidare il mezzo attraverso il circuito canale microfluidica. </li><li> Sostituire il mezzo che ha fluito attraverso con 300 ml di mezzo fresco e anche riempire il secondo scomparto coltura di tessuti con 300 ml di terreno fresco. </li><li> Chiudere la MOC, secondo passo 3.1.2. Mettere sotto un microscopio a fluorescenza e osservare la crescita cellulare e la vitalità. </li><li> Posizionare la MOC macchiato di nuovo in incubatrice per continuare la coltivazione. Rimuovere la macchia fuoriuscire le cellule con ciascun seguente sostituzione dei supporti. </li></ol> 8. Recuperare equivalenti tessuto dal MOC e eseguire analisi end-point <ol><li> Recupera equivalenti di tessuti del MOC alla fine dell&#39;esperimento per le analisi degli endpoint. <ol><li> Per recuperare il fegato e la pelle equivalents dal MOC, rimuovere il supporto per ciascun compartimento di coltura tissutale, come descritto ai punti 6.1.1 a 6.1.4. </li><li> Rimuovere gli inserti di coltura cellulare a 96 pozzetti contenenti la pelle dal MOC con pinze. Rimuovere la membrana accuratamente dall&#39;inserto afferrandolo su un lato con una pinza e tirandolo verso il basso. Fare attenzione a non perdere l&#39;equivalente della pelle, a questo punto. </li><li> Congelare la membrana che tiene l&#39;equivalente in pelle composto crio embedding e conservarlo a -80 ° C fino a quando ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Rimuovere gli equivalenti del fegato in modo simile dal vano di coltura tissutale pipettando utilizzando puntali per pipette taglio (vedi punto 1.1.8 / 9). <ol><li> Incorpora sferoidi fegato in compound-crio embedding. Fare attenzione a non trasferire troppo liquido e rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta. Dopo aver posizionato sferoidi sul composto incorporamento e la rimozione del mezzo, aggiungere ulteriore composto cryo sulla sommità degli sferoidi loro racchiudere completamente. </li><li> Congelare gli equivalenti fegato e conservarlo a -80 ° C fino ad ulteriore analisi. </li></ol></li><li> Effettuare analisi endpoint tagliando gli equivalenti di tessuto in un crio-microtomo a 8 micron sezioni e colorazione per marcatori tessuto-specifiche, come descritto nelle precedenti protocolli 10. </li></ol>

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J., Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfabricated+Array+Bioreactor+for+Perfused+3D+Liver+Culture.">A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).</li></ol>

Uwe Marx è Amministratore Delegato di TissUse GmbH che produce e commercializza la piattaforma Multi-Organ chip utilizzati in questo articolo. Questa pubblicazione è stata finanziata con un premio concesso da Corning Inc.

La piattaforma MOC descritto rappresenta uno strumento stabile e potente per la coltivazione di tessuti di varia origine in condizioni di flusso medie dinamiche per periodi prolungati di coltura 10,16. In questo esempio, la piattaforma è stato usato per coltivare le cellule primarie (HDMEC), equivalenti tessuto generati da una linea cellulare (aggregati fegato), e un co-coltura del citato con una biopsia tissutale. La MOC è stato in grado di sostenere la co-coltura di tre tessuti fino a 28 giorni in un circuito medio combinato. Per quanto a conoscenza degli autori, questa è la prima volta un coculture multi-tessuto comprese biopsie, cellule primarie e linee cellulari è stata eseguita per quattro settimane. Uno dei principali inconvenienti dei sistemi microfluidici è l&#39;affinità di piccole molecole di aderire al materiale di superficie del circuito fluidico. Poiché il rapporto tra superficie e volume è particolarmente elevata in sistemi microfluidici, questo effetto diventa ancora più pronunciato 17 </sup&gt;. La copertura HDMEC stabile dei canali, introdotto qui, potrebbe agire da barriera biologica impedire l&#39;adesione delle molecole al MOC. Inoltre, può servire come un vaso emocompatibilità per tutta la circolazione sanguigna, impedendo la coagulazione del sangue. Tuttavia, l&#39;uso del sangue intero come sostituzione terreno non è fattibile, come non è ancora stato raggiunto un vascolarizzazione completa degli equivalenti organi. Lavori per la vascolarizzazione dei tessuti -Generata in vitro esistente è promettente e guida la strada a ulteriori studi 18,19. È ben noto che epatociti tendono a perdere le loro funzioni specifiche fegato nel tempo sotto statico bidimensionali in vitro condizioni di coltura 20. Enzimi del metabolismo, come la famiglia del citocromo P450, sono di particolare importanza se il metabolismo di un certo farmaco è da studiare. Citocromo P450 3A4, un enzima legato alla biotrasformazione di molti xenobiotici, e citocromo P450 7A, which è coinvolto nella sintesi degli acidi biliari, sono stati espressi nel fegato aggregati coltivate in MOC oltre 14 giorni. Ciò indica la conservazione di un fenotipo metabolicamente attiva, consentendo studi sul metabolismo farmaco. L&#39;aumento del tasso di produzione di albumina di aggregati nel MOC rispetto alle culture statiche è un&#39;indicazione supplementare per adeguate condizioni di coltura. I tassi di produzione di albumina osservati nel corso di questo studio sono stati paragonabili o addirittura superiori a quelli precedentemente riportati ottenuti da chip microfluidici tra cui cellule HepG2 21 - 23, invece, i valori non ha raggiunto quelli delle culture di epatociti umani primari 24. Inoltre, il sistema MOC, nella sua configurazione temporanea, non consente una separazione separata di bile. Le cellule in strutture aggregate canalicoli simili biliari polarizzati e formati, come mostrato dal MRP-2 colorazione. Tuttavia, tali canalicoli non erano collegati ad un canale tecnica raccolta della bile. Questo mix non-fisiologicazione della bile con il vano di sangue deve essere affrontata in un futuro riprogettazione del sistema. La regolazione delle caratteristiche di flusso è di grande importanza 25, soprattutto per quanto riguarda i tessuti sensibili a sollecitazioni di taglio, come il fegato. La quantità di sollecitazione di taglio percepito dal tessuto può essere modificata in due modi: in primo luogo, la pressione dell&#39;aria usata per spingere le membrane della pompa può essere abbassata, diminuendo valori di picco della tensione tangenziale nel sistema. In secondo luogo, i tessuti possono essere incorporati in una stratificazione matrice extracellulare o coltivati ​​in inserti cultura transwell. Quest&#39;ultimo schermare i tessuti della corrente sottostante con una membrana porosa. Queste regolazioni devono essere eseguite su base individuale per ogni equivalente organo prima di iniziare l&#39;esperimento MOC. A un&#39;operazione pulsatile di 2,4 Hz, per esempio, che corrisponde ad una elevata attività, ma ancora fisiologica cardiaca di 144 battiti / min nell&#39;uomo, la sollecitazione di taglio misurata nelcanali del circuito microvascolare raggiunge circa 25 dine / cm 2. Ciò corrisponde ad una sollecitazione di taglio fisiologico alla fine più alto della scala in microcircolo ed è, quindi, ben applicabile per esperimenti compresa una endotelizzazione dei canali. Tuttavia, poiché la corrente di layout microfluidica del sistema MOC presentata consiste di un solo circuito di media che collega i due compartimenti organo, un tasso di sollecitazione di taglio e la velocità di pompaggio deve essere scelto per l&#39;intero sistema. Pertanto, un adeguamento preciso delle caratteristiche di flusso alle esigenze di ogni singolo organo non è sempre fattibile. Inoltre, la cura deve essere presa nella regolazione delle cellule per mezzo di comuni. Le cellule vengono coltivate in MOC in un circuito di media combinata, quindi, nessun individuo mezzi di coltura cellulare può essere utilizzato per ogni modello di tessuto, come è lo standard per coltura cellulare in vitro. Una formulazione dei media combinato minima deve essere definito in anticipo e tegli le cellule devono essere adeguate graduale a questo nuovo media. Una procedura di regolazione del 80% / 20% vecchio per nuovi media per due giorni, poi 50% seguita / 50% del 20% / 80%, e uno scambio sempre portato a una vitalità cellulare ragionevole e la funzionalità delle culture nelle nostre mani. L&#39;attuale assetto microfluidica del sistema MOC permette di co-coltura fino a tre tessuti. È necessaria una co-coltura di almeno il dieci organi più importanti del corpo umano per raggiungere omeostasi. Pertanto, il sistema presentato è in grado di predire interazioni tessuto tessuto specifici, ma non il vero risposta sistemica a una sostanza. Un ulteriore sviluppo del MOC per includere più cavità di organi è prevista. Inoltre, la validità del sistema deve essere mostrato utilizzando una serie di composti di riferimento. Preferibilmente, composti che hanno fallito durante gli studi clinici (come Troglitazone) devono essere testati per la loro performance nel MOC. Considerando che, una vera e propria convalida di tali sistemi complessi è ancora ostacolato by la mancanza di standardizzazione relativa biomarcatori e endpoint per la valutazione funzionale, raccogliendo più dati sulle prestazioni tossicologici di questa e simili sistemi amplierà la loro affidabilità e l&#39;area di applicazione.

Monostrato o di sospensione attuali test di coltura cellulare per lo sviluppo di farmaci non riescono a emulare il microambiente delle cellule umane e, quindi, portare a una de-differenziazione rapida e perdita di funzione in colture primarie di cellule umane. Sono necessari modelli di tessuto con una maggiore rilevanza fisiologica di predire l&#39;efficacia e la sicurezza di composti per ammetterli alla sperimentazione clinica. Recentemente, di serie nelle tecniche di coltura cellulare in vitro hanno evoluto da colture monostrato bidimensionali verso modelli multi-cellulari tridimensionali, con l&#39;obiettivo di imitare il vivo microambiente tessuto. Questi sistemi hanno già mostrato importanti miglioramenti verso previsione più accurata della modalità di azione dei composti 1,2. Inoltre, adattando le condizioni di coltura in vitro delle esigenze altamente specializzate di cellule è di particolare interesse. In serie in condizioni in vitro, una serie di importanti culture parametri, quali la fornitura di nutrienti e ossigeno, la rimozione dei prodotti accumulando e forza meccanica che agiscono sulle cellule spesso non possono essere controllati accuratamente nella maggioranza dei casi. Molti organi possiedono gradienti di concentrazione fisiologicamente rilevanti di sostanze e di ossigeno disciolto. Tuttavia, tali condizioni altamente regolamentati e ottimizzati sono in netta opposizione ai gradienti di diffusione incontrollabili intorno tessuti in condizioni in vitro, che porta a un ambiente altamente instabile e limitando sviluppo cellulare 3. Così, sono richiesti più stabile e soprattutto più quantificabile in condizioni in vitro per mantenere le cellule vitali e differenziato per periodi di tempo prolungati. Sistemi di perfusione, in cui i componenti di media vengono regolarmente rimossi e sostituiti, sono spesso meglio caratterizzati e controllabile di culture statiche riguardanti la circostante diretta dei tessuti. In condizioni statiche, gradienti di diffusione di secrezioni cellulari e medie cultura nutrientipotrebbe circondare cellule in coltura 3. Introduzione ben caratterizzati portate medie intorno ai tessuti permettono secrezioni cellulari per mescolare con il ricco mezzo attraverso perfusione. Ciò consente la generazione di microambienti cellulari definiti, assicurando un fenotipo cellulare stabile e metabolizzare espressione dell&#39;enzima per tutta la durata del test 4. I recenti sviluppi in chip di multi-organo (MOC) a base di sistemi uniscono i vantaggi di un flusso medio controllato attorno tessuti con le piccole esigenze medie e di massa delle cellule di bioreattori microscala ingegnerizzati, portando ad una ridotta quantità di sostanza necessaria durante il test. Diversi sistemi microfluidici per coltura tissutale sono state descritte finora 5,6. Tissue-a-liquido rapporti all&#39;interno di questi sistemi svolgono un ruolo fondamentale soprattutto nella simulazione fisiologicamente rilevanti crosstalk cellulare. Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, come l&#39;uso di pompe esterne e serbatoi multimediali, the nel complesso il volume circolante media la maggior parte dei sistemi è troppo grande rispetto ai volumi di tessuto. Il gruppo di Shuler et al. Sono stati i primi a sviluppare un sistema che garantisca tempi di permanenza propri di sostanze all&#39;interno dei compartimenti di coltura cellulare e in vivo rilevanti rapporti 7,8 tessuto-to-fluido. Questo è stato ottenuto scalando il serbatoio esterno fino a una piastra a 96 pozzetti, che rappresenta anche il comparto &quot;altri tessuti&quot;. Per minimizzare il volume circolante media all&#39;interno nostra piattaforma MOC, abbiamo integrato un peristaltica on-chip micropompa, eliminando la necessità di circuiti supporti esterni. Questa micropompa è in grado di operare il sistema ad un numero selezionabile di velocità di flusso media e tassi di sollecitazione di taglio 9. Un sistema canale microfluidico di 500 micron di larghezza e 100 micron altezza interconnette due spazi coltura tissutale standardizzati, ciascuna avente la dimensione di un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aderendo alle dimensioni dell&#39;industria pozzetti di series permette l&#39;integrazione di modelli di tessuto già esistenti prodotte nel formato transwell. Inoltre, la posizione verticale transwell inserti di coltura cellulare è regolabile, permettendo la coltivazione di modelli di tessuto che non solo direttamente esposti al flusso di fluido, ma può anche essere sollevato e schermato dalla corrente sottostante. Allo stesso modo, le culture di interfaccia aria-liquido sono fattibili con questo sistema. La piattaforma MOC è fabbricato da un polidimetilsilossano (PDMS) strato di 2 mm e un vetrino da microscopio in vetro con un ingombro di 75 x 25 mm 2, che sono legati in modo permanente a bassa ossidazione del plasma pressione per formare il circuito di microfluidica tenuta di fluido. Lo strato PDMS contenente i rispettivi canali e vani di colture cellulari è prodotto da litografia soft di serie e replica stampaggio 9. Il design microfluidica del MOC utilizzata durante questo studio consisteva di due circuiti separati microfluidica per chip, ciascuno con due celle ccompartimenti ulture interconnessi da un sistema di canali 100 micron alta. Questo ha permesso l&#39;esecuzione di due co-colture di due tessuti singoli con un chip multi-organo. Frequenze di pompaggio sono stati adeguati per produrre medie portate di 40 microlitri / min. Questo disegno MOC due tessuti disponibile la capacità di co-coltura uno sferoide fegato e una biopsia cutanea in spazi coltura separati, anche se in un circuito di media combinata in condizioni di flusso fisiologiche. Cellule differenziate HepaRG sono stati aggregati insieme con le cellule umane epatiche stellate (HHSteC) in un rapporto di 24: 1 per formare sferoidi omogenee. Questo rapporto è risultato ottimale, come osservato negli esperimenti precedenti 10, anche se, quasi il doppio del numero di epatociti sono stati utilizzati rispetto alla situazione in vivo. La pelle era coltivato ad una interfaccia aria-liquido all&#39;interno di un inserto di coltura cellulare transwell, consentendo in tal modo l&#39;esposizione sostanza topica. Questi modelli di tessuto sono stati cocultivated per 28 days del MOC per dimostrare la completezza di questo sistema. Inoltre, il circuito di canale microfluidico dei chip è stato completamente ricoperto con le cellule endoteliali microvascolari cutanea umana (HDMEC) per simulare più strettamente il sistema vascolare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HepaRG cells</td>
			<td style="width:163px;">Biopredic International</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HHSteC</td>
			<td style="width:163px;">ScienCell Research Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr height="171">
			<td height="171" style="height:171px;width:216px;">HepaRG Medium</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">William&#39;s Medium E&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FCS&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 U/ml penicillin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 &#181;g/ml streptomycin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/ml human insulin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 2 mM L-glutamine&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HDMEC Medium</td>
			<td style="width:163px;">PromoCell</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Biowest</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsininhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MAXYMum Recovery Tips</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1000 &#181;l Pipet Tips Wide Bore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:163px;">3D Biomatrix</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Tissue culture flasks</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-low attachment plate</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transwell cell culture inserts</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well unit,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deep well plates</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:163px;">Stusche</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>4.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass microscope slide</td>
			<td style="width:163px;">Menzel</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>footprint of 75 x 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon rubber additive</td>
			<td style="width:163px;">Wacker Chemie</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Wacker Primer G790</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes for air pressure</td>
			<td style="width:163px;">SMC Pneumatik GmbH</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Polyurethan-Schlauch, metrisch</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alumin ELISA</td>
			<td style="width:163px;">Bethyl Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase assay</td>
			<td style="width:163px;">Stanbio Laboratory</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>LDH Liqui-UV kit</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Alexa Fluor 594 acetylated LDL</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Standard in vitro colture tissutali vengono eseguite in condizioni statiche, limitando la diffusione di ossigeno e nutrienti fornitura ai tessuti. Sistemi fluidici, mostrando le caratteristiche di alimentazione migliorate, sono spesso ostacolate dal loro grandi esigenze medie, avendo non fisiologicamente alta media di rapporti tessuti. Così, metaboliti vengono diluiti e cellule non sono in grado di condizionare l&#39;ambiente circostante. Il MOC presentato in questo studio collega due compartimenti separati coltura di tessuti, ciascuno delle dimensioni di un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti standard da un sistema di canale microfluidico. La piccola scala del sistema e l&#39;integrazione della pompa sul chip permette al sistema di funzionare a volumi di media di soli 200 a 800 microlitri. Ciò corrisponde ad un supporto sistemico totale rapporto tissutale di 8: 1 a 31: 1, rispettivamente, per i co-colture di tessuto di fegato e la pelle (aventi un volume totale del tessuto di circa 26 microlitri). Il volume del liquido extracellulare totale in un uomo del peso di 73 kg è 14,6 L, di cui il volume di fluido infracapillari è 5.1 L, portando ad un fluido fisiologico extracellulare rapporto tissutale di 1: 4. Pertanto, la quantità di materiale in tutto il sistema di circolazione nel MOC è ancora più grande rispetto alla situazione fisiologica; e tuttavia, rappresenta la più piccola media per rapporto tessuto segnalato finora per sistemi multi-organo 5. Come si mantengono industriali standard formati coltura tissutale, i ricercatori sono in grado di combinare modelli tessuti statici esistenti e già validati all&#39;interno di un flusso di fluido comune. La Figura 1 mostra lo schema di una configurazione sperimentale di possibili co-colture tissutali MOC singolo o multi-tessuto. Biopsie dei tessuti primari e in vitro -Generata equivalenti di tessuto da linee cellulari o cellule primarie possono essere coltivati ​​sia con inserti in colture cellulari a 96 pozzetti o mettendoli direttamente nei compartimenti coltura di tessuti. Come il sistema di canali di interconnessione dei comparti di coltura cellulare è a soli 100 μm di altezza, gli equivalenti dei tessuti che superano queste dimensioni sarà mantenuta entro i comparti della cultura. La endotelizzazione del circuito MOC con HDMECs primarie consente un ulteriore passo in avanti verso una maggiore condizioni di coltura fisiologiche fornendo una struttura vascolare biologica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Rappresentazione schematica di culture MOC equivalenti tessuti sono preparati in condizioni standard in vitro, inoculato nel MOC e coltivato come culture singoli o co-colture in condizioni dinamiche. Vengono eseguiti campioni multimediali giornaliere e analisi dell&#39;endpoint. La pressione dell&#39;aria per azionare la pompa viene applicato attraverso i tre tubi blu collegati al MOC dall&#39;alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </a&gt; Seguendo il protocollo endotelizzazione, una copertura HDMEC confluenti del circuito canale microfluidico è ottenuta entro quattro giorni di coltura dinamica, come mostrato nella Figura 2. Cellule facilmente aderiscono alle pareti del canale MOC, creano un monostrato confluente, e allungano lungo il taglio lo stress (Figura 2B). Inoltre, cellule coprono l&#39;intera circonferenza dei canali, come riportato in precedenza 9. Nessun ulteriore cambiamento nella morfologia endoteliale è stata osservata dopo quattro giorni di coltivazione fino alla fine della cultura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig2.jpg" /> Figura 2:. Endotelizzazione canali MOC cellule endoteliali dermiche microvascolari umano (HDMEC) formano un monostrato confluente nel circuito microfluidica. Le cellule sono state colorate con LDL acetilata dopo 23 giorni di coltura MOC. (A) L&#39;intero mCircuito icrovascular era coperto di cellule e (B), le cellule allungate lungo la sollecitazione di taglio. Barre di scala: (A) 1.000 micron e (B) 100 micron. In un altro esperimento, sferoidi di cellule del fegato a forma di disco consistenti sono formate da HepaRG e HHSteC durante due giorni di appendere cultura goccia, in quanto questo modello di sistema è stato precedentemente segnalato come adatta per il metabolismo dei farmaci Studi 11 - 13. A scopo dimostrativo, un compartimento coltura di tessuti di ogni circuito MOC è stato seminato con 20 sferoidi in inserti di colture cellulari da 96 pozzetti e tessuti sono stati coltivati ​​oltre 14 giorni in condizioni dinamiche utilizzando MOCS non endotelizzazione. Qualsiasi numero di aggregati o quantità di materiale primario può essere integrato direttamente nei vani o utilizzando inserti di coltura cellulare. Immunofluorescenza degli sferoidi dopo il recupero dal MOC mostra una forte, espressione omogenea per liver-tipico citocheratina 8/18 e di fase I che metabolizzano enzimi del citocromo P450 3A4 e 7A1 (Figure 3A e 3B). La colorazione del trasportatore canalicolare multi-drug resistance protein 2 (MRP-2) ha rivelato un fenotipo polarizzato e l&#39;esistenza di reti canalicoli-like biliari rudimentale (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig3.jpg" /> Figura 3 :. Coltivazione di fegato artificiale micro-tessuti umani negli aggregati MOC. Fegato coltivati ​​per 14 giorni nel MOC erano macchiati per (A) citocheratina 8/18 (rosso) e (B) del citocromo P450 3A4 (rosso) e 7A1 (verde). (C) Espressione di canalicular transporter MRP-2 (verde), colorazione nucleare blu. Bar Scala: 100 micron. Poiché la produzione di albumina è una condizione essenziale delle colture di tessuti del fegato, ha apen selezionato per monitorare l&#39;attività del fegato-tipico della MOC. Analizzando campioni di supporti giornalieri per la produzione di albumina mostra un aumento significativo della velocità di produzione in colture MOC rispetto a colture statiche (Figura 4) e ai valori riportati in letteratura 11. L&#39;aumento del tasso di sintesi di albumina può essere attribuito alla maggiore ossigeno e nutrienti fornitura in culture MOC. Quindi, il MOC è in grado di sostenere aggregati fegato su un periodo di coltura di 14 giorni in uno stato metabolicamente attiva, migliorando il comportamento fegato tipica, come la produzione di albumina. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig4.jpg" /> Figura 4: Quattordici giorni prestazioni sferoide fegato nel MOC produzione Albumina di fegato singole culture di tessuti in MOC e nella cultura statica.. I dati sono medie ± SEM (n = 4). Subsystemic ripetute test di tossicità dose di Chemicals e cosmetici su animali richiede 21 a 28 giorni di esposizione, come definiti dalla linea guida dell&#39;OCSE n. 410 &quot;di dosi ripetute dermica acuta: 21/28 giorni di studio.&quot; Co-colture di pelle di fegato a lungo termine sono esemplificati qui per fino a 28 giorni per far fronte ai requisiti normativi. Un&#39;interfaccia aria-liquido è previsto per dopo l&#39;esposizione sostanza dermica coltivando biopsie cutanee in inserti di colture cellulari da 96 pozzetti. L&#39;esperimento di co-coltura viene eseguita in modo esemplare MOCS endotelizzazione per dimostrare se un coculture tre tessuti in un circuito mediatico combinato può essere mantenuto vitale e metabolicamente attivo più di 28 giorni. Analisi dell&#39;attività LDH nei sovranatanti multimediali rivelato un livello costante diminuzione durante i primi otto giorni di coltura, che è rimasto costante a circa 80 U / l successivamente (Figura 5). Ciò indica un ricambio del tessuto artificiale ma stabile nel sistema in momenti successivi. Confrontando il coculture tre tessuto unico fegatoesperimenti co-coltura -tissue e fegato-endoteliale, un livello di LDH notevolmente diminuito potevano trovare, soprattutto durante i primi giorni di culture non compresa la pelle. La morte cellulare in questo primo periodo di alta attività LDH si è verificato soprattutto nel comparto cultura pelle, come la pelle dei tessuti singola culture MOC rivelato (dati non riportati). Questo potrebbe essere dovuto alla zona circostante la ferita biopsia a seguito della punzonatura della pelle. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig5.jpg" /> Figura 5: prestazioni tessuto Quindici giorni nell&#39;attività LDH MOC nei sopranatanti dei media di colture di tessuti (fegato singolo MOC Li), culture di fegato in MOCS endotelizzazione (MOC Li-Va) e co-colture fegato-pelle a endotelizzazione MOC (MOC Li. -Va-Sk). I dati sono medie ± SEM (n = 4). Durante il periodo di coltura di 28 giorni, sferoidi fegato rispettati fondo del MOC uncellule nd cresciuto fuori, formando un collegamento multistrato tra sferoidi adiacenti. Questo non ostacolare la funzionalità del tessuto. Analisi Endpoint mediante immunofluorescenza ha mostrato che sferoidi fegato erano ancora metabolicamente attivi dopo 28 giorni di co-coltura MOC, come mostrato dal citocromo P450 3A4 colorazione (figura 6A). HHSteC stati distribuiti nell&#39;intero equivalente fegato, come mostrato dalla colorazione vimentina (Figura 6B). Un aumento di intensità di colorazione vimentina può essere osservato in aree in cui le cellule erano cresciute di sferoidi. Colorazione per il fattore di von Willebrand (vWF) hanno dimostrato che le cellule endoteliali non erano penetrati in profondità nel tessuto, ma erano in contatto diretto cellula-cellula con gli epatociti esterni (Figura 6c). Immunoistochimica colorazione delle biopsie cutanee mostrava un&#39;espressione di tenascin C e collagene IV nella membrana basale (Figura 6D), mentre la colorazione del controllo statico mostrato elevatlivelli ED di tenascin C (Figura 6E). Tenascin C ha dimostrato di essere sovraregolata durante la guarigione delle ferite, processi infiammatori e fibrosi, suggerendo indotto processi fibrotici in statico, ma non nelle culture dinamiche 14,15. Vitalità cellulare stabile e funzionalità dei tessuti dopo una coculture 28 giorni MOC dimostrano che il sistema è in grado di mantenere una combinazione di fino a tre tessuti in un circuito comune media. Cellule primarie, nonché i modelli dei tessuti e biopsie, possono essere coltivate simultaneamente nel sistema MOC. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig6highres.jpg" width="700" /> Figura 6:. Prestazioni di culture multi-tessuti oltre 28 giorni equivalenti fegato e biopsie cutanee sono stati coltivati ​​in una funzionalità MOC e cellule endotelizzazione è stato dimostrato da immunocolorazione di (A) Fase I enzimi del citocromo P4503A4 (rosso), (B) vimentina (rosso), (C) citocheratina 8/18 (rosso) e vWF (verde) nel tessuto epatico. Biopsie cutanee cocultivated per 28 giorni (D) nel MOC o (E) in condizioni statiche sono state colorate per tenascin c (rosso) e collagene IV (verde), colorazione nucleare blu. (F) H &amp; E colorazione della pelle dopo 28 giorni di coltura MOC. Bar Scala: 100 micron.

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The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture | Bioengineering | Video

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Il Chip Multi-organo - Una piattaforma Microfluidic per lungo termine co-coltura Multi-tessuto

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

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28.4K Views.  Technische Universität Berlin. Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Una piattaforma microfluidica multistrato per la conduzione di un'espressione genica prolungata senza cellule

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...