1 Dopo aver sezionato scBAT2 dal topo soppresso, 3 inserire immediatamente il tessuto in una provetta da microcentrifuga. 4 Praticare un foro nella parte superiore della provetta con un ago sterile 5 e congelare a scatto in azoto liquido. 6 Immergere un pestello e una spatola sottile in azoto liquido.
7 Versare il campione di tessuto congelato 8 dalla provetta della microcentrifuga nel mortaio. 9 Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido al mortaio 10 e macinare accuratamente il tessuto con il pestello 11 fino a completa polverizzazione. 12 Utilizzare la spatola sottile per raschiare e trasferire 13 il tessuto polverizzato nella provetta della microcentrifuga.
14 Una volta trasferito tutto il tessuto, 15 aggiungere 500 microlitri di soluzione di isolamento dell'RNA al tubo 16 e sonicare per 30 secondi utilizzando un motore a pestello a pellet. 17 Quindi, utilizzare una siringa per pipettare su e giù 10 volte 18 per pulire ulteriormente il tessuto, 19 assicurandosi che non siano visibili particelle solide. 20 Aggiungere 250 microlitri di cloroformio e agitare di tanto in tanto 21 durante un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.
22 Centrifugare i campioni a 21.000 G per 20 minuti 23 a quattro gradi Celsius. 24 Trasferire lo strato acquoso superiore in una nuova provetta 25 e aggiungere una quantità equivalente di etanolo al 70%. 26 Trasferire 500 microlitri di lisato 27 in una colonna di legatura.
28 Centrifugare a 18.000 g per 60 secondi 29 ed eliminare il filtrato. 30 Per la trascrizione inversa, aggiungere 0,5 a un microgrammo 31 di RNA diluito in acqua trattata con DEPC a una striscia di provette PCR. 32 Quindi diluire il CDNA a 250 nanogrammi per microlitro 33 utilizzando acqua trattata con DEPC e impostare la PCR quantitativa.
34 I livelli di espressione dei geni marcatori coinvolti 35 nella mediazione della funzione di scBAT erano relativamente simili 36 tra scBAT e pipistrello interscapolare.
