这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的NIDDK的支持，奖励编号为R01DK116899，USDA / ARS的奖励编号为3092-51000-064-000D，以及贝勒医学院心血管研究所的试点奖。流程图是使用 BioRender 制作的。

动物程序已获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所有程序均在3周龄和3个月大的C57BL / 6J雄性小鼠上进行。在解剖之前，所有小鼠都使用批准的啮齿动物二氧化碳安乐死程序进行安乐死。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表。
1. scBAT的解剖
<ol><li>将小鼠尸体放在工作台上，用70%乙醇清洁手术剪刀和超细尖镊子。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹颈，以润湿皮毛并最大限度地减少毛皮污染。</li>
	<li>沿着锁骨做一个约 1.5 厘米的双侧切口。</li>
	<li>从前一个切口的末端，向耳朵纵向切割，长约1厘米。这将在颈部周围形成一个方形的U形切口（图1A，B）。 注意：scBAT位于颈部的中间层。在此步骤中，由皮肤、皮下脂肪组织和唾液腺组成的表层暴露在外。中间层与scBAT一起包含颈静脉和颈部肌肉。颈部深层，包含颈部深部 BAT 以及动脉和颈静脉，通过去除骨骼肌暴露出来。</li>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜下，使暴露的颈部聚焦（图1C）。 注意：这个增加的步骤大大提高了组织收集的精度，这是必要的，因为scBAT的尺寸很小。</li>
	<li>用镊子将切开的皮肤部分完全暴露唾液腺。</li>
	<li>使用手术剪刀和镊子，断开连接唾液腺与锁骨周围组织以及彼此之间的组织。</li>
	<li>通过抬起唾液腺暴露scBAT库。沿颈外静脉寻找 BAT，并可能连接到唾液腺的下侧。通过其橙色来识别它，在周围组织中脱颖而出。</li>
	<li>用镊子握住目标脂肪组织，轻轻地将其从唾液腺中剥离。</li>
	<li>一旦与唾液腺分离，继续断开scBAT与颈外静脉和颈部肌肉组织的连接，直到颈部两侧的仓库可以全部切除。</li>
	<li>在解剖显微镜下检查每个解剖的scBAT样品（图1D，E），使用镊子去除任何残留的结缔组织。</li>
	<li>将每个样品放入含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS） 的玻璃闪烁瓶中，然后从显微镜下取出小鼠。</li>
</ol>2. scBAT的加工和苏木精和伊红（H&E）染色 （ 如图2A所示）
<ol><li>用10mL冷的4%多聚甲醛（PFA）代替PBS（步骤1.12），并将小瓶放在螺纹器上，在4°C下摇动过夜以固定scBAT。 注意：当需要进一步处理免疫组化分析时，灌注固定可用于出生后，特别是成年小鼠。</li>
	<li>第二天，用无菌移液管从小瓶中取出PFA溶液，并用10-15mLPBS代替。将小瓶放在螺纹器上，在室温下摇晃30分钟。用0.85%盐水溶液代替PBS，并在室温下继续摇动30分钟。 注意：盐水溶液在DEPC处理的水（不含RNase）中为0.85%盐水（NaCl） w / v。PBS可以代替本步骤和后续步骤中的盐水溶液。</li>
	<li>用移液管除去 0.85% 生理盐水，并向小瓶中加入 10 mL 70% 乙醇/0.85% 生理盐水溶液。将小瓶存放在4°C冰箱中过夜或直到准备好嵌入石蜡。 注意：如果没有 0.85% 盐水，则可以使用 PBS。scBAT应尽快处理，以便于切片和更好地保存组织形态。</li>
	<li>在石蜡包埋之前，通过一系列乙醇交换使scBAT脱水，以去除组织中的水分。<ol><li>首先，用移液管从小瓶中除去70%乙醇/ 0.85%盐水，并加入10-15mL95%脱水酒精，在室温下在导向器上摇晃小瓶1小时。重复此步骤一次。 注意：乙醇可用于代替脱水剂酒精溶液。</li>
		<li>接下来，用10-15mL的100%脱水酒精代替95%脱水酒精，并继续在螺纹上摇摆1小时。重新装满新的 100% 脱水酒精并继续摇晃数小时或过夜，具体取决于小瓶中 scBAT 的数量。</li>
	</ol></li>
	<li>要清除scBAT进行嵌入，请向小瓶中加入10mL甲苯，并继续在导杆上摇摆，直到scBAT透明，大约6-8小时。 注意：达到令人满意的清算所需的时间取决于 scBAT 的大小。建议在早上立即开始清理，以便在下午进行渗透和嵌入。</li>
	<li>要将 scBAT 包埋在石蜡中，请除去甲苯并向小瓶中加入 10 mL 熔化的浸润石蜡。将小瓶置于65°C的烤箱中1小时。用新蜡重复此步骤。 注意： 在开始嵌入之前，开始在烤箱中熔化蜡颗粒过夜，以确保蜡是完全液态的。</li>
	<li>用嵌入石蜡代替渗透石蜡，并将小瓶置于相同温度下1小时。重复此步骤一次。 注意：渗透阶段可以中断并在以后继续。从烤箱中取出小瓶并将其存放在室温下，直到准备好继续。</li>
	<li>首先将组织放入组织包埋模具中，将熔化的包埋蜡添加到模具中，然后在立体显微镜下重新定向组织。然后，将包埋盒放在蜡的顶部，并继续将包埋蜡倒在其顶部，直到它装满并将包埋盖固定在蜡块上。将块转移到4°C冰箱过夜，让蜡变硬并收缩，然后再取出金属模具。</li>
	<li>用切片机将scBAT切片至厚度为5-6μm18，每个显微镜载玻片三至四个切片，并置于~42°C的温石蜡切片浮浮浴中，以使组织切片平滑。</li>
	<li>将部分转移到载玻片上，并将载玻片直立放在漂浮浴上，让水从载玻片上滴落。</li>
	<li>将载玻片转移到不锈钢染色架上，然后将载玻片放在载玻片干燥台上晾干过夜。 注意：在进行进一步加工之前，石蜡载玻片可以在室温下长期储存。</li>
	<li>进行 H&E 染色19.首先，将载玻片放入染色架中，然后将载玻片放入装有二甲苯的染色罐中40秒。重复此步骤一次。 注意： 如果石蜡在两个阶段后仍然可见，请等到它完全溶解后再继续。</li>
	<li>要使组织再水化，请将载玻片架放入装有100%脱水酒精的染色罐中两个20秒阶段，然后在95%脱水酒精中进行15秒阶段，最后在ddH2O中冲洗15秒。</li>
	<li>将载玻片置于装有苏木精溶液的染色皿中75秒以达到核染色，然后在用ddH2O染色皿中冲洗载玻片45秒。 注意： 时间可以根据所需的污渍颜色进行调整。</li>
	<li>通过将载玻片浸入装有HCl-乙醇溶液的染色皿中15秒来区分染色，然后将载玻片转移到另一个ddH2O冲洗15秒。 注：HCl-乙醇溶液根据已发表的方法19制备。</li>
	<li>对于细胞质染色，将载玻片置于曙红Y复染溶液中15秒。</li>
	<li>通过在三个连续的 95% 脱水酒精溶液阶段中将载玻片浸泡 15 秒来脱水组织，然后进行两个连续的 100% 脱水酒精浴 - 第一个 15 秒，第二个 45 秒 - 完成脱水。</li>
	<li>最后，将载玻片转移到二甲苯浴中45秒，以使组织重新适应有机溶剂。完成此步骤后，染色完成;从溶液中取出组织。</li>
	<li>将安装介质涂在每张载玻片上，并将其盖在化学通风橱内。成像前晾干过夜。成像结果如 图2B所示。</li>
</ol>3. scBAT的基因表达分析
<ol><li>组织收集（研磨）<ol><li>解剖scBAT后，立即将组织放入微量离心管中，用无菌针头在管顶部戳一个孔，并在液氮中快速冷冻。 注意： 图3A说明了此处概述的协议的主要步骤。在将管子放入液氮之前，在管子顶部戳一个孔，可以防止管子因压力突然变化而爆裂。</li>
		<li>用液氮填充塑料烧杯，然后留下杵和薄刮刀浸泡。 注意：在整个过程中，重要的是要保持所有工具和组织样品的温度尽可能低，接近液氮的温度，以防止组织解冻。解冻的脂肪组织具有很强的粘附性，使粉末化更具挑战性。仅在使用前立即从液氮浴中取出工具和样品。</li>
		<li>一次取一个速冻组织样品，并将其从微量离心管倒入研钵中。</li>
		<li>在研钵中加入少量液氮，然后用研杵研磨冷冻组织，直至完全粉碎。 注意：如果组织在任何时候开始变软或变粘，则说明它正在解冻;将更多的液氮倒入研钵中。</li>
		<li>用薄刮刀小心地刮擦粉碎的组织并将其转移回微量离心管中。在刮擦的同时将液氮倒入研钵中，以收集剩余的组织碎片，然后用刮刀转移。重复转移步骤，直到从研钵中取出所有组织。</li>
		<li>在倾倒下一个样品进行研磨之前，用轻型纸巾擦拭器和 70% 乙醇清洁砂浆。将粉末组织长期储存在-80°C冰箱中。</li>
	</ol></li>
	<li>总RNA分离<ol><li>制备<ol><li>用 70% 乙醇和表面去污剂清洁工作台、移液器、吸头支架和试管架，以去除 RNase。</li>
			<li>运行离心机达到4°C。</li>
			<li>将洗脱液加热至70°C。</li>
			<li>通过将 5 μL 复溶的 DNase I 与每个样品的 75 μL DNase 稀释溶液混合来稀释 DNase I。将 DNase I 溶液放在冰上直至使用。</li>
		</ol></li>
		<li>程序<ol><li>对于每个样品，标记两个微量离心管、两个色谱柱保持管（两个无盖刻度微量离心管）和一个结合迷你柱。</li>
			<li>向每个样品中加入 500 μL RNA 分离溶液，并使用沉淀杵电机超声处理 30 秒。</li>
			<li>为每个样品取一个注射器，上下移液 10 次以进一步裂解组织。确保注射后看不到固体。</li>
			<li>加入 250 μL 氯仿并偶尔涡旋，同时等待 5 分钟，使样品在室温下孵育。</li>
			<li>在4°C下以21,000× g 离心20分钟。</li>
			<li>将顶部水性部分转移到新的微量离心管中，并加入等量的70%乙醇（~500μL）。 注意：顶部水性部分应该是透明的，底部应该是红色RNA分离溶液，两层之间应该是一些不需要的固体。</li>
			<li>将 500 μL 新裂解物转移到结合柱中。以18,000× g 离心60秒，然后弃去滤液。</li>
			<li>对剩余的裂解物重复上一步，将所有RNA放入结合柱中。</li>
			<li>向结合柱中加入700μL低严格洗涤液，离心30秒，弃去滤液。</li>
			<li>向每个结合柱中加入 80 μL 稀释的 DNase I。在室温下孵育15分钟。</li>
			<li>加入 700 μL 高严格洗涤液，离心 30 秒，弃去滤液。</li>
			<li>加入 700 μL 低严格洗涤液，离心 60 秒，弃去滤液。</li>
			<li>将结合柱移入第2个 新的无盖柱保持管中，并离心2分钟，以确保所有液体都从结合柱中除去。</li>
			<li>将结合柱移至新的微量离心管中，并加入 30 μL 温热的洗脱溶液。在室温下孵育 1 分钟。</li>
			<li>离心2分钟，在微量离心管底部收集洗脱的RNA。</li>
			<li>使用分光光度计测量总RNA浓度。 注意：如果总RNA纯度较低，则由260/280值低于2.0或260/230值低于1.8表示，则在步骤3.2.2.12.之后，样品可以再次用低严格洗涤液洗涤，然后用80%乙醇洗涤，然后继续步骤3.2.2.13。</li>
			<li>将RNA储存在-80°C冰箱中。</li>
		</ol></li>
		<li>逆转录 （RT）<ol><li>在PCR管条中，将0.5-1μg在DEPC处理的水中稀释的总RNA加入到不同的孔中，每个RNA样品总共8μL。 注意：用于逆转录的RNA量可以根据制造商的说明放大或缩小。</li>
			<li>向PCR管中的每个样品中加入1μL寡核苷酸dT和1μLdNTP。确保每个样品的总体积为 10 μL。</li>
			<li>将PCR管条置于热循环仪中，并将其设置为65°C5分钟，然后无限期地设置4°C。</li>
			<li>在65°C下5分钟后，取出PCR管条并将管放在冰上至少2分钟。在冰上孵育后，向每个样品中加入五种试剂：4 μL 5x 第一链缓冲液、2 μL 25 mM MgCl2、2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶。确保每个样品的总体积现在为 20 μL。</li>
			<li>将PCR管条放回热循环仪中，并将程序设置为50°C50分钟，然后85°C5分钟，然后无限期地4°C。</li>
			<li>程序达到4°C后，取出试纸条并加入1μL核糖核酸酶H（RNase H）。 注意：RNase H用于去除RT反应中任何剩余的RNA模板;通过此步骤，所需的RNA应该已经转化为cDNA。</li>
			<li>将条带放回热循环仪中，在37°C下运行20分钟，然后无限期地在4°C下运行。</li>
			<li>逆转录完成;使用分光光度计测量cDNA浓度。</li>
			<li>将 cDNA 稀释至 250 ng/μL;将cDNA储存在-80°C或-20°C冰箱中。</li>
		</ol></li>
		<li>定量PCR（qPCR）<ol><li>制作一个电子表格，以组织每个引物和样品在 96 孔 qPCR 板上的位置。 注意：其中一个引物需要是参考基因，以使所有其他目标基因（如 36B4）的表达正常化。</li>
			<li>为每个“引物+样品”组合制作引物预混液。向每个qPCR反应孔中加入3 μL分子生物学级水、5 μL qPCR酶预混液、0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物，每次反应加起来为9 μL。每个反应加入 1 μL cDNA，使每个反应孔总共 10 μL。 注意：标准是每个“引物+样品”组合有三个技术重复，因此每个预混液应为上述数量的 4 倍。</li>
			<li>向每个引物预混液中加入 1 μL cDNA。如果每个预混液为 4 倍，则将每个样品 cDNA 的 4 μL 移液到它们自己标记的试管中。</li>
			<li>最后，将每种反应混合物的 10 μL 移液到电子表格确定的位置的 96 孔 qPCR 板中。</li>
			<li>用厚厚的粘性密封板密封板，然后在20°C下将96孔板在450× g 离心2分钟。 注意： 至关重要的是，板必须完全密封，以避免样品在热循环过程中蒸发。使用轻型纸巾擦拭器将密封件向下压在板上，尤其是边缘。</li>
			<li>在实时荧光定量PCR仪器中运行板。根据制造商的说明对PCR反应进行编程：在50°C下2分钟，然后在95°C下再2分钟，最后在95°C下进行40个循环，在95°C下进行15秒，在60°C下进行30秒。 qPCR基因表达分析的结果如 图3B所示。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

小鼠 scBAT 的形态学和分子学特征

<ol>
	<li>Boutari, C., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+2022+update+on+the+epidemiology+of+obesity+and+a+call+to+action:+as+its+twin+COVID-19+pandemic+appears+to+be+receding,+the+obesity+and+dysmetabolism+pandemic+continues+to+rage+on.">A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on.</a> Metabolism. 133, 155217 (2022).</li><li>Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+obesity+and+severe+obesity+among+adults:+United+States,+2017-2018.">Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018.</a> NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).</li><li>Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+origins+of+adipose+tissue.">The developmental origins of adipose tissue.</a> Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).</li><li>Maliszewska, K., Kretowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+and+its+role+in+insulin+and+glucose+homeostasis.">Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans.">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li><li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men.">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li><li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults.">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+localization,+gene+expression+profiling+and+functional+characterization+of+adult+human+neck+brown+fat.">Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat.</a> Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).</li><li>Leitner, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+human+brown+adipose+tissue+in+lean+and+obese+young+men.">Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).</li><li>Mo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+supraclavicular+brown+adipose+tissue+in+mice.">Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice.</a> JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Environmental+Temperature+and+High-Fat+Diet-Induced+Changes+in+Mouse+Supraclavicular+Brown+Adipose+Tissue.">Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue.</a> Cells. 10 (6), 1370 (2021).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis.">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stringent+validation+of+mouse+adipose+tissue+identity+markers.">A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation.">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification.">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796 (2017).</li><li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).</li></ol>

作者没有需要披露的利益冲突。

在该方案中，我们详细介绍了用于H&E和基因表达分析的解剖和处理scBAT的程序。由于scBAT位于颈部的中间层，并位于大静脉中，因此该库的分离需要精确的技术。具体来说，为了获得仓库的清晰视图，我们建议在颈部打开后将小鼠置于解剖显微镜下。使用一对超细尖镊子从唾液腺和周围静脉剥离 scBAT，应注意避免刺穿静脉。出血过多会使 scBAT 更难定位。为了处理用于 H&E 染色的 scBAT，我们调整了已...

肥胖症在美国和全球的患病率不断上升，引发了人们对了解其病因和确定潜在治疗方法的极大兴趣1,2。脂肪组织在新陈代谢中起着至关重要的作用，脂肪组织的失调会导致肥胖的发展。一般来说，脂肪组织有两种类型，白色和棕色脂肪组织。白色脂肪组织 （WAT） 可以储存化学能并分泌内分泌因子，而棕色脂肪组织 （BAT） 可以利用化学能产生热量并在寒冷中保持体温 3,4。由于这种独特的能力，BAT 的激活还可以增加能量消耗并提高胰岛素敏感性5。
BAT 通过非颤抖产热发挥其功能，该过程由解偶联蛋白 1 （UCP1） 介导6。哺乳动物，包括小鼠和人类，拥有不同数量的BAT。BAT的经典观点是，这些脂肪组织在小鼠和婴儿中比在成年人类中更丰富。iBAT位于肩胛骨之间的上背侧，是小鼠中研究最多的BAT库。通过应用放射性同位素成像和活检测试，最近的研究在成年人类中发现了几个BAT库。其中一些，包括在颈部深部和锁骨上区域发现的仓库，以前没有在小鼠或其他模式动物中鉴定出来7,8,9,10,11。在这些 BAT 仓库中，scBAT 是成年人中最常见的仓库。为了更好地了解这些新发现的BAT库在人类中的起源和分子贡献，必须确定小鼠体内的等效库，这些库允许遗传和分子操作来追踪和测试这些库的功能作用。因此，我们和其他人在小鼠的不同解剖位置发现了一些以前未知的 BAT 库，包括 scBAT12,13、胸血管周围 BAT14,15、肾周 BAT16 和主动脉周围 BAT17。小鼠scBAT在解剖学上与人类scBAT相似，形态学上与经典iBAT相似，表达高水平的UCP112。
与易于解剖的小鼠 iBAT 不同，scBAT 位于小鼠颈部的中间层、唾液腺下方和颈外静脉。分离该库进行组织学和分子分析可能具有挑战性。在这里，我们详细描述了从出生后和成年小鼠中解剖scBAT并处理该库进行组织学和基因表达分析的过程。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>8201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>8101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MLL9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Binding Mini Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum High Stringency Wash</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Low Stringency Wash</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base Molds (for embedding)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2&#34;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1840148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12011319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>383760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>83104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM 9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase Dilution Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM 400 embedding medium paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (0.5% w/v)</td>
			<td>RICCA</td>
			<td>2858-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formula R Infiltration medium paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td>
			<td>Bio Express</td>
			<td>S-3200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill #3 Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (for HCL-Ethanol)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A142212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP VI Embedding Cassettes</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39LC-550-5-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec&#39;s Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.7 mL</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; Seals (adhseive seals)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar Coors Tek</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>60310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (for 0.85% saline)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop Technologies</td>
			<td>ND-1000 UV/Vis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>14792V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tube Strip</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>76318-802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle by Coors Tek</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>60311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Pellet Motor</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Model 19 Vacuum Oven&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAT# 51221162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: 36B4&#160; (forward) 10 &#956;M 
			5&#39; TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: 36B4 (reverse) 10 &#956;M 
			5&#39; GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Fabp4 (forward) 10 &#956;M 
			5&#8217; ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Fabp4 (reverse) 10 &#956;M 
			5&#8217; CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Glut 4 (forward primer) 10 &#956;M 
			5&#8217; CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Glut 4 (reverse) 10 &#956;M 
			5&#8217; GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: PPARg (forward) 10 &#956;M 
			5&#8217; AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: PPARg (reserve) 10 &#956;M 
			5&#8217; AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Ppargc1a (reverse) 10 &#956;M 
			5&#39; ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Ppargc1a(forward) 10 &#956;M 
			5&#39; ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Ucp1 (forward) 10 &#956;M 
			5&#8217; AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: Ucp1 (reverse) 10 &#956;M 
			5&#8217; ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chen lab Oligo database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation solution (PureZol)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away (surface decontaminant)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1437535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor (RNase Out)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial (glass)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide drying bench&#160;</td>
			<td>Electrothermal (Cole-Parmer)</td>
			<td>MH6616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless staining rack</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70312-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (for embedding)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugical scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>43-1-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine point Straight Dissecting Forceps</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>82027-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8&#34;, 1 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>100281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>SKU: 62540-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T324-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>414004-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, histological processing, and gene expression analysis of murine supraclavicular brown adipose tissue

棕色脂肪组织（BAT）介导的产热在代谢的调节中起着重要作用，其形态和功能在小鼠和人类中受到环境刺激的影响很大。目前，小鼠肩胛间 BAT （iBAT） 位于小鼠上背侧的两个肩胛骨之间，是研究实验室用于研究 BAT 功能的主要 BAT 库。最近，在小鼠中发现了一些以前未知的BAT库，包括一种类似于人类锁骨上棕色脂肪组织的细胞库。与 iBAT 不同，小鼠锁骨上棕色脂肪组织 （scBAT） 位于颈部的中间层，因此不容易进入。
为了促进对新鉴定的小鼠scBAT的研究，本文介绍的方案详细说明了从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的步骤。由于scBAT的尺寸相对于其他脂肪库较小，因此专门针对处理scBAT的程序进行了修改和优化。这些改进包括在组织采集过程中使用解剖显微镜来提高冷冻scBAT样品的精密度和均质化程度，从而提高后续qPCR分析的效率。通过这些优化，可以在小鼠中确定scBAT的鉴定、形态学外观和分子特征。

The increasing prevalence of obesity in the U.S. and worldwide has ignited great interest in understanding its etiology and identifying potential treatments1,2. Adipose tissue plays a vital role in metabolism, and dysregulation of the adipose tissue can lead to the development of obesity. Generally, there are two types of adipose tissues, white and brown adipose tissue. While white adipose tissue (WAT) can store chemical energy and secrete endocrine factors, brown adipose tissue (BAT) can use chemical energy to generate heat and maintain body temperature in the cold3,4. Because of this unique ability, activation of BAT can also increase energy expenditure and improve insulin sensitivity5.
BAT exerts its function through non-shivering thermogenesis, a process mediated by uncoupling protein 1 (UCP1)6. Mammals, including mice and humans, possess varying amounts of BAT. The classical view of BAT is that these adipose tissues are more abundant in mice and infants than in adult humans. iBAT, located in the upper dorsal flank between the scapulae, is the most studied BAT depot in mice. By applying radioisotope imaging and biopsy tests, recent studies identified several BAT depots in adult humans. Some of them, including the depots found in the deep neck and supraclavicular region, had not previously been identified in mice or other model animals7,8,9,10,11. Among these BAT depots, the scBAT is the most frequently seen depot in adult humans. To better understand the origin and molecular contribution of these newly found BAT depots in humans, it is essential to identify equivalent depots in mice that allow genetic and molecular manipulations to trace and test the functional role of these depots. Thus, we and others identified a few previously unknown BAT depots in different anatomical locations in mice, including scBAT12,13, thoracic perivascular BAT14,15, perirenal BAT16, and periaortic BAT17. Mouse scBAT anatomically resembles human scBAT and morphologically resembles classical iBAT, expressing high levels of UCP112.
Unlike mouse iBAT, which can be readily dissected, scBAT is situated in the intermediate layer of the mouse neck, beneath the salivary glands and along the external jugular vein. Isolation of this depot for histological and molecular analyses can be challenging. Here, we describe in detail the procedure for dissecting scBAT from postnatal and adult mice and processing this depot for histology and gene expression analysis.

作者聚焦：优化锁骨上棕色脂肪组织提取以进行遗传分析

小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

1 Our lab is focused on establishing<v>2 supraclavicular brown adipose tissue 3 or SCBAT as a valuable depot 4 for brown fat analysis due to its anatomical similarities 5 to human brown adipose tissue. 6 This protocol is aimed at increasing accessibility<v>7 of SCBAT research. 8 This depot may be intimidating due to its small size 9 and proximity to large veins in the neck, 10 so it is imperative to provide 11 a simple method of extracting and processing SCBAT.12 Our methodology stands out<v>13 firstly by the use of a dissecting microscope 14 when extracting SCBAT. 15 This increases the precision 16 and extracting efficiency, 17 which are both critical when working 18 with such a small tissue depot. 19 Secondly, we homogenized the frozen SCBAT samples 20 before doing gene expression analysis 21 to increase the RNA yield to compensate 22 for such a low quantity of available tissue.23 We are currently focus on defining<v>24 the genetic lining edge of SCBAT, 25 identifying the transfiguration networks 26 regulating its development, 27 and developing a cerebral model 28 for exploring its physiological function in humans.

与位于两个肩胛骨之间的背部皮下层的 iBAT 不同，scBAT 位于颈部的中间层，在骨骼肌和唾液腺层之间延伸深处，因为它沿着颈外静脉生长（图 1A）。剖析 scBAT 并不像 iBAT 那么简单。在这里，我们提供了一个详细的程序，包括从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的关键步骤（图1B，C）。使用提供的方案打开颈部后，?...

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在这里，我们提供了一个实用的程序，用于解剖和执行小鼠锁骨上棕色脂肪组织的组织学和基因表达分析。

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

977 次观看.  Baylor College of Medicine. 1 我们的实验室专注于建立2 锁骨上棕色脂肪组织 3 或 SCBAT 作为棕色脂肪分析的有价值的仓库 4，因为它的解剖学相似性 5 与人类棕色脂肪组织相似。6 该协议旨在提高SCBAT 研究的可及性 7。8 这个仓库可能令人生畏，因为它的尺寸小 9 并且靠近颈部的大静脉， 10 因此，必须提供 11 一种提取和处理 SCBAT 的简单方法。12 我们的方法脱颖而...