Questo protocollo fornisce una potente alternativa per lo screening dell'attività della nucleasi come biomarcatore della malattia, con una metodologia facile da implementare anche per i ricercatori che non sono così specializzati nelle sonde di acido nucleico. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di selezionare sonde di acido nucleico in grado di identificare attività nucleasi conosciute e sconosciute, sfruttando l'interazione dinamica sonda-nucleasi. Altri vantaggi di questa metodologia sono la sua flessibilità, elevata riproducibilità e facilità d'uso.
La dimostrazione sarà eseguita da Khadija, studentessa di Master, e Baris, un postdoc del nostro laboratorio. Quando si progetta una libreria oligonucleotide, includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina, guanina, citosina e tiamina o uracile. Per preparare le sonde oligonucleotidi, spingi giù le sonde oligonucleotidiche liofilizzate e diluire ogni sonda nel tampone Tris-EDTA a una concentrazione di 500 picomolare per microlitro per prevenire la degradazione della nucleasi.
Per la coltura batterica su supporto solido, arrotolare una singola perla di vetro poroso dalla conservazione criogenica direttamente su un piatto di coltura contenente TSA integrato con sangue di pecora defibrinato per striare singole colonie batteriche. Quindi posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per la coltura batterica in mezzo liquido, trasferire una singola colonia da una coltura media solida a 50 millilitri di TSB per l'incubazione a 37 gradi Celsius per 24 ore a 200 rotazioni al minuto.
Il giorno dopo, diluire la coltura a un rapporto uno a 500 in TSB fresco e incubare i batteri per altre 24 ore a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto in un incubatore di scuotimenti. Per impostare un saggio di attività della nucleasi, prima preripidi un fluorometro a 37 gradi Celsius e aggiungi con cura 96 microlitri di TSB sterile o supernatante da una coltura media liquida Salmonella o E.Coli a un tubo di microcentrifugo privo di nucleasi da 1,5 millilitri per sonda. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di lavoro a sonda a ciascun tubo e utilizzare una pipetta per mescolare accuratamente ogni contenuto del tubo fino a ottenere soluzioni omogenee, facendo attenzione ad evitare bolle.
Successivamente, caricare con cura 95 microlitri di ogni soluzione vicino alla parete di singoli pozzi di un fondo nero, piastra di pozzo 96 non trattata, facendo attenzione ad evitare bolle. Una volta aggiunte tutte le soluzioni, coprire la piastra e ispezionare visivamente il coperchio alla ricerca di marcature a penna o polvere che possono introdurre artefatti di misurazione. Per impostare il software per la misurazione dell'attività nucleasi, aprire un programma software di acquisizione adatto.
Selezionare Leggi ora dalla finestra Gestione attività e quindi Nuovo per creare il protocollo di misurazione cinetica. Fare clic su Imposta temperatura per selezionare 37 gradi Celsius e confermare e salvare le impostazioni facendo clic su OK. Fate clic su Inizia cinetica (Start Kinetics). Nella finestra popup selezionare due ore nella casella di input Tempo di esecuzione e due minuti nella casella di input intervallo prima di fare clic su OK per confermare e salvare le impostazioni.
Fare clic su Leggi. Nella finestra popup, selezionate Intensità fluorescenza come metodo di rilevamento, Cinetica endpoint come tipo di lettura e filtri come tipo di ottica. Quindi fare clic su OK. Nella finestra popup selezionare Verde dal set di filtri e fare clic su OK. Nella finestra Procedura selezionare Usa coperchio e fare clic su Convalida.
Verrà visualizzata una finestra popup che conferma che il protocollo creato è valido. Nel menu Protocollo selezionare Procedura. Nella finestra Procedura definire i pozzi da misurare e immettere il nome dell'esperimento nella casella di input Nome file.
Quindi caricare la piastra nel lettore di lastre, facendo attenzione che la piastra sia nell'orientamento giusto e fare clic sul pulsante Leggi nuovo per iniziare l'acquisizione. Per l'analisi dei dati, aprire i dati nel software di analisi appropriato e selezionare uno dei pozzi misurati nella piastra di una finestra. Fate clic su Seleziona pozzi (Select Wells) e includete tutti i pozzi misurati nella finestra di dialogo Selezione pozzi (Well Selection Dialog) prima di fare clic su OK. Quindi selezionare Dati nella lastra una finestra per visualizzare i risultati tabulati e fare clic su QuickExport per esportare i dati in un foglio di calcolo.
In un foglio di calcolo etichettare le colonne di dati in base alle esigenze per ogni campione e sonda e tracciare le unità di fluorescenza relative rispetto al tempo in cui i dati generano grafici cinetici. In questo esperimento rappresentativo, dopo il primo ciclo di screening, i supernanti della coltura di Salmonella hanno riportato una chiara preferenza per le sonde di RNA rispetto alle sonde del DNA. Sulla base dell'identificazione dell'RNA come tipo di acido nucleico preferito dalle nucleasi della Salmonella, una nuova libreria solo RNA è progettata per essere utilizzata nel secondo ciclo di screening.
Al contrario, E.Coli nei controlli dei mezzi di coltura dimostrò una capacità molto limitata di degradare le sonde di RNA. Dopo un secondo ciclo di screening utilizzando nucleotidi modificati chimicamente volti ad aumentare la specificità delle sonde di RNA, l'RNA pirimidina 2'O-metile e l'RNA purine 2'O-metile potrebbero essere identificati sulla base delle loro modifiche chimiche come il comportamento cinetico più performante rispetto all'RNA pirimidina 2'fluoro e RNA purine 2'fluoro rispettivamente. Questi risultati suggeriscono che la Salmonella ha un'importante attività di RNAse con preferenza chimica differenziale del substrato che può essere utilizzata per selezionare sonde in grado di riconoscere specificamente questo batterio.
Questa procedura consente la selezione di sonde in grado di identificare le attività nucleasi associate a condizioni di malattia, come il cancro o l'infezione batterica, consentendo lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici clinici.
