Per iniziare, prendi gli occhi di maiale posti in un becher da un litro. Tenere un bulbo oculare con una pinzetta e rimuovere i tessuti oculari in eccesso con le forbici in una piastra di Petri sterile. Per la ferita dell'epitelio, tenere il bulbo oculare utilizzando salviette sterilizzate prive di lanugine e segnare il centro della cornea con una trefina di sei millimetri.
Quindi, usando un piccolo bisturi o una lama di rasoio morbida smussata agli angoli, raschiare delicatamente le cellule epiteliali all'interno del cerchio segnato dal trefino. Rimuovere tutti i detriti cellulari assicurandosi che la membrana basale rimanga intatta. Successivamente, pulire l'area della ferita con tamponi di cotone.
Usando un bisturi e delle forbici, sezionare il bulbo oculare tagliando lungo i bordi corneo-sclerali. Quindi sciacquare le cornee in un becher sterilizzato da 500 millilitri contenente PBS. Quindi, posizionare le cornee asportate capovolte in uno stampo sterile.
Riempire la cavità corneale endoteliale con un mezzo essenziale minimo, o MEM, contenente l'1% di agarosio mantenuto a 48 gradi Celsius. Ora, capovolgi e trasferisci le cornee su un piatto da 35 millimetri. Aggiungere due millilitri di MEM, con o senza l'agente di prova, sulla superficie della cornea centrale, assicurandosi che la regione della congiuntiva limbare sia coperta lasciando l'epitelio esposto all'aria.
Quindi posizionare i piatti di coltura in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. A 40 ore dalla ferita, colorare le cornee coltivate ferite con la soluzione colorante Richardson. Lavare le cornee colorate con PBS prima di fotografarle.
Quindi usa il trephine della stessa dimensione per contrassegnare la ferita originale e, usando un piccolo bisturi, raschia le cellule epiteliali all'interno dei cerchi contrassegnati. Rimuovere le cellule raccolte e trasferirle in una provetta da centrifuga pre-raffreddata. L'area rimanente della ferita era significativamente più grande nelle cornee trattate con nepafenac 0,1% rispetto a quelle trattate con bromfenac 0,09% e ketorolac 0,45%Le cornee trattate con LL-37 a 0,2 e 0,5 microgrammi per millilitro hanno mostrato una guarigione della ferita significativamente accelerata in condizioni di glucosio elevato rispetto alle cornee non trattate.
