Comprendere l'efficacia dei farmaci nei modelli animali è costoso e laborioso. Il nostro protocollo che utilizza un modello di espianto tissutale ex vivo è significativamente inferiore sia in termini di costi che di personale scientifico richiesto per condurre lo studio. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di occhi suini, che hanno anatomia e fisiologia molto simili agli occhi umani rispetto ad altri piccoli modelli animali.
Quando testiamo i farmaci in vitro, potrebbero mostrare un'efficacia che potrebbe essere assente nei modelli animali o umani. I sistemi tissutali ex vivo sono il modo migliore per capire se i nostri sistemi in vitro possono essere tradotti o meno in sperimentazioni animali e umane. Il sistema corneale suino, sebbene meno laborioso, richiede competenze addestrabili per isolare, mantenere, infettare e trattare con i farmaci, in particolare il processo di isolamento della cornea dall'intero occhio suino è difficile da esprimere a parole, ma richiede una dimostrazione visiva.
Dopo aver ricevuto gli occhi suini da un fornitore adatto, conservare i tessuti sul ghiaccio fino alla lavorazione e indossare l'apposito dispositivo di protezione individuale. Disinfettare l'area di lavoro con etanolo al 70% e fissare una copertura del banco sullo spazio di lavoro. Quando l'area di lavoro è pronta, posizionare gli occhi su un pezzo di garza da 50 millimetri e utilizzare la garza per afferrare la sezione posteriore con una mano.
Usando un ago calibro 30, fai con attenzione una singola puntura approssimativamente al centro della superficie epiteliale dell'occhio, facendo attenzione a non danneggiare lo stroma, e usa una lama sterilizzata affilata per fare una piccola incisione sulla sclera a una distanza di un millimetro dalla cornea. Usando un'azione rotante rapida e liscia della mano e facendo attenzione che l'umore vitreo non perda, tagliare il bordo della cornea e tenere la cornea sul bordo cornea-sclera con una pinzetta piatta, utilizzare la lama per tagliare le restanti membrane di tethering. Quando ogni cornea è isolata, posizionare i tessuti rivolti verso l'alto in singoli pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente due millilitri di terreno corneale per pozzetti e aggiungere cinque microlitri di cinque volte 10 alla quinta unità di formazione della placca di 17 soluzioni di virus GFP al sito di detriti su ciascuna superficie corneale.
Quando tutte le cornee sono state raccolte, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius al 5% per 72 ore e spruzzare eventuali occhi aggiuntivi non utilizzati nell'esperimento con candeggina al 10% per il loro smaltimento sicuro in sacchetti a rischio biologico. Ogni giorno prima dell'aggiunta di farmaci, posizionare la piastra di cornee sotto uno stereomicroscopio e selezionare il filtro GFP e un tempo di esposizione di 500 microsecondi. Cattura le immagini al minimo ingrandimento prima di visualizzare le cornee con una serie di ingrandimenti crescenti fino a quando tutta la diffusione virale e la formazione di dendrite possono essere visualizzate chiaramente.
Quando tutte le cornee sono state immaginate, restituire la piastra all'incubatore di colture tissutali. Il giorno prima dell'infezione, lavare una coltura cellulare vera confluente due volte con 10 millilitri di PBS per lavaggio e trattare le cellule con un millilitro di 0,05% tripsina per pozzetto per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, utilizzare nove millilitri di mezzo intero per assicurarsi che le cellule si spostino completamente dalla superficie del pallone e trasferiscano la sospensione cellulare risultante in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Aggiungere 300 microlitri di cellule a ciascun pozzetti di una nuova piastra a sei pozzi, seguita dall'aggiunta di due millilitri di terreno a ciascun pozzettino, quindi posizionare la piastra nell'incubatore di colture cellulari durante la notte. La mattina dopo, per raccogliere il virus da ciascuna cornea per la quantificazione, immergere le punte sterili del batuffolo di cotone in 500 microlitri di mezzo privo di siero per tampone in più tubi di microcentrifuga in un armadietto di biosicurezza per almeno cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, posizionare con cura le colture di cornea suina infette nell'armadio.
Utilizzando i tamponi di cotone bagnati, fare tre giri in senso orario e tre giri in senso antiorario a cinque millimetri dal centro di ogni cornea suina infetta senza applicare una pressione eccessiva. Alla fine della serie di giri, ruotare ogni tampone nel suo tubo microcentrifugale riempito di siero medio cinque volte in senso orario e antiorario prima di tagliare i tamponi in modo che le punte si adattino a ciascun tubo con il coperchio chiuso. Quando tutte le cornee sono state tamponate, vortice i tubi ad alta velocità per un minuto.
Per quantificare la quantità di virus raccolto da ciascuna cornea, preparare una diluizione log10 di una volta del virus in mezzo privo di siero in tubi di microcentrifuga fino a raggiungere una diluizione di una volta 10 a otto negativi. Dopo aver aspirato il mezzo di crescita da ciascun pozzo di cellule, trasferire un millilitro di ciascuna diluizione virale a partire da una volta 10 ai tre negativi ai monostrati cellulari placcati e posizionare le cellule infette nell'incubatore di colture cellulari per due ore. Alla fine dell'incubazione, lavare delicatamente ogni pozzetti due volte con PBS prima di aggiungere due millilitri di mezzo carico di metilcellulosa a ciascun pozzetti per un'incubazione di 72 ore o fino a quando non si può osservare la formazione di placche.
Dopo l'osservazione della placca, aggiungere lentamente un millilitro di metanolo all'angolo di ciascun pozzetto per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aspirare lentamente il contenuto da ciascun pozzetti senza disturbare il monostrato cellulare. Quindi, etichettare ogni pozzetto con un millilitro di soluzione di lavoro viola cristallino, facendo attenzione che tutte le cellule siano coperte per un'incubazione di 30 minuti protetta dalla luce.
Alla fine dell'incubazione, scartare la soluzione e asciugare i pozzezze a secco su un foglio di carta assorbente, quindi contare il numero di placche al pozzo di diluizione più alto per quantificare il contenuto totale del virus nella soluzione iniziale tre volte. Come osservato in questa analisi di imaging a fluorescenza stereoscopica, l'efficacia antivirale di BX795 è simile a quella del TFT nel controllo della diffusione virale, mentre le cornee trattate con veicolo dimostrano solo la diffusione del virus dalla zona centrale di infezione alla periferia entro sei giorni dall'inoculazione virale iniziale. Allo stesso modo, i tamponi oculari prelevati nei giorni due e quattro post-infezione mostrano una completa inibizione del virus nei campioni di controllo positivi e trattati con BX795, mentre un forte aumento del titolo del virus infettivo si osserva nei campioni di controllo negativi.
L'isolamento della cornea suina da tutto l'occhio suino è il passo più importante. I passaggi da 2.3 a 2.6 sono i più cruciali in questo processo. Il nostro modello può essere utilizzato per comprendere la diffusione dendritica del virus nelle cornee suini.
Questo metodo può essere esteso anche alle infezioni batteriche e fungine. Questo metodo ha aiutato a visualizzare la diffusione dendritica del virus nelle cornee al di fuori di un modello umano. Questo modello è utile per testare l'efficacia dei farmaci prima di passare a studi su animali e umani.
