Questo articolo descriveva un metodo semplice per saggiare le ferite in un sistema tridimensionale di coltura di organi multicellulare. Lo facciamo usando gli occhi di maiale, ma anche se non hai familiarità con gli occhi, puoi fare questo saggio. Come panoramica, abbiamo ricevuto occhi suini, tagliato i globi, fatto una ferita circolare nella cornea che passa attraverso l'epitelio e circa un terzo dello stroma.
Tagliamo la cornea, la montamo su una base di Agar, e mettiamo questo costrutto nell'incubatrice. Il tessuto riempirà creando una cicatrice nella cornea. Non è necessario aggiungere fattori di crescita, o anche siero.
Questo viene fatto su supporti senza siero. Sebbene questo venga eseguito nella cornea, può essere utilizzato come sistema modello per la guarigione fibrotica in generale. Poiché molte delle vie cellulari che vengono attivate durante le cicatrici sono simili tra i sistemi.
In un cappuccio di biosicurezza, utilizzare una lama chirurgica a bordo dritto per rimuovere il globo dal coperchio su un tagliere pulito con etanolo e rimuovere il tessuto adiposo in eccesso da ogni occhio. Tenendo il globo pulito posteriormente con le forcep immergere immediatamente l'occhio in PBS seguito da tre tuffo rapido in iodio al 10% e due rapide immersioni in PBS. Quindi avvolgere l'occhio circonferenzialmente con un tessuto da laboratorio pulito per avvolgere con sufficiente pressione per ottenere una superficie corneale tesa senza contattare la cornea.
Usando una trefina di sei millimetri, penetrare l'epitelio nello stroma anteriore al centro della cornea senza fare una ferita a pieno spessore attraverso l'intera cornea e ruotare la trefina di 180 gradi in senso orario e antiorario cinque volte mentre si applica la pressione della luce per approfondire la ferita. Quando la ferita è abbastanza profonda da consentire il sollevamento di un lembo tissutale con forcep, utilizzare una lama chirurgica per tagliare il lembo parallelo al globo continuando a sollevare la cornea anteriore entro il margine della ferita. Quando l'intero lembo è stato rimosso, una ferita circolare dovrebbe essere posizionata al centro della cornea.
Per raccogliere la cornea afferrare l'occhio con il tessuto da laboratorio e utilizzare una lama chirurgica per fare una piccola incisione a un millimetro di distanza dal bordo della cornea per includere il limbo e la raccolta dei tessuti. Usando piccole forbici affilate continua l'incisione in tutto il mondo mantenendo un margine millimetrico attraverso la cornea per mantenere il limbo in tatto. Quindi posizionare la cornea, lato ferita verso il basso, in un piatto da 60 millimetri o 100 millimetri contenente un millilitro di PBS.
Per montare la cornea, utilizzare due paia di forcep per tenere il lato epiteliale cornea verso l'alto per creare una tazza e utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per aggiungere una soluzione di agar riscaldata nella cornea fino a quando la tazza è piena. Dopo che l'agar si indurisce, posizionare con cura la cornea in un nuovo lato agar piastra di 60 millimetri verso il basso e coprire la piastra con un coperchio. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo integrato privo di siero a ogni piatto di cornee mantenendo le cornee in un'interfaccia aria-liquido al bordo limbale in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5% e bagnando le superfici corneali una volta al giorno con una goccia di mezzo integrato privo di siero dal mezzo condizionato nel piatto per mantenere i tessuti idratati.
Per il knockdown genico, mescolare cinque microlitri di piccolo interferente o siRNa con 50 microlitri di mezzo essenziale minimo siebro ridotto e due microlitri di reagente di trasfezione. Con 50 microlitri di mezzo siero ridotto per cornea. Dopo cinque minuti, mescolare le due miscele e aggiungere 200 microlitri di mezzo minimo siero ridotto a ciascuna miscela di siRNA.
Quindi pipettare le soluzioni di siRNA cadere saggiamente su ogni ferita. Quindi metti le cornee nell'incubatrice. Dopo tre ore, utilizzare il mezzo in ogni piatto per lavare il siRNA dalle superfici corneali e sostituire il mezzo condizionato in ogni piatto con mezzo fresco integrato senza siero più antibiotici.
Quindi riportare le colture corneali nell'incubatrice di coltura cellulare e incubare per due settimane. Sei ore dopo il mento, l'epitelio corneale è assente. Sei giorni dopo il mento, l'epitelio ricresce.
L'ammino macchia di fluorescenza con actina muscolare alfa liscia rivela un gradiente di miofibroblasti attivi lungo il margine della ferita dallo stroma anteriore a quello posteriore. La colorazione immuno-istochimica per l'actina muscolare alfa liscia rivela un drammatico aumento dell'espressione alfa liscia della proteina dell'actina muscolare nei feriti più il controllo delle cornee di siRNA. Rispetto alle cornee ferite trattate con siRNA di proteine non ferite e bersaglio.
Allo stesso modo, la fibronectina extra di dominio A è upregolata nelle cornee ferite trattate con siRNA rispetto alle cornee ferite trattate con siRNA non ferite e target. Dimostrando un knock down riuscito della proteina bersaglio. Inoltre, il trattamento delle cornee ferite con la tossina che prende di mira in modo non specifico la proteina bersaglio previene la rielezione e si traduce in morte cellulare qualitativa, una matrice disorganizzata e vacuoli stromali che suggeriscono che la tossina non promuove la guarigione alla concentrazione saggiata.
In conclusione, durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere la lama parallela al tessuto durante il taglio, in modo che non penetri nel globo. Diverse tecniche di wounding possono essere utilizzate con questo saggio, tra cui ustioni chimiche o raschiatura epiteliale. Può anche essere usato per test di tossicità del farmaco per determinare se l'epitelio guarisce e a quale velocità.
Questo è un sistema di modelli di coltura di organi ex vivo a risparmio di costi che può precedere i tuoi studi di guarigione delle ferite in vivo.
