Per isolare i mitocondri, posizionare il ratto decapitato anestetizzato in posizione prona sul ghiaccio. Dopo aver esposto il cuore, tagliare l'aorta a circa 4-6 millimetri sopra la radice aortica e sotto i punti di ramificazione carotidea. Incannulare l'aorta e perfondere il cuore con una soluzione di cardioplegia ghiacciata utilizzando una testina di pressione dipendente dalla gravità fino a quando le arterie coronarie non vengono ripulite dal sangue e l'organo appare sbiancato.
Sezionare gli atri, il tessuto valvolare cartilagineo e i tessuti adiposi per isolare il miocardio ventricolare. Tritare il tessuto con forbici chirurgiche affilate fino a quando i pezzi sono di circa un millimetro cubo. Trasferire il tessuto tritato nella provetta da centrifuga pre-raffreddata, etichettata con gli spin uno e due contenenti la soluzione di proteasi.
Aggiungere un tampone di isolamento ghiacciato a un volume finale di 25 millilitri. Utilizzando un omogeneizzatore di statore a rotore portatile motorizzato, disperdere il tessuto a 18.000 giri/min su ghiaccio per 20-25 secondi. Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 8.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante. E sciacquare delicatamente il pellet con cinque millilitri di tampone isolante per rimuovere la proteasi residua. Dopo aver eliminato il risciacquo, aggiungere un tampone di isolamento ghiacciato fino a un volume finale di 25 millilitri.
Quindi vortice per risospendere il pellet. Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto a 800 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Versare delicatamente il surnatante contenente mitocondri in un tubo da 50 millilitri pre-raffreddato etichettato.
Ora centrifugare il surnatante a 8.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e conservare i mitocondri contenenti pellet. Utilizzando un panno privo di lanugine, assorbire il surnatante in eccesso dalla parete interna del tubo senza disturbare il pellet e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Aggiungere 80 microlitri di tampone isolante ghiacciato sul fondo della provetta e sospendere delicatamente i mitocondri utilizzando una micropipetta. Una volta risospesi, trasferire i mitocondri in una provetta da microcentrifuga marcata pre-raffreddata. Determinare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il saggio delle proteine acide cinetiche del bisonte.
In una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata, diluire il brodo mitocondriale alla concentrazione di lavoro desiderata con un tampone di isolamento. Per testare la vitalità e la qualità degli isolati mitocondriali, caricare 2,3 millilitri di tampone respiratorio nelle camere dell'ossigrafo. Lasciare che il segnale di consumo di ossigeno si equilibri a 37 gradi Celsius per circa 10 minuti o fino a quando la velocità non è vicina allo zero.
Al momento dell'equilibratura, spingere verso il basso i tappi e aspirare il tampone in eccesso. Utilizzando una siringa Hamilton da 10 microlitri, aggiungere un millimolare di EGTA per chelare il calcio residuo nel tampone respiratorio sull'ossigrafo. Per alimentare la respirazione, aggiungere cinque millimolari di piruvato di sodio e un millimolare di al-malato nel tampone.
Quindi aggiungere un bolo di mitocondri diluiti e lasciare che la respirazione avvenga per cinque minuti. Al segno dei cinque minuti, aggiungere un bolo di 500 micromolari di ADP per avviare la respirazione allo stato tre. Per calcolare il rapporto di controllo respiratorio, dividere il tasso massimo di consumo di ossigeno durante lo stato tre per il tasso di consumo di ossigeno appena prima dell'aggiunta di ADP nello stato due.
Un rapido aumento del consumo di ossigeno è stato osservato immediatamente dopo l'aggiunta di ADP, indicando l'inizio della fosforilazione ossidativa nei mitocondri cardiaci isolati. I mitocondri cardiaci di cavie, ratti Sprague-Dawley e topi B con virus della leucemia Friend, hanno dimostrato elevati rapporti di controllo respiratorio, indicando una buona qualità dell'isolamento mitocondriale. Anche i mitocondri epatici e renali dei ratti Sprague-Dawley hanno mostrato rapporti di controllo respiratorio accettabili a sostegno del successo dell'isolamento.
Le cellule HEK293 hanno mostrato valori del rapporto di controllo respiratorio superiori alla soglia accettabile, confermando la qualità dell'isolamento mitocondriale da queste cellule.
